兼抗番木瓜畸形花叶病毒和番木瓜环斑病毒的双价弱毒疫苗

摘要

本发明涉及植物保护技术领域，尤其涉及兼抗番木瓜畸形花叶病毒和番木瓜环斑病毒的双价弱毒疫苗。本发明通过对PRSV病毒片段的筛选和优化，将其与PLDMV弱毒株进行配合，形成的载体制备获得疫苗能够兼抗PRSV和PLDMV，实现对PRSV和PLDMV的交叉保护。相对于单独抗PRSV或单独抗PLDMV病毒的疫苗而言，本发明提供的双价弱毒疫苗抗病效果显著，为田间通过交叉保护防控PRSV和PLDMV提供了新的材料和途径。

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护技术领域，尤其涉及兼抗番木瓜畸形花叶病毒和番木瓜环斑病毒的双价弱毒疫苗。

背景技术

番木瓜是海南最重要的热带经济果树之一，而番木瓜环斑病毒(Papaya ringspotvirus,PRSV)和番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)一直是影响番木瓜产业发展的主要限制因素。目前，在栽培技术上还无法通过化学方法予以防治环斑畸形花叶病，且抗病种质资源匮乏。

PRSV和PLDMV同为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)中的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒。PRSV引起的病害，能同时危及叶、茎和果实，主要症状是叶片花叶，斑驳或畸形，果实表面环斑，茎、叶柄水浸条斑，严重影响了番木瓜的品质和产量。PRSV通过多种蚜虫以非持久性方式传播，传播速度快，种植园区一旦受到病毒的侵染，就会波及到整个种植区域。PLDMV与PRSV无血清学关系，但有着非常类似的生物学背景和病症表现，该病毒引起的病症和PRSV引起的病症极其相似，极易被误认为感染PRSV。近年来，PLDMV危害呈逐年上升趋势，逐渐上升为威胁，且PLDMV与PRSV可以混合感染番木瓜，造成更为严重的病害。

交叉保护是防治植物病毒病危害的一种重要的方法，是指当作物受到病毒弱毒株系的侵染之后，能够抑制同种或者相近病毒强毒株系侵染的现象。是防治病毒病非常有效的手段，在许多作物病毒病的防治中取得了成功。但目前还未有兼抗PRSV和PLDMV的双价弱毒疫苗用于交叉保护的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供兼抗番木瓜畸形花叶病毒和番木瓜环斑病毒的双价弱毒疫苗。

本发明提供了具有如SEQ ID NO:1所示序列的核酸片段。

本发明提供的核酸片段来自PRSV病毒，经验证，本发明选取的具有如SEQ ID NO:1所示序列的核酸片段插入pPLDMV-NC载体后，制备获得的疫苗同时对PRSV-W和PLDMV-W强毒株系起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受PRSV和PLDMV感染后的影响，大大减少病害造成的损失。插入该片段的载体构建获得的疫苗的保护效果显著优于其他片段。

具体的本发明提供的核酸片段的序列为：gacaagttacacggcaaccttaaaggagtgagctcggcacctagcaatttagtcacgaagcacgttgtgaaaggcatttgtcctctcttcaggaactaccttgagtgtgatgaagaagctaagactttcttcaatccgctgatgggacactacatgaagagcgttctaagcaaagaagcatatgtgaaggatttattgaaatattcaagcgatataattgttggtgaagttgaccacgatgtgttcgaggaaagcgttgcacaagtcgttgagttgttgaatgaccatgagtgtcctgaactcgaatacgtcacagatagcgaagtcatc。

本发明还提供了一种重组载体，其包括本发明所述的核酸片段和pPLDMV-NC载体。

本发明所述的pPLDMV-NC是在野生型PLDMV病毒基础上突变获得的弱毒株。在该序列中，野生型PLDMV病毒编码的HC-Pro第53个氨基酸K突变为E。

研究表明，核酸片段的插入位点对免疫效果影响显著，本发明采用的插入位点有利于获得更良好的免疫效果。一些实施例中，本发明所述重组载体的具体序列为SEQ IDNO:2所示。

本发明所述重组载体的构建方法包括：将本发明所述的核酸片段利用NimbleCloning反应插入pPLDMV-NC载体，获得所述重组载体。

具体的，将本发明所述的核酸片段片段，利用Nimble Cloning策略将其克隆到PLDMV-E侵染性克隆载体pPLDMV-NC克隆框(adapter 1–Sfi I–ccdB gene–Sfi I–adapter2)，获得双价弱毒疫苗pPLDMV-PR载体。

本发明中，Nimble Cloning反应体系包括：5μL 2×Nimble Mix，20ng pPLDMV-NC质粒，40ng本发明所述的核酸片段，ddH

本发明中所述Nimble Cloning反应的条件为50℃反应1小时。

本发明还提供了一种农杆菌，其转化有本发明所述的重组载体。

本发明中，所述农杆菌的构建方法为，采用电转化方式，将本发明所述的重组载体转化入农杆菌感受态。一些实施例中，所述农杆菌为GV3101(pSoup)。

本发明所述农杆菌经培养获得的培养物。

本发明所述培养物包括培养获得的菌液、由菌液分离获得的菌体，或由菌液经裂解等步骤加工获得的产物。

本发明还提供了如I)～IV)中至少一项在制备兼抗番木瓜畸形花叶病毒和番木瓜环斑病毒的疫苗中的应用；

I)、本发明所述的核酸片段；

II)、本发明所述的重组载体；

III)、本发明所述的农杆菌；

IV)、本发明所述的培养物。

本发明还提供了一种疫苗，其包括所述农杆菌和缓冲液。

本发明所述疫苗中的缓冲液包括水和10mmol/L MgCl

本发明所述疫苗的制备方法，其包括：

将所述的农杆菌接种于LB培养基，培养至对数生长期后收集菌体，以缓冲液重悬至OD600值为0.4，暗处放置2h，获得疫苗。所述LB培养基中还包括10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮。

本发明还提供了防治番木瓜畸形花叶病毒和番木瓜环斑病毒的方法，其特征在于，给予本发明所述的疫苗，或给予本发明所述制备方法制得的疫苗。

本发明中，所述防治番木瓜畸形花叶病毒和番木瓜环斑病毒的方法中，给予疫苗的方法为，用去掉针头的注射器对番木瓜叶片进行注射接种。

本发明中，所述防治包括治疗和/或预防。所述预防包括提前25～60天接种疫苗。

本发明通过对PRSV病毒片段的筛选和优化，将其与PLDMV弱毒株进行配合，形成的载体制备获得疫苗能够兼抗PRSV和PLDMV，实现对PRSV和PLDMV的交叉保护。相对于单独抗PRSV或单独抗PLDMV病毒的疫苗而言，本发明提供的双价弱毒疫苗抗病效果显著，为田间通过交叉保护防治PRSV和PLDMV提供了新的材料和途径。

附图说明

图1示pPLDMV-PR载体构建；

图2示PLDMV-PR，pPLDMV-E和PLDMV-WT侵染番木瓜后产生的病症表型；

图3示PLDMV-PR，PLDMV-E和PLDMV-WT侵染番木瓜后病毒积累分析；

图4示PLDMV-WT和PRSV-WT强毒株攻毒评估PLDMV-PR交叉保护效果。

具体实施方式

本发明提供了兼抗番木瓜畸形花叶病毒和番木瓜环斑病毒的双价弱毒疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的技术方案包括：

1.双价弱毒疫苗pPLDMV-PR载体构建：

(1)依据含有PRSV基因组全长序列的载体pG-H(参见庹德财,P型番木瓜环斑病毒海南分离物(PRSV-P HN-2)全长cDNA侵染性克隆的构建与分析，2011海南大学硕士学位论文。)，设计带Nimble Cloning(参见Yan P,Zeng Y,Shen W,et al.Nimble Cloning:asimple,versatile,and efficient system for standardized molecularcloning.Front Bioeng Biotechnol,2020,7:460.)接头的正反向引物，利用PCR技术扩增PRSV编码NIb基因片段(PR)。

(2)将PR片段，利用Nimble Cloning策略将其克隆到PLDMV-E侵染性克隆载体pPLDMV-NC(参见Tuo D,Yan P,Zhao G,et al.An efficient papaya leaf distortionmosaic potyvirus vector for virus-induced gene silencing in papaya.HorticRes.2021；8(1):144)克隆框(adapter 1–Sfi I–ccdB gene–Sfi I–adapter 2)，获得双价弱毒疫苗pPLDMV-PR载体。

2.弱毒疫苗的致病力鉴定：

通过农杆菌渗透注射法将双价弱毒疫苗pPLDMV-PR接种到番木瓜植株，观察寄主的症状和致病力变化。

3.交叉保护效果测定:在接种双价弱毒疫苗pPLDMV-PR后10天数，接种PRSV-W和PLDMV-W强毒株系，观察弱毒疫苗对强毒株系的交叉保护效果。

与现有技术相比：1.本发明的双价弱毒疫苗可同时对PRSV-W和PLDMV-W强毒株系起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受PRSV和PLDMV感染后的影响，大大减少病害造成的损失。2.本发明提供的双价弱毒疫苗对多个品种番木瓜品种具有交叉保护作用，具有应用潜力。3.本发明的弱毒疫苗采用自主构建的PLDMV弱毒突变体基础上插入了可诱导对PRSV产生交叉保护的有效基因片段，因此弱毒疫苗并非自然存在或人工诱变产生，作用稳定，有利于大规模应用。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，pPLDMV-NC载体的构建参照：Tuo D,Yan P,Zhao G,et al.An efficient papaya leaf distortion mosaicpotyvirus vector for virus-induced gene silencing in papaya.Hortic Res.2021；8(1):144

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

1.PRSV Nib(PR)片段的克隆：

利用设计的引物对PR-F/R(引物序列见下表)，以PRSV侵染性克隆质粒pG-H (庹德财,2011)为模板，使用Prime STAR Max Premix(2×)高保真DNA聚合酶(TaKaRa)进行扩增，获得大小为330bp的NIb基因片段(PR)，该片段仅产生低丰度与PLDMV病毒沉默抑制子HC-Pro结合的vsiRNAs,是用于靶向病毒RNA的理想片段。

表1 引物序列

2.双价弱毒疫苗pPLDMV-PR载体构建

将PR片段，利用Nimble Cloning反应将其克隆到PLDMV-E(野生型PLDMV病毒编码的HC-Pro第53个氨基酸K突变为E(参见Tuo D,Zhou P,Zhao G,et al.A double mutationin the conserved motifs of the helper component protease of papaya leafdistortion mosaic virus for the generation of a cross-protective attenuatedstrain.Phytopathology,2020,110:187-193)弱毒株侵染性克隆载体pPLDMV-NC克隆框(adapter 1–Sfi I–ccdB gene–Sfi I–adapter 2)，反应产物转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和DNA测序，确认获得双价弱毒疫苗pPLDMV-PR载体(图1)。

Nimble Cloning反应体系包括：5μL 2×Nimble Mix，20ng pPLDMV-NC质粒，40ngof PRSV Nib PCR扩增片段，补ddH

Nimble Cloning反应程序：50℃水浴1小时。

所述质粒载体pPLDMV-PR中含有PLDMV(大写字母)，330bp PR(加黑划线小写字母)和NC克隆框adapter序列(斜体小写字母)如下：

3.弱毒疫苗的致病力鉴定：

利用电击法将获得的pPLDMV-PR转化农杆菌GV3101(pSoup)感受态细胞，经菌落PCR验证后，获得重组菌。然后挑单斑接种于含有卡那霉素(50μg/mL)和利福霉素(50μg/mL)液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)及上述2种抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期。

离心10min收集菌体，利用接种缓冲液[10mmol/LMgCl

结果分析：

30天后病症观察显示：pPLDMV-PR与pPLDMV-E(负对照，Tuo D,Zhou P,Zhao G,etal.A double mutation in the conserved motifs of the helper component proteaseof papaya leaf distortion mosaic virus for the generation of a cross-protective attenuated strain.Phytopathology,2020,110:187-193)一样未观察到PLDMV-WT强毒株引起的花叶畸形症状(图2)。接种25和60天后，DAS-ELISA可以检测到pPLDMV-PR在番木瓜植株的系统性复制和积累，但是相比PLDMV-WT强毒株，在植株中积累量和pPLDMV-E一样显著降低(图3)，PR的插入没有影响到病毒侵染性，pPLDMV-M-PR双联弱毒株可以用于交叉保护实验。

4.交叉保护效果测定:

在双联弱毒株进行保护接种10天后，用强毒株PLDMV-WT/PLDMV-GFP，PRSV-WT/PRSV-GFP单独和混合攻毒，并在攻毒后拍照记录接种后的交叉保护效果。

表2 双联弱毒株交叉保护率分析

结果分析：攻毒60天后，经pPLDMV-PR双联弱毒株保护接种3个品种【华农1号(转基因抗PRSV)，穗中红和蜜红】的实验组均未观察到PLDMV和PRSV病症(花叶和畸形叶等)，而未接种双联弱毒株的阳性对照组均出现明显的PLDMV和PRSV病症，表明两种双联弱毒株均具有交叉保护作用(图4)，结合RT-PCR检测交叉保护率在83％～90％之间(表2)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 兼抗番木瓜畸形花叶病毒和番木瓜环斑病毒的双价弱毒疫苗

<130> MP21027301

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<211> 10769

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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