普鲁兰酶

摘要： 普鲁兰酶(pullulanase)可催化支链淀粉、普鲁兰糖等多糖大分子中的α-1,6糖苷键水解,是最重要的淀粉酶之一。为提高普鲁兰酶发酵水平,该研究将Bacillus deramificans的普鲁兰酶表达于枯草芽胞杆菌WB600。首先考察了天然组成型、合成组成型、诱导型和自诱导型等强启动子对产酶的影响。结果显示,合成组成型P_(566)获得的普鲁兰酶活力达到58.1 U/mL,较优化前的启动子P_(43)提高96%。然后基于单因素和响应面优化确定了最佳培养基组成为:玉米浆14.8 g/L,蛋白胨7.3 g/L,葡萄糖17.5 g/L,Ca^(2+)1.2 mmol/L。在该条件下,重组普鲁兰酶活力提高至129.4 U/mL。在5 L罐中进行葡萄糖补料控制,重组菌发酵53 h后酶活力达到226.4 U/mL。研究结果为应用枯草芽胞杆菌生产普鲁兰酶提供了方法学参考。

摘要： 作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外。重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积累在大肠杆菌胞质内的产物有明显的差异,分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的重组酶BsBsP的比酶活为153.7 U/mg,是大肠杆菌胞质内产物的5.5倍。重组酶BsBsP最适pH为6.0,最适温度为45°C。重组酶BsBsP对直链淀粉无降解作用,为I型普鲁兰酶。在以土豆淀粉为原料的粉丝制作工艺中,以重组酶BsBsP水解芡糊淀粉可以有效降低粉丝断条率。枯草芽孢杆菌普鲁兰酶可利用自身结构实现高效分泌表达,重组酶适用于以淀粉为原料的粉丝制作。

摘要： 目的:研究挤压和酶解挤压处理对豌豆粉理化性质的影响。方法:采用挤压和酶解挤压的方法改性豌豆粉,利用扫描电子显微镜、X射线衍射仪、傅里叶变换红外光谱、快速黏度分析仪、流变仪分析原料、挤出物和酶解物3种样品的结构变化,并测定体外淀粉消化特性。结果:挤压处理能部分破坏豌豆的结构,表现为相对结晶度下降,I_(1045 cm^(-1))/I_(1022 cm^(-1))比值降低,黏度下降,崩解值和回生值降低;与挤压豌豆粉相比,挤压酶解豌豆粉淀粉的相对结晶度升高,黏度降低,抗剪切力和抗回生性增强。挤压和酶解挤压处理对蛋白质二级结构有明显影响,具体表现为豌豆淀粉α-螺旋相对含量减少(挤压处理)甚至消失(酶解挤压处理),β-折叠相对含量降低,β-转角相对含量升高,无规卷曲相对含量升高。除此之外,挤压和酶解挤压处理显著提高了慢消化淀粉含量,降低了抗性淀粉含量,酶解挤压处理还可以提高豌豆粉的黏弹性和对温度的稳定性。结论:挤出物和酶解物可作为高慢消化淀粉食品的优质原料,并且因其蛋白质消化率提高和含有高赖氨酸可作为与谷类食品复配的良好原料。

摘要： 研究了普鲁兰酶酶解对颗粒态葛根淀粉理化特性的影响。采用快速黏度分析仪(RVA)、差示量热扫描仪(DSC)、偏光显微镜、扫描电子显微镜(SEM)、激光粒度仪、傅里叶红外光谱仪(FTIR)、X射线衍射仪(XRD)对酶解前后葛根淀粉的糊化特性、抗性淀粉含量、热性能、形貌、颗粒大小、结晶结构和分子结构进行了分析。结果表明,酶解后葛根淀粉的峰值黏度和崩解值分别降低了28.33%和94.69%,谷值黏度、最终黏度和回生值分别增加了12.53%、12.47%和12.37%;抗性淀粉含量从1.29%上升至4.60%。酶解后淀粉的偏光十字仍然存在,但颗粒发生膨胀,粒度变大,表层出现剥离;DSC吸热峰向高温区偏移,但吸热焓下降;酶解促进了淀粉分子短程有序结构的生成;葛根淀粉经酶解后,其相对结晶度从37.31%降低至29.10%。

摘要： 采用N端截短方式对Bacillus subtilis 168来源普鲁兰酶进行蛋白结构改造,构建不同形式的截短突变体,考察N端结构对酶学特性的影响。利用基因工程的手段分别删去CBM41结构域N端前2、4和6个氨基酸,获得突变体M1(ΔN2)、M2(ΔN4)和M3(ΔN6)。3种突变体最适反应温度(40-45°C)和最适pH(6.0)均与WT一致,WT、M1、M2和M3的T_(m)值分别为48.57°C、50.03°C、48.43°C和49.50°C,M1、M2和M3的比活力均高于野生型,是WT的1.18、1.60和2.44倍,WT、M1、M2和M3的K_(m)值分别为23.89、29.01、17.29和19.08 mg/mL。上述结果表明,通过截短普鲁兰酶N端氨基酸可获得性质得到改良的突变体,为提高该酶的热稳定性、比活力和底物结合能力提供新的方法和思路。

摘要： 目的:探明电场处理对普鲁兰酶水解糯米淀粉的强化作用机理。方法:测定不同强度电场作用下普鲁兰酶水解糯米淀粉的效率,并利用扫描电子显微镜、X射线衍射仪、差示扫描量热仪和快速黏度分析仪表征酶解产物的结构和热性质变化。结果:强度≤2.5 V/cm的电场处理可提高普鲁兰酶活力、促进糯米淀粉的水解,并且水解产物表面出现裂痕和孔洞、相对结晶度增加、起始糊化温度(T_(o))增加、淀粉糊黏度降低;强度≥5 V/cm的电场处理可引起普鲁兰酶的部分失活、糯米淀粉水解效率降低、相对结晶度和淀粉糊黏度等降低。结论:在当前试验条件下,电场处理对普鲁兰酶水解糯米淀粉的强化作用主要影响普鲁兰酶活性,而对糯米淀粉结构无显著影响。

摘要： 谷氨酸发酵是利用玉米淀粉糖作为底物碳源,通常采用湿法工艺生产玉米淀粉糖。湿法工艺生产投资规模大,设备腐蚀快,能耗高,污染环境。为了有效改进淀粉加工和制糖工艺,笔者采用半干法工艺生产玉米粉糖,气浮分离提取玉米粉中的蛋白质。在制备玉米粉糖的过程中,当组合添加量分别为普鲁兰酶0.15‰和木瓜蛋白酶0.08‰时,可以降低糖液黏度,提高过滤速度,使玉米粉糖的葡萄糖质量浓度提高5.3 g/dL、透光率提高20%;增加氨基酸的质量分数,糖液中的氨基酸可以使谷氨酸发酵产酸率提高0.5 g/dL、糖酸转化率提高0.9%;利用玉米粉糖生产谷氨酸,能够简化生产流程,降低生产成本。

摘要： 以从糯麦淀粉中分离所得的A-、B-型淀粉为研究对象,并以此作为受体,高直链玉米淀粉为供体,利用普鲁兰酶和分支酶协同处理对糯麦淀粉进行改性,测定其颗粒形态、结晶结构以及表观直链淀粉含量、溶解度、膨胀力等理化性质,并对其消化特性进行考察。结果表明:采用普鲁兰酶和分支酶两种复合酶法改性的糯麦A-、B-型淀粉,其预测血糖指数显著降低,表观直链淀粉含量显著增加、溶解度随着温度的增加而变大,膨胀力随着温度的增加基本保持不变。采用扫描电子显微镜观察到酶法改性后的淀粉颗粒形态出现孔洞结构,利用X射线衍射和傅里叶红外光谱分析相对结晶度和1047 cm^(-1)/1022 cm^(-1)处的比值可得,复合酶改性淀粉的长程有序结构和短程有序结构显著改善。通过普鲁兰酶预处理后再用分支酶改性,对糯麦A-型和B-型淀粉进行结构修饰,能够显著改善其消化特性。

摘要： 采用超声波-微波辅助酶解制备小麦抗性淀粉,以抗性淀粉收率为指标,在单因素试验基础上,进行Box-Behnken试验设计,对超声时间、微波时间、普鲁兰酶添加量和酶解时间4个因素进行响应面优化试验分析.结果表明:4个因素的影响主次关系为普鲁兰酶酶解时间>超声时间>普鲁兰酶添加量>微波时间.响应面优化试验确定超声波-微波辅助酶解制备小麦抗性淀粉的最优工艺参数:超声时间41min、微波时间140s,普鲁兰酶添加量10.2U/g、酶解时间7.2h.

摘要： 在玉米秸秆腐殖质土壤中筛选分离得到一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)Y103,采用单因素试验、响应面法优化巨大芽孢杆菌Y103产普鲁兰酶的培养条件.结果表明,最佳培养基配方为糯米淀粉8.5 g/L,酵母膏13.3 g/L,蛋白胨26.7 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.1 g/L,MnSO4·7H2O 0.05 g/L,NaCl 2.0 g/L.最佳发酵条件为初始pH8.8,发酵温度21°C,发酵时间55 h.在最优条件下,普鲁兰酶酶活力为(0.77±0.03)U/mL,是优化前的3.21倍.该酶的最适作用温度为50°C,最适pH为8.0,其水解普鲁兰糖的产物中有大量麦芽三糖和麦芽六糖,表明其为一种新颖的II型普鲁兰酶,在洗涤剂、高麦芽糖浆和麦芽六糖的生产中有着潜在的巨大利用价值.

摘要： 本研究对表达长野芽孢杆菌普鲁兰酶的大肠杆菌工程菌株BL21/pET-pulB胞外表达条件进行优化.结果表明,在250mL三角瓶中装入50mLLB培养基,当菌体浓度达到OD600=0.7～0.8时,加入终浓为0.8mM的IPTG,在温度为24°C,转速为150r/min条件下诱导12h酶活可达到2.05 U/mL,是优化前的1.6倍.

摘要： 对产普鲁兰酶的肺炎克雷伯氏菌的发酵工艺进行了优化,确定了该菌株的最适摇颓发酵条件：种龄12h,接种量3%,装液量100mL／500mL,摇床转速180r/min,30°C发酵96h,普鲁兰酶的发酵单位可达36U／mL,比优化前提高了20%。

摘要： 对一株产普鲁兰酶的肺炎克雷伯氏菌的发酵培养基进行了优化,确定了该菌株的最适发酵培养基配方为(g／100mL)：玉米淀粉1.5,豆饼粉1,CH3COONH40.8,K2HPO43H2O 0.05,MgSO4 7H2O 0.05,KCl 0.05,FeSO47H2O 0.005,30°C发酵96h。普鲁兰酶的发酵酶活单位可达30U／mL,比优化前提高了50％。

摘要： 从云南洱源温泉中筛选得到一株普鲁兰酶初始酶活力较高的菌株WQBGR2-3，经诱导和培养基优化，产酶活力达18 u/mL，得到了培养基各主要组分对产酶影响的数学模型及最佳配方，利用最佳配方培养基传代，产酶活力有继续提高的趋势。发酵上清液中的普鲁兰酶采用鞣酸沉淀、丙酮洗涤、凝胶柱层析等方法进行分离纯化，比活达36 u/mg。该普鲁兰酶的最适温度为75°C，最适pH为4.8，有良好的工业应用前景。该菌株为非芽孢的革兰氏阴性小杆菌、产红色色素，根据形态及生理生化特性初步鉴定为栖热菌目栖热菌科亚栖热菌属。

摘要： 普鲁兰酶是异淀粉酶类之一种。它能切开支链淀粉和糖原等分支点的α-1，6糖苷键，形成直链。在淀粉生产中与糖化酶并用，可使DE值高达97～98℅，提高葡萄糖水平，它与β-淀粉酶并用可生产出60℅以上高麦芽糖浆（糖粉）以及80℅以上的超高麦芽糖浆（糖粉），在α-糖苷酶作用下，超高麦芽糖转化为异麦芽糖类和潘糖等低聚异麦芽糖。在啤酒工业生产干啤酒时应用它减少糊精含量，在一般啤酒麦汁糖化过程中添加普鲁兰酶提高糖化效果的同时缩短糖化时间。

摘要： 普鲁兰酶(pullulanase,EC 3.2.1.41)又称为Ⅰ型普鲁兰酶,属于糖苷水解酶13家族(又称α淀粉酶家族),是一种特异性的淀粉脱支酶,因其能够专一性的水解普鲁兰多糖(pullulan,一种以α-1,6糖苷键连接起来的麦芽三糖聚合物)而得名.被广泛地应用于淀粉糖加工及淀粉改性工业、纺织工业、医药开发、饲料加工与养殖、啤酒及白酒酿造等工业中.为进一步提高获得的普鲁兰酶工程菌株Baclicus subtilis F1147的产酶水平，创新性的开展工程菌株种子强化工艺的研究。采用小米为载体，制备菌株接触面大、通气量好的小米种培养基，取代原始工艺中的二代斜面种及一级摇瓶种子工艺，大大缩短种子阶段培养周期，减少发酵级数。小米种摇瓶发酵最佳接种量为0.33%，其发酵酶活较二代斜面种要高64.5%，较摇瓶种要高21.4%。30L罐补料分批发酵，小米种最佳接种量也为0.33%，种子罐周期约为8h，较摇瓶种种子罐提前1h，发酵最高酶活达1209μ mL-1，较摇瓶种罐高73.7%，生长及产酶周期较摇瓶种罐延长4h，最高菌浓也较摇瓶种罐高出22.1％，显著促进菌株生长及延长产酶周期。而且小米种发酵有利于改善发酵液特性，提高除菌效率，为工程菌株的工业化放大应用奠定了良好基础。

摘要： 为了解决石油资源日趋枯竭及白色污染问题，该研究以普鲁兰酶为酶制剂，玉米淀粉为基料、PVA为辅料、甘油为增塑剂，制备可生物降解性食品包装薄膜。研究酶解温度、pH值、酶添加量、酶解时间、淀粉浓度及PVA添加量、甘油添加量对薄膜力学性能的影响。结果表明：对于酶改性膜的抗拉强度性能来说，适宜的pH值为4.5，酶解温度为45°C，酶解时间为10h，酶添加量为25u·g-1淀粉，淀粉浓度为7%；制备复合薄膜时，适宜的PVA添加量为1.0g·g-1淀粉，甘油添加量为2%。

摘要： 本试验以国产糖化酶和国产普鲁兰酶复配成糖化复合酶与诺维信糖化复合酶对比糖化淀粉液化液，最终确定当国内普鲁兰酶加量为20％时已足够，DE值为97.4，与诺维信DE值97.9相差0.5，可能是由于糖化酶没有去除转苷酶所致。

摘要： 本发明描述了一个新分离的普鲁兰酶产生菌，16S rRNA(SEQ IDNo.1)结果分析表明该菌为厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus sp.)，由该菌所分泌的一种蛋白质，其序列特征为序列表所示的氨基酸序列，编码该蛋白的核酸序列为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，该蛋白质特异水解普鲁兰糖分子内的α-1，6-糖苷键，生成麦芽三糖，是一个I型普鲁兰酶(Pullulanase)，该酶的最适反应温度为60°C，最适pH 6.5，在60°C、pH 6.5条件下80小时，仍具有50％以上的活性。

摘要： 本发明公开了一种产普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌、其发酵得到的普鲁兰酶及重组载体的构建与应用。它是从云南腾冲热泉附近的土壤样品中，通过菌体的富集、筛选得到一株产中温普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌。通过蛋白质电泳和N端测序技术分析普鲁兰酶N端组成，分析基因组数据得到中温普鲁兰酶的基因。本发明将该基因以整合到枯草芽孢杆菌基因组的方式在枯草芽孢杆菌中表达，得到较原始菌株酶活有极大提高的重组菌株，为后续的工业生产提供基础。

摘要： 本发明公开了一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因及克隆表达以及发酵生产新普鲁兰酶的方法，选择多粘芽孢杆菌（ paenibacilluspolymyxa ）CFCC10334作为出发菌株，基因工程宿主菌是大肠杆菌BL21，根据大肠杆菌表达载体质粒PGEX4T-1的物理图谱，将多粘芽孢杆菌中新普鲁兰酶基因 Npu 定向插入到表达质粒中，并转化大肠杆菌BL21，表达产物ENpu5具有正常生物学活性，获取新普鲁兰酶基因，通过克隆转化，在大肠杆菌中进行诱导表达，筛选阳性表达子，并测定酶活后得到一株具有较高酶活的基因工程菌株，最后进行发酵生产得到新普鲁兰酶产品。提高了酶的稳定性、活性，降低了生产成本。

摘要： 本发明描述了一个新分离的普鲁兰酶产生菌，16S rRNA(SEQ IDNo.1)结果分析表明该菌为厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus sp.)，由该菌所分泌的一种蛋白质，其序列特征为序列表所示的氨基酸序列，编码该蛋白的核酸序列为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，该蛋白质特异水解普鲁兰糖分子内的α-1，6-糖苷键，生成麦芽三糖，是一个I型普鲁兰酶(Pullulanase)，该酶的最适反应温度为60°C，最适pH 6.5，在60°C、pH 6.5条件下80小时，仍具有50％以上的活性。

摘要： 本发明属于食品加工技术领域，提供了一种利用印度洋交替单胞菌制备普鲁兰酶的方法。步骤如下：提取菌株Alteromonas sp.162基因组；扩增获得普鲁兰酶基因并构建重组质粒，以重组质粒为模板，扩增获得普鲁兰酶点变体基因h611Q并构建点突变重组质粒，以点突变体重组质粒为模板，扩增普鲁兰酶叠加突变体基因puld5/h611Q，构建叠加突变体重组质粒；将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，制备并纯化叠加突变体Puld5/H611Q。其优点：Puld5/H611Q比活力最高达145.2U·mg‑1，比鲁兰酶提高2.5倍；Puld5/H611Q最适pH为6.0，最适反应温度为50°C，比普鲁兰酶提高15°C，半衰期为普鲁兰酶的5倍；Puld5/H611Q催化效率约为普鲁兰酶的1.2倍。将截断突变和点突变相结合，制备方法简单，获得的Puld5/H611Q性能优于现有普鲁兰酶，可提高淀粉利用率。

摘要： 本发明公开了一种超嗜热II型普鲁兰酶及应用，属于基因工程技术领域。本发明通过对超嗜热II型普鲁兰酶进行氨基酸突变，获得了超嗜热II型普鲁兰酶突变体Q13H、I25E和Q13H/I25E。本发明获得的突变体催化性能有了很大的提高，且突变体在反应过程中不需要其他金属离子辅助(例如Ca2+)，有助于降低产物提取成本。本发明构建的突变体具有极强的热稳定性，在100°C保温10h还剩余50％的酶活，并具有较为广泛的pH活性范围和pH耐受性，在pH 5.8‑7.0范围保有70％活性，于不同的pH下，4°C放置剩余酶活均在75％以上，能很好的应用于淀粉工业中的糖化过程中。

摘要： 本发明提供一种普鲁兰酶的制备方法，包括以下步骤：制备发酵液，并利用发酵液制备粗酶液；还包括：分离菌株，将分离的菌株进行发酵，获得发酵菌液；将发酵菌液与原料进行发酵，产生发酵物；将发酵物进行压滤后，获得粗酶液对粗酶液进行酶纯化，获得普鲁兰酶液态制品。本发明提供一种普鲁兰酶制备和存储方法，用以实现制备的普鲁兰酶能够耐高温储存，进一步减少储存不当导致其酶活性降低或失活的情况。

摘要： 本发明公开了一种普鲁兰酶突变体、工程菌及其应用，所述普鲁兰酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第365位、第401位、第504位或第499位氨基酸进行单突变或多突变获得的。本发明构建的普鲁兰酶突变体的催化活性、热稳定性与耐酸稳定性均得到了提高，其中突变体PulAR‑A365V‑401C‑H499A‑T504V的催化效率较野生型普鲁兰酶PulAR在pH5.0、6.0，60°C条件下分别提高了6.6倍与9.6倍；在60°C，65°C的半衰期分别比野生型普鲁兰酶提高了2.6和3.1倍，且在pH 4.5与pH 5.0的半衰期分别比野生型普鲁兰酶提高了1.6和1.8倍。

摘要： 本发明公开了一种高温普鲁兰酶及其制备方法与应用。所述的酶序列见SEQ ID NO：2。本发明基于热球菌(Thermococcus sp.MCCC 1A01790)基因组测序数据分析获得普鲁兰酶PulTE基因序列，并对PulTE基因序列进行优化，通过人工合成的方法获得优化后的普鲁兰酶基因序列，并添加酶切位点BamHI和XhoI，将该优化后的基因克隆入pET‑28a(+)表达载体上，在大肠杆菌E.coli Rosette中进行诱导表达，纯化得到较高纯度的重组普鲁兰酶蛋白。该酶最适温度为80°C，在65～80°C条件下比较稳定；该酶具有较宽的pH作用范围，最适pH为6.5；该酶可以水解α‑(1,4)和α‑(1,6)糖苷键，对普鲁兰糖和γ‑环糊精有很强的水解作用，是一种双功能酶，在淀粉资源和普鲁兰糖的加工利用以及麦芽八糖制备方面具有优势。

摘要： 本发明属于酶工技术程领域，具体涉及普鲁兰酶酶分子的组合定点突变、突变体的筛选与表达制备。本发明以SEQ ID NO.2所示氨基酸的长野芽胞杆菌普鲁兰酶(PulA)为基础，通过定向分子进化，获得最适作用温度得到提高或降低、最适作用pH得到提高或降低、以及异源表达的水平显著提高的普鲁兰酶突变体，由此可改善普鲁兰酶的应用性能并拓展其应用领域，提升普鲁兰酶工业规模下的制造效率。