基于超滤辅助酶解提高样品中D-二聚体质谱检测灵敏度的方法

摘要

本发明涉及一种基于超滤辅助酶解来提高样品中D‑二聚体蛋白质谱检测灵敏度的方法。取D‑二聚体样品，变性之后，转移到分子截留量小于4K的超滤管内，胰蛋白酶酶解过夜，离心去除分子量小于超滤膜分子截留的肽段同时用缓冲液清洗，收集超滤膜上的溶液，使用液相色谱‑质谱联用仪进行后续检测和定量。由于D‑二聚体结构中特异性的交联肽段分子量大，使用该方法可以有效降低D‑二聚体样品的复杂性，从而提高其在质谱检测中的灵敏度。该方法原理简单，容易操作，样品损失少，可以实现完全不依赖抗体对样品中D‑二聚体蛋白检测定量。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究方向复杂生物样品生物标志物检测定量预处理方法技术领域，具体涉及将超滤辅助酶解方法用于血栓类疾病的疾病标志物D-二聚体的质谱检测和定量。

背景技术

作为血液凝结中交联纤维蛋白原水解的重要产物(文献1.Weisel,J.W.,Fibrinogen and fibrin.Advances in protein chemistry,2005.70:p.247-299.)，D-二聚体是不同血栓类疾病的重要疾病标志物，比如深静脉血栓、肺栓塞和弥散性血管内凝血(文献2.Kyrle,P.A.and S.Eichinger,Deep vein thrombosis.Lancet,2005.365(9465):p.1163-1174.文献3.Goldhaber,S.Z.and H.Bounameaux,Pulmonary embolism and deepvein thrombosis.Lancet,2012.379(9828):p.1835-1846.文献4.Voves,C.,W.A.Wuillemin,and S.Zeerleder,International Society on Thrombosis andHaemostasis score for overt disseminated intravascular coagulation predictsorgan dysfunction and fatality in sepsis patients.Blood Coagulation&Fibrinolysis,2006.17(6):p.445-451.)。在凝血级联过程中，首先凝血酶对纤维蛋白原的酶切会使其形成纤维蛋白，并迅速通过非共价相互作用整齐的排列在一起，然后通过XIIIa因子催化这些纤维蛋白的D区域就会通过赖氨酸和谷氨酰胺氨基酸残基形成的异肽键共价交联在一起，最后通过纤溶酶水解，产生一些列纤维蛋白原水解产物(fibrin degradationproducts,FDPs)，其中含有交联的D区域的被称为D-二聚体。作为交联的纤维蛋白的特异性产物，D-二聚体可以表明纤维蛋白的水解程度，因而可以作为不同血栓类疾病的疾病标志物，在临床疾病诊断中具有中要意义。

尽管D-二聚体是临床疾病诊断中一个重要的疾病标志物，但是目前仍然缺乏能够使D-二聚体定量标准化的方法。因为不同水解程度的纤维蛋白产生的D-二聚体具有内在的不均一性，目前常用的基于抗体的检测方法往往因为其识别的表位不同从而检测结果不一致，不同医院使用的不同的D-二聚体检测试剂盒往往具有不同的检测结果和诊断截断值，这使得发展一种不依赖于抗体的D-二聚体检测定量方法非常有必要，这将对促进D-二聚体方法标准化具有重要意义(文献5.Adam,S.S.,N.S.Key,and C.S.Greenberg,D-dimerantigen:current concepts and future prospects.Blood,2009.113(13):p.2878-87.文献6.Kahler,Z.P.and J.A.Kline,Standardizing the D-dimer Assay:Proposing the D-dimer International Managed Ratio.Clin Chem,2015.61(5):p.776-8.)。

在2012年，Wang等发展了一种基于质谱的稳定同位素内标和抗肽抗体捕获富集(SISCAPA)的方法来检测样品中的D-二聚体蛋白，他们使用D-二聚体蛋白结构中特异性的交联肽段来代表D-二聚体蛋白实现对D-二聚体的检测和定量。通过D-二聚体的形成过程，我们可以发现在D-二聚体γ链C末端由XIIIa因子催化交联的交联肽段是特异性区分其他纤维蛋白水解产物和非交联的纤维蛋白原水解产物的唯一肽段(文献7.Wang,W.,et al.,Quantification of circulating D-dimer by peptide immunoaffinity enrichmentand tandem mass spectrometry.Anal Chem,2012.84(15):p.6891-8.)，使用该肽段代表D-二聚体蛋白对其进行定量具有很好的特异性并且可以很好地解决D-二聚体内在的不均一性问题，同时可以很好地和纤维蛋白原其他的水解产物进行区分。因此可以基于该肽段发展一种完全不基于抗体的方法实现对D-二聚体交联肽段的富集并结合质谱进行检测和定量。

本发明以质谱检测D-二聚体蛋白特异性的交联肽段对样品中的D-二聚体蛋白检测和定量为基础，根据该交联肽段的分子量为～4K比常见的胰蛋白酶酶解肽段要大的特征，使用超滤的方式除去分子量较小的肽段，从而有效地降低D-二聚体样品的复杂程度，提高质谱检测的灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、快速实现血栓类疾病的疾病标志物D-二聚体在质谱中高灵敏度检测的方法。

本发明提供的方法是利用D-二聚体样品使用胰蛋白酶酶解产生的D-二聚体蛋白特异性的交联肽段分子量(约4K)比一般胰蛋白酶酶解肽段(1K-3K)大，使用超滤辅助酶解可以除去分子量较小的肽段，有效降低样品的复杂程度，提高D-二聚体在质谱中检测的灵敏度。

具体采用如下技术方案：

所述的基于超滤辅助酶解的具体步骤如下：

(1)取D-二聚体样品(D-二聚体标准蛋白或血浆样品)，在变性液中还原烷基化处理；

(2)将步骤(1)结束后得到的溶液，转移至分子量截留2-4K的超滤管的超滤膜内，离心除去穿过超滤膜的溶液，使用缓冲液清洗；

(3)向步骤(2)结束后得到溶液中补加缓冲液，使用胰蛋白酶酶解；

(4)步骤(3)结束后得到的肽段溶液，离心，同时使用缓冲液反复清洗除去分子量小于超滤管分子截留量的肽段；

(5)收集步骤(4)中超滤管中超滤膜上面的溶液冻干，后续使用液相色谱-质谱联用仪检测酶解得到的D-二聚体特异性的交联肽段进而对D-二聚体蛋白进行定性定量分析。

1.步骤(1)中所述变性液在含有6-8M尿素的缓冲液(pH7.8-8.5)。

2.步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中所述缓冲液要求pH为7.8-8.5.

3.步骤(2)的超滤管分子截留要求为2-4K，根据现在市场上商品化的超滤管型号，优选分子量截留为3K的超滤管但是不限于此分子量截留的超滤管，比3K小的超滤管分子截留量越小样品复杂程度降低越少但同样有一定的效果，比3K大的超滤管分子截留量越大样品复杂程度降低越明显但是可能导致目标肽段的损失。平底和斜底的超滤管均可实现。

4.步骤(2)、步骤(4)中的离心速度控制在10000-14000g，控制最后超滤管膜上剩余液体体积小于50μL。

5.步骤(5)中的质谱检测，数据采集可以使用数据依赖检测模式和靶向检测模式。

6.所使用的靶向检测模式可以为多反应监测模式和平行反应监测模式，如果在步骤(3)之后添加稳定同位素标记的肽段，可以使用同位素内标法实现对样品中的D-二聚体进行绝对定量。

由于D-二聚体结构中特异性的交联肽段分子量大，使用该方法可以有效降低D-二聚体样品的复杂性，从而提高其在质谱检测中的灵敏度。该方法原理简单，容易操作，样品损失少，可以实现完全不依赖抗体对样品中D-二聚体蛋白检测定量。

本发明的优点：

该方法原理简单，操作容易，样品损失少。本发明首次将超滤辅助酶解方法用于降低D-二聚体样品中样品复杂程度，有效地减少了样品中干扰肽段的数目，并结合高分辨的RPLC-MS/MS分析，可以很好地实现对样品中D-二聚体蛋白特异性的交联肽段进行鉴定，并结合PRM(平行反应监测模式)质谱检测模式和同位素内标法实现样品中D-二聚体的质谱绝对定量。该方法可以完全不依赖抗体富集和检测，这将克服目前临床使用的基于抗体的D-二聚体定量方法的缺陷，具有应用于临床血浆中D-二聚体样品检测和定量的巨大潜力。

附图说明

图1为所述D-二聚体样品按照超滤辅助酶解方法进行处理的实验流程。D-二聚体样品首先被变性缓冲液变性，之后转移到分子截留量为3K的超滤管中，使用胰蛋白酶酶解过夜得到D-二聚体特异性的交联肽段，离心除去上清中分子量<～3K的肽段，并使用酶解缓冲液清洗，最后收集超滤膜上的含有D-二聚体交联肽段的溶液进行LC-MS/MS分析。

图2为所述D-二聚体标准蛋白使用该超滤辅助酶解方法处理后质谱检测D-二聚体蛋白特异性交联肽段的结果。(A)该交联肽段+5价态形式的一级同位素分布，(B)该交联肽段+5价态形式在质谱中碎裂的二级谱，(C)D-二聚体蛋白特异性交联肽段的氨基酸组成序列。

图3为所述D-二聚体标准蛋白使用该超滤辅助酶解方法处理后检测到的D-二聚体蛋白特异性肽段的提取色谱峰。(A)超滤管膜上部分溶液检测结果，(B)超滤膜下的溶液，包括酶解后离心流穿液和每次缓冲液清洗的流穿液。

图4为所述D-二聚体样品使用该超滤辅助酶解方法处理和传统溶液酶解方法处理后使用质谱检测的基峰对比。(A)使用超滤辅助酶解方法样品检测结果，(B)使用传统正常溶液酶解处理方法样品检测结果。

图5为所述D-二聚体样品使用该超滤辅助酶解方法处理和传统溶液酶解方法处理质谱检测到D-二聚体特异性交联肽段的提取色谱峰及响应的信噪比。(A)使用超滤辅助酶解方法样品检测结果，(B)使用传统正常溶液酶解处理方法样品检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

超滤辅助酶解方法用于D-二聚体标准蛋白样品中D-二聚体特异性交联肽段的检测：

(1)取D-二聚体标准蛋白样品5μg，溶解在200μL含有8M尿素的100mM碳酸氢铵缓冲溶液(pH 7.8)中，加入终浓度为20mM二硫苏糖醇，37℃水浴中2h，然后加入终浓度为40mM碘代乙酰胺，25℃避光反应40min；

(2)将步骤(1)结束后得到的溶液，转移至分子量截留为3K的超滤管(Millipore：货号UFC500396)内，14000g离心30min除去变性液，再使用100mM碳酸氢铵缓冲液400μL清洗2次，每次14000g离心30min除去；

(3)向步骤(2)结束后得到溶液中加入200μL 100mM碳酸氢铵缓冲液，加入0.5μg的胰蛋白酶，37℃水浴中酶解16h；

(4)步骤(3)结束后得到的肽段溶液，14000g离心30min，同时使用碳酸氢铵缓冲液400μL清洗2遍除去分子量小于～3K的肽段；

(5)收集步骤(5)中超滤管中膜上面的溶液，使用离心冷冻干燥仪冻干样品，放在-20℃保存。

(6)使用40μL 0.1％(v/v)甲酸溶液复溶步骤(5)中冻干肽段样品，上样起始蛋白量0.5μg(对应4μL)进行LC-MS/MS检测。

用于对比的传统溶液酶解方法酶解D-二聚体蛋白进行D-二聚体交联肽段的检测：

(1)取D-二聚体标准蛋白样品5μg，溶解在200μL含有8M尿素的100mM碳酸氢铵缓冲溶液(pH 7.8)中，加入终浓度为20mM二硫苏糖醇，37℃水浴中2h，然后加入终浓度为40mM碘代乙酰胺，25℃避光反应40min；

(2)向步骤(1)中得到的溶液中加入1mL 100mM碳酸氢铵缓冲液对变性溶液进行稀释，然后加入0.5μg的胰蛋白酶，37℃水浴中酶解16h；

(3)向步骤(2)中酶解之后的溶液中加入三氟乙酸溶液将pH调至3，然后使用C18固相萃取柱进行除盐，并将除盐洗脱的溶液使用离心冷冻干燥仪进行冻干，-20℃保存等待检测；

(4)使用40μL 0.1％(v/v)甲酸溶液复溶步骤(3)中冻干肽段样品，上样起始蛋白量0.5μg(对应4μL)进行LC-MS/MS检测。

图2为该D-二聚体标准蛋白样品中D-二聚体蛋白特异性交联肽段的检测结果(A)该交联肽段+5价态形式的一级同位素分布，可以计算其精确分子量为3995.9755，与该交联肽段(氨基酸序列结果为图2C)的理论计算分子量3995.9839直接偏差只有2ppm。(B)该交联肽段+5价态形式在质谱中碎裂的二级谱，可以由二级谱碎片离子确认该检测结果为D-二聚体蛋白特异性的交联肽段。

图3中的提取色谱峰中，保留时间为41.20min处为所检测的D-二聚体特异性交联肽段的峰，通过对比可以确定只有在超滤管上面的溶液(A)可以检测到该D-二聚体蛋白特异性的交联肽段，在流穿液中没有该交联肽段的峰，证明该超滤辅助酶解方法具有很高的回收率，基本不会造成目标肽段的损失。

图4为所述D-二聚体样品使用该超滤辅助酶解方法处理和传统溶液酶解方法处理使用质谱检测的基峰对，可以看出通过该超滤辅助酶解方法处理后样品复杂程度大大降低。图5两种方法中该交联肽段的提取色谱峰对比可以发现，使用超滤辅助酶解方法检测的信噪比比传统溶液酶解方法的高三倍多，说明使用所述超滤辅助酶解方法可以有效降低D-二聚体样品的复杂程度，大大提高其在质谱检测和定量的灵敏度，具有应用于更复杂的样品中D-二聚体蛋白检测的潜力。

总之，本发明为一种基于超滤辅助酶解来提高样品中D-二聚体质谱检测灵敏度的方法，通过合适分子截流量的超滤管可以实现对D-二聚体特异性交联肽段的富集，降低样品的复杂程度。该方法原理简单，容易操作，样品损失少，可以实现完全不依赖抗体对样品中D-二聚体蛋白检测定量。