一种检测罗丹明B和苏丹红色素的表面开放式微流控芯片、免疫传感器及方法

摘要

本发明公开了一种检测罗丹明B和苏丹红色素的表面开放式微流控芯片、免疫传感器及方法。所述表面开放式微流控芯片包括芯片基底和位于芯片基底上的若干个平行通道，每个平行通道设有依次相连的5个反应腔室和1个尾腔室，每个腔室均具有凹陷微结构，通过微流控流道相互连接；第一反应腔室用于装载待测样、磁珠抗原和酶标抗体混合溶液，第二反应腔室中装载有PBS，第三反应腔室中装载有底物Amplex Red/H

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种检测罗丹明B和苏丹红色素的表面开放式微流控芯片、免疫传感器及方法。

背景技术

辣椒调味品在全球调味品市场中占有较大份额，是增加食品风味、色泽和保存时间的重要原料。然而，部分商家为了使得产品色泽更加艳丽进而谋取高额利润，不顾消费者的健康问题，在辣椒调味品中非法添加罗丹明B和苏丹红等工业染料。研究表明，这类染料对人体健康具有极大的危害，其中罗丹明B具体潜在的毒性、致癌性和致突变性。不允许用作食品染色，在卫生部《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第一批)》被列为违禁色素；苏丹红(苏丹Ⅰ，苏丹Ⅱ，苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ)被国际癌症组织列为三类致癌物，对动物产生致癌作用，主要靶器官是肝脏。1995年欧盟等国家禁止苏丹红作为食品添加剂，中国也在1996年的《食品添加剂卫生标准》中明令禁止使用苏丹红。目前针对食品中罗丹明B和苏丹红等违禁色素的检测方法主要有仪器法，包括高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法和气相色谱-串联质谱法等和免疫分析法，如酶联免疫吸附试验、免疫亲和色谱法等。仪器法虽然准确度、精准度高，但样品前处理复杂，而且需要昂贵的仪器设备；现有的免疫分析法虽然操作简便、灵敏度高，但仍然存在检测对象单一、需要大型酶标仪等缺点，限制了其在食品安全现场筛查中的应用。专利CN103439514A公开了一种基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，是以小分子的农兽药半抗原与牛血清白蛋白偶联制备成免疫抗原，用免疫抗原免疫小鼠制备得到相应的农兽药单克隆抗体，捕获单抗探针用生物芯片点样仪点样到琼脂糖修饰的玻片固相载体上，制备成多重复的“捕获单抗探针”微阵列。将农兽药半抗原与卵清白蛋白偶联制备成“半抗原-OVA”偶联体，然后用荧光分子Cy3标记。将待检样品液与“标记检测抗原”按一定浓度混合后，与芯片孵育，样品中的待测抗原和相应“标记检测抗原”与固定在芯片上的相应的“捕获单抗探针”直接竞争性结合，在一定的条件下洗脱，用生物芯片扫描仪检测结果；虽然利用了生物芯片进行检测，但是采用的微阵列检测芯片使用起来依然过于繁琐，且后续配套的检测需要依赖实验室仪器设备，无法达到现场简单、高效、快速的检测目标。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种检测罗丹明B和苏丹红色素的表面开放式微流控芯片。

本发明的第二个目的在于提供一种检测罗丹明B和苏丹红色素的生物传感器。

本发明的第三个目的在于提供上述利用上述生物传感器检测罗丹明B和苏丹红色素的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种检测罗丹明B和苏丹红色素的表面开放式微流控芯片，包括芯片基底和位于芯片基底上的若干个平行通道，每个平行通道设有依次相连的5个反应腔室和1个尾腔室，每个腔室均具有凹陷微结构，通过微流控流道相互连接；第一反应腔室用于装载待测样、磁珠抗原和酶标抗体混合溶液，第二反应腔室中装载有PBS液滴，第三反应腔室中装载有底物Amplex Red/H

所述表面开放式微流控芯片以罗丹明B抗原-磁珠偶联物(RhB-Ag-Mb)和苏丹红抗原-磁珠偶联物(SuD-Ag-Mb)作为传感器基底，以辣根过氧化物酶标记罗丹明B抗体(RhB-Ab-HRP)和葡萄糖氧化酶标记苏丹红抗体(SuD-Ab-GOx)为信号探针。在注满矿物油的微流控芯片通道的第一个反应腔室内加入含有磁珠抗原和酶标抗体的混合溶液，会形成油包水液滴，作为微型反应区。免疫识别结束后，通过外加磁铁的作用，可将结合了酶标抗体的磁珠牵引进入第二个反应腔室(含有PBS)进行清洗。清洗彻底后，又将磁珠拖进第三个腔室(含有底物Amplex Red/H

优选地，所述平行通道为16个。

优选地，所述反应腔室长12.76mm，宽3.2mm，高3.7mm；所述尾腔室长3.2mm，宽3.2mm，高3.7mm。

一种检测罗丹明B和苏丹红色素的生物传感器，包括生物传感器壳体1，设于生物传感器壳体1内部的电源模块2、孵育模块3、免疫反应模块4、荧光激发模块5和设于生物传感器壳体1顶部的信号采集模块6；所述电源模块2设于生物传感器壳体1底部，分别与孵育模块3和荧光激发模块5相连接；所述孵育模块3设于免疫反应模块4的下方；所述荧光激发模块5设于生物传感器壳体1顶部内侧；所述免疫反应模块4包括微流控芯片托盘41和上述任一所述表面开放式微流控芯片42。

本发明所述生物传感器利用上述表面开放式微流控芯片可实现单次、同时检测多个样品中的罗丹明B和苏丹红的含量；通过电源模块为孵育模块和荧光激发模块提供稳定的电源，孵育模块可为免疫反应模块提供恒温加热环境，荧光激发模块用于底物的荧光激发，信号采集模块保证采集荧光信号位置的一致性，降低批间差异，提高检测的准确性。本发明生物传感器能够对罗丹明B和苏丹红进行实时实地、高精度的快速检测。

优选地，所述电源模块2为可循环使用的电池盒，可采用12V电池盒，用于整个生物传感器各用电模块的供电。

优选地，所述孵育模块3由智能温控器31和恒温加热器32相连接组成。

更优选地，所述恒温加热器32为12V微型加热板，用于孵育免疫反应模块。

优选地，所述生物传感器壳体1的一侧设有温度显示屏7，温度显示屏7与智能温控器31相连接。

优选地，所述芯片托盘41为抽屉式托盘，可用于表面开放式微流控芯片42的输送，其手柄的设计还考虑了人体力学因素，可以提升用户的舒适感。

优选地，所述荧光激发模块5由LED阵列、激发滤光片、发射滤光片组成。

更优选地，所述LED阵列与生物传感器壳体1顶部成45°夹角，LED阵列为60*15mm、2W的绿光LED阵列，激发波长为525nm。

优选地，所述信号采集模块6由信号采集孔61、智能手机62和固定支架63组成，信号采集孔61设于生物传感器壳体1顶部与智能手机62的摄像头相配合，固定支架63设于生物传感器壳体1顶部外侧用于固定手机62。

优选地，所述手机包括图像信息采集模块、比色模块与浓度显示模块，用于检测信号的采集、处理以及结果的显示，要求Android 4.3及以上版本。

优选地，所述生物传感器壳体1顶部还设有用于控制孵育模块3的第一开关8和用于控制荧光激发模块5的第二开关9。具体地，所述第一开关用于控制恒温加热器32，所述第二开关用于控制LED阵列。

本发明还提供一种检测罗丹明B和苏丹红色素中的方法，，包括如下步骤：

S1.采用上述任一所述生物传感器测定标准系列罗丹明B浓度和苏丹红浓度下，生物传感器产生的荧光强度，绘制浓度与荧光强度的线性关系曲线；

S2.使用上述任一所述生物传感器检测待测样中罗丹明B和苏丹红色素，利用步骤S1所得的线性关系曲线计算得到样品中罗丹明B和苏丹红色素的浓度。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的表面开放式微流控芯片结构简单，操作便利，无需泵驱动，可实现高通量检测；利用本发明的生物传感器可以单次、同时检测多个样品中的罗丹明B和苏丹红的含量，且灵敏度高(对罗丹明B、苏丹红1号和2号的检测限分别为0.0072ng/mL、0.0040ng/mL和0.026ng/mL)、操作简便，十分适合食品中违禁色素的现场检测，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1表面开放式微流控芯片和芯片模具设计的结构示意图。A为芯片参数图，B为模具参数图。

图2为本发明实施例2检测罗丹明B和苏丹红色素的便携式生物传感器的整体结构拆分示意图。

图3为本发明实施例2检测罗丹明B和苏丹红色素的便携式生物传感器的示意图。

图4为罗丹明B和苏丹红色素的抗原-磁珠偶联物和HRP标记的罗丹明B抗体和GOx标记的苏丹红抗体检测结果。A为基于纳米磁珠的罗丹明B和苏丹红色素的抗原-磁珠偶联物的SDS凝胶电泳检测结果；B为罗丹明B抗体、HRP和RhB-Ab-HRP紫外(230～600nm)扫描鉴定结果；C为苏丹红抗体Ab，GOx酶和酶标抗体Ab-GOx与相同量的TMB/HRP溶液混合孵育后的变色结果。

图注：1-生物传感器壳体；2-电源模块；3-孵育模块；4-免疫反应模块；5-荧光激发模块；6-信号采集模块；7-温度显示屏；8-第一开关；9-第二开关；11-生物传感器前壳体；12-生物传感器后壳体；21-电池盒体；22-电池盒底座；31-智能温控器；32-恒温加热器；41-芯片托盘；42-表面开放式微流控芯片；51-第一激发光固定器；52-第二激发光固定器；61-信号采集孔；62-手机；63-固定支架。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1一种检测罗丹明B和苏丹红色素的表面开放式微流控芯片

1、制备表面开放式微流控芯片

如图1A，提供一种表面开放式微流控芯片(90*80*0.5cm)，包括表面开放式微流控芯片，包括芯片基底和位于芯片基底上的16平行通道，每个通道设有依次相连的5个反应腔室和1个尾腔室，每个腔室均具有凹陷微结构，通过微流控流道相互连接，所述反应腔室长12.76mm、宽3.2mm、高3.7mm，所述尾腔室长3.2mm、宽3.2mm、高3.7mm；第一反应腔室用于装载待测样、磁珠抗原和酶标抗体混合溶液，第二反应腔室中装载有PBS液滴，第三反应腔室中装载有底物Amplex Red/H

所述表面开放式微流控芯片以罗丹明B抗原-磁珠偶联物(RhB-Ag-Mb)和苏丹红抗原-磁珠偶联物(SuD-Ag-Mb)作为传感器基底，以辣根过氧化物酶标记罗丹明B抗体(RhB-Ab-HRP)和葡萄糖氧化酶标记苏丹红抗体(SuD-Ab-GOx)为信号探针。在注满矿物油的微流控芯片通道的第一个反应腔室内加入含有磁珠抗原和酶标抗体的混合溶液，会形成油包水液滴，作为微型反应区。免疫识别结束后，通过外加磁铁的作用，可将结合了酶标抗体的磁珠牵引进入第二个反应腔室(含有PBS)进行清洗。清洗彻底后，又将磁珠拖进第三个腔室(含有底物Amplex Red/H

所述微流控芯片通过倒模法所得，具体制备方法：

首先是模具的制备，模具设计图如图1B，通过机加工所得。然后是芯片的制备。称取30克灌封胶PDMS聚二甲基硅氧烷(道康宁184SYLGARD184)的A胶和3克B胶，搅拌混合后，抽真空。将混合胶倒模到模具上，再次抽真空，排除气泡后，放置到90摄氏度烘箱中加热30分钟，固化成型。放置到室温后，模具剥脱，获得芯片。

2、分别制备基于纳米磁珠的罗丹明B和苏丹红色素的抗原-磁珠偶联物：

(1)磁珠的活化。各取100μL磁珠到1.5mL EP管中，置于磁分离架，富集磁珠，去除上清液；加入200μL 4℃预冷的1mM盐酸稀溶液中，漩涡震荡15s后，置于磁分离架富集磁珠，去除上清液。

(2)抗原偶联。分别加入100μL抗原溶液(浓度为100μg/mL的RhB-Ag和100μg/mL的SuD-Ag)，涡旋30s，使其混合均匀。将EP管架于涡旋振荡器上，调至最低挡位，自动模式，振荡1.5h。

(3)上清分离。采用磁分离架富集磁珠，保存上清液。

(4)清洗。加入200μL封闭液(3M乙醇胺，pH 9.0)，涡旋15s后，弃上清，重复此操作4次。

(5)封闭。加入200μL封闭液，振荡混合2h。

(6)分离。采用磁分离架富集磁珠，弃上清。

(7)二次封闭。加入200μL浓度为1％的BSA溶液，涡旋15s后，弃上清，重复此操作2次。再加入200μL浓度为1％的BSA溶液，震荡混合1h。

(8)清洗。加入200μL超纯水，涡旋15s，弃上清。

(9)保存。加入200μL保存液(含0.05％叠氮化钠的PBS溶液)，涡旋15s，弃上清。重复此操作两次。再加入100μL保存液，充分混合，4℃保存备用。

(9)鉴定。采取SDS凝胶电泳法，分别取浓度为100μg/mL的RhB-Ag和100μg/mL的SuD-Ag与上述步骤(3)中的上清液，加入不同泳道，最后通过比较各泳道颜色的深浅来评价偶联效率。结果如图4A所示，偶联后上清液中的罗丹明抗原和苏丹红抗原的蛋白胶显色均比偶联前的要浅很多，说明偶联后上清液蛋白浓度下降，即大部分抗原已经偶联到磁珠表面。

3、分别制备HRP标记的罗丹明B抗体和GOx标记的苏丹红抗体：

(1)分别称取5mg HRP和5mg GOx溶于500μL CH3COONa-CH

(2)逐滴加入500μL 2.5％乙二醇，室温下反应30min。

(3)往HRP中滴加入100μL罗丹明B抗体(1mg/mL)，往GOx中滴加入100μL苏丹红抗体(1mg/mL)，4℃搅拌30min，用NaHCO

(4)次日取出抗体，分别加入100μL 5mg/mL NaBH

(5)加入等量的饱和硫酸铵溶液，4℃下反应30min后,再静置1h。

(6)4℃下4000r/min离心20min，弃上清，沥干。将沉淀溶于少量PBS(0.01mol/L，pH7.4)中，装入透析袋中，用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)透析过夜。

(7)第三日取出，收集透析液的上清液即为酶标抗体RhB-Ab-HRP和SuD-Ab-GOx，混匀分装，置于-20℃保存备用。

(8)紫外扫描鉴定。取罗丹明B抗体、HRP和RhB-Ab-HRP分别进行紫外(230～600nm)扫描鉴定，由于HRP在400nm处有特征特征吸收峰，并通过比较标记前后的各物质在此处的最高吸光值，发现HRP与HRP标记抗体在400nm处均有特征峰(图4B)，而抗体在此处无特征峰，故说明反应产物是HRP与抗体的复合物，标记成功。利用GOx酶催化葡萄糖产生H

4、同时检测罗丹明B和苏丹红色素的免疫传感器的装配

以步骤1的表面开放式微流控芯片为基础，第一反应腔室用于装载待测样、磁珠抗原(RhB-Ag-Mb、SuD-Ag-Mb)和酶标抗体(RhB-Ab-HRP、SuD-Ab-GOx)混合溶液，作为微型反应区；第二反应腔室中装载有PBS液滴，第三反应腔室中装载有底物Amplex Red/H

实施例2

如图2、3所示，一种检测罗丹明B和苏丹红色素的便携式生物传感器，包括生物传感器壳体1，设于生物传感器壳体1内部的电源模块2、孵育模块3、免疫反应模块4、荧光激发模块5和设于生物传感器壳体1顶部的信号采集模块6；所述电源模块2设于生物传感器壳体1底部，分别与孵育模块3和荧光激发模块5相连接；孵育模块3设于免疫反应模块4的下方，由智能温控器31和恒温加热器32相连接组成；生物传感器壳体1的一侧设有温度显示屏7，温度显示屏7与智能温控器31相连接；免疫反应模块4由芯片托盘41和设于芯片托盘41上的实施例1所述表面开放式微流控芯片42组成；荧光激发模块5设于生物传感器壳体1顶部内侧，由LED阵列、激发滤光片、发射滤光片组成，LED阵列与生物传感器壳体1顶部成45°夹角；信号采集模块6由信号采集孔61、手机62和固定支架63组成，信号采集孔61设于生物传感器壳体1顶部与手机62的摄像头相配合，固定支架63设于生物传感器壳体1顶部外侧用于固定手机62；生物传感器壳体1顶部还设有用于控制孵育模块3的第一开关8和用于控制荧光激发模块5的第二开关9。

其中，生物传感器壳体1包括生物传感器前壳体11和生物传感器后壳体12。电源模块2为可循环使用的电池盒，包括电池盒体21和电池盒底座22，可采用12V电池盒，用于整个生物传感器各用电模块的供电。恒温加热器32为12V微型加热板，用于孵育免疫反应模块4。通过温度显示屏7实时显示孵育温度，便于控制恒温加热器32。采用16通道的表面开放式微流控芯片42作为免疫反应场所，免疫反应在各个通道内并列进行。将罗丹明B抗原-磁珠偶联物(RhB-Ag-Mb)和苏丹红抗原-磁珠偶联物(SuD-Ag-Mb)作为传感器基底，以辣根过氧化物酶标记罗丹明B抗体(RhB-Ab-HRP)和葡萄糖氧化酶标记苏丹红抗体(SuD-Ab-GOx)为信号探针，在外部磁铁的牵引下可灵活通过微流控芯片42通道内的各反应池。芯片托盘41为抽屉式托盘，可用于微流控芯片42的输送，其手柄的设计还考虑了人体力学因素，可以提升用户的舒适感。荧光激发模块5包括第一激发光固定器51和第二激发光固定器52，用于固定荧光激发模块5，LED阵列为60*15mm、2W的绿光LED阵列，激发波长为525nm。手机62包括图像信息采集模块、比色模块与浓度显示模块，用于检测信号的采集、处理以及结果的显示，要求Android 4.3及以上版本。第一开关8用于控制恒温加热器32，第二开关9用于控制LED阵列。

本实施例所提供的生物传感器包括电源模块2、孵育模块3、免疫反应模块4、荧光激发模块5和信号采集模块6，通过电源模块2为孵育模块3和荧光激发模块5提供稳定的电源，孵育模块3可为免疫反应模块4提供恒温加热环境，荧光激发模块5用于底物的荧光激发，信号采集模块6保证采集荧光信号位置的一致性，降低批间差异，提高检测的准确性。通过该生物传感器能够对罗丹明B和苏丹红色素进行实时实地、高精度的快速检测。

实施例4一种检测罗丹明B浓度和苏丹红的方法

1、采用实施例3生物传感器测定标准系列罗丹明B和苏丹红浓度下，生物传感器产生的荧光强度，分别绘制罗丹明B和苏丹红浓度与荧光强度的线性关系曲线；具体包括如下步骤：

(1)将系列浓度的罗丹明B溶液，苏丹红溶液分别与RhB-Ab-HRP，SuD-Ab-GOx溶液混合后，抽取30μL混合液注入芯片第一个液池中，再加入1μL免疫磁珠RhB-Ag-Mb，37℃孵育20分钟。

(2)利用磁铁将磁珠牵引至洗液池，往复清洗磁珠。

(3)将磁珠进一步牵引到含有40μL的Amplex Red/H

(4)关闭恒温加热器，打开LED光源；利用手机检测APP采集荧光信号

(5)利用磁铁把磁珠牵引至洗液池2，往复清洗磁珠。

(6)将磁珠进一步牵引到含有30μL的Glucose(4mM)和Amplex Red/HRP的底物池，37℃孵育30分钟。

(7)打开手机检测app，获取图像照片。具体操作如下。点击“New test”进入检测界面；点击“Take Picture”，获取图像，并点击“√”，将图像转换为灰度值图像；框定样品点后，点击“Analyse”，算出各点的灰度值。

输入各点对应的分析物浓度，点击“Fitting”，出现拟合后的标准曲线；点击“Testing with the curve”，将以上标准曲线设定为规则后，重新出现图像拍摄界面；点击“Take Picture”,获取样品图像，并点击“√”，将图像转换为灰度值图像；框定样品点后，点击“Analyse”，算出各个未知浓度样品的灰度值点击“Testing”，根据灰度值和所建立的标准曲线得出样品点的实际浓度，并命名文件以保存记录。

2、按照步骤(1)所述方法，使用实施例3生物传感器检测辣椒调味品中的罗丹明B和苏丹红色素，利用步骤(1)绘制的线性关系曲线计算得到样品中罗丹明B和苏丹红色素的浓度。该方法能准确、快速、便捷地检测待测样品中罗丹明B和苏丹红色素的浓度。