中国白兔白介素-10基因的克隆、表达及其多克隆抗体的制备

摘要

本文运用RT-PCR对用ConA刺激的中国白兔外周血淋巴细胞(PMBCr)进行了扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定,并与不同物种的IL-10基因进行了序列比较.结果该基因全长537bp,编码178个氨基酸,其中前18个氨基酸残基构成信号肽序列.与GenBank报道的欧洲兔IL-10基因相比,核苷酸的同源性为99.63％,氨基酸的同源性为99.44％,但与鼠、鸡、河豚和斑马鱼等不同物种IL-10相比差异较大.在推导的中国白兔IL-10氨基酸序列中,在100-102和134-136位存在2个潜在的N-联糖基化位点,同时存在6个Cys残基.将pTIL-10双酶切,回收目的基因片段克隆到pET28a中构建了重组质粒pETIL-10,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行了诱导.结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为23.4kDa的重组目的蛋白.经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的15.2％.将表达的蛋白割胶纯化后,制备了小鼠抗兔IL-10的多克隆抗体.