单细胞转录组与翻译组联合测序的多组学方法

摘要

本发明提出了同时进行转录组测序和翻译组测序的方法，其特征在于，包括：将细胞与裂解缓冲液进行第一步裂解处理，以便得到第一裂解液；混匀并离心后，取上清液中部分所述第一裂解液，作为转录组模板，取剩余部分所述上清液与所述裂解缓冲液进行第二裂解处理，以便得到第二裂解液；将所述第二裂解液进行离心，收集上清液，作为翻译组模板；利用所述转录组模板获得转录组cDNA文库，并对所述转录组cDNA文库进行测序；从所述翻译组模板中提取出核糖体保护的RNA片段，并对所述核糖体保护的RNA片段进行建库及测序。本方法能够同时获得高质量的全基因组范围的转录组和翻译组数据，尤其适用于单细胞，从而为了解单细胞转录、翻译层次的协同调控提供可能性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及同时进行转录组测序和翻译组测序的方法。

背景技术

近年来，随着二代测序技术的发展，许多高通量测序技术的出现正在帮助人们深入了解生物学中的各个过程。对于基因表达调控相关研究来说，涌现了大量基于测量DNA、mRNA水平的组学技术。其中单细胞转录组的方法自2009年首次建立，经历了一系列优化，到今天已经被广泛应用于各类生物学研究过程中。但单细胞转录组测序并不能准确反映各基因编码的蛋白质在细胞中的丰度，因为每个基因的mRNA的翻译效率和速率是不同的，并且在特殊的生物学过程中，还存在细胞中的mRNA合成后被储存在细胞中而不被翻译的情况；并且每个基因的mRNA序列并不能反映其翻译出的蛋白所用的开放阅读框(open readingframe)。因而，生物学研究工作者迫切需要一种能在全基因组水平检测细胞内蛋白质合成的方法。

翻译作为基因表达中重要的一环，实际上比转录更能直接反映蛋白质表达的情况，了解不同细胞、不同的发育过程中的翻译组也将会帮助了解生物学规律以及帮助疾病的治疗。目前，已经有研究组开发了一种能定量检测细胞内蛋白质翻译的核糖体图谱技术(ribosome profiling)，对于核糖体保护的片段，即正在翻译的核糖体占据着mRNA的～30nt的一段核苷酸，进行建库测序，从而确定正在翻译的核糖体的精确位置及其这些糖体保护的片段的丰度。然而由于技术的限制，目前仍然需要收集10

对于发育或疾病过程中具有高异质性的细胞而言，利用大量细胞进行测序只能为我们提供一个平均化的结果而不能反映每个细胞的差别。而单细胞测序技术能为我们提供更多有用的信息，使我们更好地了解生物学过程的细节。近年来，随着单细胞组学技术的涌现，单细胞多组学的概念也应运而生，即结合两种或两种以上组学研究方法，如基因组、转录组、翻译组、蛋白组、表观遗传修饰组等，对于生物样本进行系统性的研究。一个高效的多组学技术不仅能帮助我们了解每个细胞异质性的状态，同时能为我们提供多维度的生物学信息，更有利于我们了解其背后的生物学调控规律。然而囿于技术瓶颈的限制，现有的单细胞多组学技术主要着眼于DNA、mRNA、DNA和染色质修饰等层面的结合，但却少有对于蛋白翻译或者蛋白水平层面的研究。尽管有课题组基于抗体标记蛋白抗原的方式尝试过将转录组与蛋白质组结合起来，但也只能检测到几十种丰度较高的蛋白，而不能将全基因组水平蛋白质的翻译和转录联系起来共同进行研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术瓶颈。为此，本发明提出了同时进行转录组测序和翻译组测序的方法，该方法能在较短时间(2～3天)内同时实现对于细胞的mRNA和核糖体保护的RNA片段测序文库的构建，获得高质量的全基因组范围的转录组和翻译组数据，尤其适用于单细胞，从而为了解单细胞转录、翻译层次的协同调控提供可能性。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种同时进行转录组测序和翻译组测序的方法包括：将细胞与裂解缓冲液进行第一裂解处理，以便得到第一裂解液；混匀并离心后，取上清液中部分所述第一裂解液，作为转录组模板，取剩余部分所述上清液与所述裂解缓冲液进行第二裂解处理，以便得到第二裂解液；将所述第二裂解液进行离心，收集上清液，作为翻译组模板；利用所述转录组模板获得转录组cDNA文库，并对所述转录组cDNA文库进行测序；从所述翻译组模板中提取出核糖体保护的RNA片段，并对所述核糖体保护的RNA片段进行建库及测序。

采用传统的建库方法需要以10

根据本发明的实施例，所述同时进行转录组测序和翻译组测序的方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述细胞的个数为1～50个，优选1个。采用根据本发明实施例的方法既可以对大量细胞进行转录组测序和翻译组测序，同样也适用于少量细胞，甚至于极少量细胞，例如2～10个，更甚于单个细胞。现有技术中大多是对大量细胞建库，很少有涉及到极少量细胞，也未涉及到对单个细胞建库，更未公开能够同时获得转录组数据和翻译组数据的技术。利用根据本发明实施例的方法可以获得高质量的单细胞全基因组范围的转录组和翻译组数据，从而为解释单细胞转录、翻译层次的调控提供可能性。

根据本发明的实施例，进行所述第一裂解处理所采用的裂解缓冲液体积为15～25μL，所述转录组模板的体积为1.5～4μL，进行所述第二裂解处理所采用的裂解缓冲液体积为250～400μL。

由于细胞样品个数很少导致裂解液中RNA浓度偏低，而转录组模板直接进行逆转录和扩增，需要的裂解液体积较少，因此就需要转录组模板的RNA浓度要高一些。但是，由于所得到的裂解液中后续作为翻译组模版，需要对其进行一系列的酶切、蔗糖密度梯度离心处理等以获得核糖体保护的RNA片段，因此，所需要的裂解液体积较多。那么，若将细胞仅进行一次裂解处理以同时满足转录组模板和翻译组模板的要求，则需要添加大量裂解缓冲液，这样势必会对本来含量就很少的RNA体系产生稀释作用，导致转录组模板浓度过低，无法满足后续实验要求。因此，通过控制第一次裂解处理和第二次裂解处理所采用的裂解缓冲液体积，使得转录组模板中mRNA浓度较高，满足后续扩增及建库要求，翻译组模板体积大，满足后续蔗糖密度梯度离心、提取及纯化目的。

根据本发明的实施例，所述第一裂解处理的时间为5～15分钟，所述第二裂解处理的时间为5～15分钟。由此，在此第一裂解处理条件下获得具有代表性反映出细胞转录组情况的mRNA，在此第二次裂解处理条件下能让细胞进一步裂解得更为充分，便于后续更好地捕捉所有核糖体结合的mRNA，同时也将反应体积扩大到适合后续酶切、蔗糖密度梯度离心的操作需求。

根据本发明的实施例，所述裂解缓冲液包括：15～25mM的Tris-HCl，pH＝7.4；100～200mM的NaCl；2～8mM的MgCl

根据本发明的实施例，所述转录组cDNA文库是通过下列方式获得的：将所述转录组的模板进行逆转录，以便得到逆转录产物；将所述逆转录产物进行预扩增，以便得到转录组cDNA；对所述转录组cDNA进行建库，以便得到转录组cDNA文库；其中，所述预扩增的程序中循环次数为15～20次。发明人经过大量实验得到上述较优预扩增程序中的循环次数，由于样品细胞数量较少，使得到的裂解液中mRNA浓度偏低，循环15～20次时，能够使得到的cDNA浓度最佳，建库效果最好。若循环次数过多，所得浓度过高的话，在后续建库操作时需要进行大量稀释。

根据本发明的实施例，所述核糖体保护的RNA片段是通过下列方式获得的：(1)利用核糖核酸酶对所述翻译组的模板进行酶切处理，并将所得到的酶切液加入到蔗糖缓冲液表面，进行离心处理，收集沉淀物；(2)将所述沉淀物进行纯化处理，以便得到核糖体保护的RNA粗提液；(3)将所述粗提液进行电泳，收集预定区域的凝胶切片，并从所述凝胶切片中提取核糖体保护的RNA。由此，以便获得纯度和得率较高的核糖体保护的RNA。

根据本发明的实施例，步骤(1)中，采用RNase I酶对所述裂解液进行酶切处理，其中，所述RNase I酶的用量为0.5～1.5μL，优选1.0μL。由此，利用RNase I酶使裂解液中的RNA降解，而被核糖体保护的RNA片段得以保留。

在酶切反应中，往往加入过量的酶会导致过度消化，从而导致无法获得足够的片段进行下一步实验，而过少的酶量则使得反应不完全，获得的片段不完全是所需要的目的片段，导致影响实验结果。发明人通过以10个小鼠胚胎干细胞细胞和10个小鼠胚胎干细胞进行实验，分别加入了2μL、1μL、0.5μL和0.1μL的酶量进行了实验，实验结果表明，0.5μL和1μL的结果好于2μL或是0.1μL，并且在两个细胞数中结果比较一致。

根据本发明的实施例，步骤(1)进一步包括：将所述蔗糖缓冲液加入到离心管中，然后将所述酶切液转移至所述蔗糖缓冲液表面，2～6℃下以200000～1003000g的转速离心1.5～6小时，从所述离心管中吸取上清液，用团块缓冲液冲洗沉淀直至沉淀溶解；其中，所述团块缓冲液包括：含有0.5～1.5质量％SDS的浓度为5～15mM、pH值为7～8的Tris缓冲液。核糖体复合物能够在上述蔗糖缓冲液中经过密度梯度离心沉淀下来，由此，以达到分离目的。但是，沉淀后的核糖体经离心后会贴在离心管的侧壁上，不便于后续转移。进而，发明人经过大量实验发现，贴壁的核糖体沉淀可以在含有上述团块缓冲液的浸泡和吹吸混匀下与管壁分离，由此，便于进行后续操作。另外，发明人惊奇地发现，离心处理条件会影响后续测序数据的质量，当采用200000～1003000g的转速离心1.5～6小时，测序数据质量较好。

根据本发明的实施例，步骤(2)中，所述纯化处理包括：将所述沉淀物依次用TRIzol和氯仿混匀和静置，并将所得到的混合液进行离心处理，收集上清液；向所述上清液中加入异丙醇和肝糖原，静置，离心，弃去上清液，用乙醇将沉淀悬浮，离心，弃去上清液，使沉淀干燥，再用水溶解所述沉淀，以便得到所述核糖体保护的RNA粗提液。由此，以达到初步纯化的目的。

根据本发明的实施例，步骤(3)中，采用凝胶进行电泳，每块凝胶上样一种粗提液，并且不上样marker溶液。由于粗提液中RNA量很少，因此，为了防止样品在跑胶过程中的相互污染，一个样品准备一块胶。并且，由于marker溶液中的RNA浓度很高，为了避免其在跑胶过程中污染含有少量RNA的样品，不上样marker溶液。具体地，可以在相同的电泳条件下进行预实验，单独上样marker溶液，以确定不同长度RNA的位置，然后将该预实验的胶片与样品跑胶后的胶片进行比对，以便确定样品中预定长度RNA所在的胶片位置。

根据本发明的实施例，利用TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for

在本发明的另一方面，本发明提出了另一种同时对单细胞进行转录组测序和翻译组测序的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

包括：

(1)提供如下试剂：

多核糖体缓冲液，包括：20mM的Tris-HCl，pH＝7.4；150mM的NaCl；5mM的MgCl

裂解缓冲液，包括：1×所述多核糖体缓冲液、1质量％的Triton-X 100；25U/mL的脱氧核糖核酸酶；

蔗糖缓冲溶液，包括：1×多核糖体缓冲液；1M的蔗糖；20U/mL的RNA酶抑制剂；

RNA凝胶提取缓冲液，包括：300mM醋酸钠；1M的NaCl；0.05质量％的Tween；0.5mM的EDTA；

团块缓冲液，包括：1质量％的SDS；10mM的Tirs，pH＝7.5；

(2)制备细胞裂解液：

将单细胞样品置于1.5mL离心管管底；

将20μL冰冷的裂解缓冲液加入所述细胞样品中，轻微震荡，将离心管在冰上孵育10分钟后，离心，收集上清液；

从获得的所述上清液中吸取2μL作为转录组模版；

将300μL冰冷的裂解缓冲液补加入含有剩余上清液的离心管中，混匀，冰上孵育10分钟；

将所述离心管在20,000g转速下4℃离心10分钟，收集上清液，以便得到翻译组模板；

(3)转录组建库和测序：

将2μL所述转录组模版加入200μL RNase-free的PCR管中，并向其中加入1μL 10μMoligo-dT引物和1μL 2.5mM dNTP mix，置于PCR仪中72℃静置3分钟，之后迅速放入冰上冷却；

向样品中加入如下逆转录反应混合液：0.5μL SuperScript II reversetranscriptase、0.25μL RNase inhibitor、2μL 5×SuperScript II first-strandbuffer、0.5μL 100mM DTT、2μL 5M Betaine、0.06μL 1M MgCl2、0.1μL 100μM TemplateSwitch Oligo和0.29μL RNase-free的水；震荡混匀后置于PCR仪中进行如下逆转录反应：42℃90分钟；50℃2分钟，42℃2分钟，循环10次；70℃15分钟；保持在4℃；

向上一步所得到的混合液中加入如下预扩增反应混合液：12.5μL KAPA HiFiHotStart Ready Mix、0.25μL ISPCR primer和2.25μL RNase-free的水，震荡混匀后置于PCR仪中进行如下预扩增反应：98℃3分钟；98℃20秒，67℃15秒，72℃6分钟，循环18次；72℃5分钟；保持在4℃；

用

用

将所述转录组cDNA文库进行测序；

(4)翻译组建库和测序：

1)向装有所述翻译组模板的离心管中加入1μLRNase I，在22℃下，用混匀仪以1000rpm的转速晃动45分钟；

2)加入10μL RNase抑制剂，中止核酸酶消化，得到裂解液；

3)吸取700μL所述蔗糖缓冲溶液置于离心管底，缓慢的将上一步的300μL裂解液转移至蔗糖缓冲溶液顶部，将离心管置于离心机的转子中，在4℃，26,0000g条件下离心4小时，沉淀核糖体；

4)从所述转子上取下离心管，弃去管中的上清液，用50μL所述团块缓冲液冲洗核糖体团块所在的位置，直至完全溶解，再将溶解液转移至新的离心管中；

5)加入1mL TRIzol，混匀，室温放置5分钟，再加入200μL的氯仿，混匀后室温放置2分钟，在4℃，12,000g的条件下离心10分钟，收集上清液于新的离心管中，向离心管中加入750μL的异丙醇和1μL的肝糖原；

6)在-20℃放置30分钟；在离心机中，4℃，最高转速的条件下离心40分钟，弃去液体，用80％的乙醇将沉淀漂浮起来，离心5分钟后弃去上清，将盖敞开，晾干沉淀；

7)用6μL不含RNase的水溶解，即得到核糖体保护的RNA粗提液；

8)准备15％的尿素-TBE-PAGE胶，冲洗TBE胶的上样孔，吹走多余的尿素，在1×TBE溶液中预先在210V下进行电泳20分钟；

9)在所述粗提液中加入6μL 2×变性上样缓冲液，在80℃下将样品变性90秒；

10)再次冲洗上样孔，上样上一步经变性处理后的样品，每个样品仅上样一块胶，且不上样marker溶液；

11)于210V电压下电泳分离65分钟，至深蓝色染料跑出胶时停止电泳；

12)确定样品所在的泳道，从淡蓝色染料下开始，切下一段胶块，放入不含RNase的1.5mL离心管中；

13)将所述胶块上长度为29～34nt的RNA聚集区域切下，放入一个新的离心管中；

14)向离心管中加入400μL RNA凝胶提取缓冲液，在-80放置30分钟；

15)将离心管在22℃的恒温混匀仪内，1000rpm，轻轻混合6～8小时；

16)离心，收集管底部的液体，将400μL液体转移至干净的离心管中；

17)向离心管中加入500μL异丙醇，再加入1μL肝糖原，颠倒混匀，重复步骤6)，并用4μL不含RNase的水溶解RNA作为建库模版；

18)利用diagenode公司的CAT Small RNA-seq kit将所述纯化RNA建库，并对获得的文库进行测序。

利用本发明的方法能在较短时间(2～3天)内同时实现对于单个细胞的mRNA和核糖体保护的RNA片段测序文库的构建，获得高质量的单细胞全基因组范围的转录组和翻译组数据，从而为了解单细胞转录、翻译层次的协同调控提供可能性。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例对于1个小鼠GV卵细胞的转录组测序文库检测到的基因数目与常规转录组建库方法对于10个小鼠GV卵检测到的基因数目比较分析示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例对于1个小鼠GV卵细胞的翻译组测序文库检测到的基因数目与未联合转录组进行的本发明建库方法对于100个小鼠GV卵检测到的基因数目比较分析示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例对于1个小鼠GV卵细胞的转录组测序文库与常规转录组建库方法对于10个小鼠GV卵的转录组基因表达谱的相关性比较分析示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例对于1个小鼠GV卵细胞的翻译组测序文库与未联合转录组进行的建库方法对于100个小鼠GV卵的翻译组基因表达谱的相关性比较分析示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例对于1个小鼠GV卵细胞的翻译组测序文库与未联合转录组进行的建库方法对于100个小鼠GV卵的翻译组基因表达谱的翻译组数据中有周期性的片段的占比比较分析示意图；

图6显示了根据本发明一个实施例对于1个小鼠GV卵细胞的翻译组测序文库与未联合转录组进行的建库方法对于100个小鼠GV卵的翻译组基因表达谱的翻译组数据中比对到基因上片段在编码区以及5’和3’非编码区的比例比较分析示意图；

图7显示了根据本发明一个实施例对于1个小鼠GV卵细胞的翻译组测序文库与未联合转录组进行的本发明建库方法对于100个小鼠GV卵的翻译组基因表达谱的翻译组数据中比对到5’和3’非编码区的比例比较分析示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

实施例1

一、试剂准备

1、多核糖体缓冲液

20mM Tris-HCl，pH＝7.4

150mM NaCl

5mM MgCl

1mM DTT

100μg/mL CHX

2、裂解液

1×多核糖体缓冲液

1质量％Triton-X 100

25U/mL Turbo DNase

3、蔗糖缓冲溶液

1×多核糖体缓冲液

1M蔗糖

20U/mL SUPERase.In

4、RNA凝胶提取缓冲液

300mM醋酸钠，pH值为5.5

0.25质量％SDS

1mM EDTA

5、团块缓冲液

1质量％SDS

10mM Tirs，pH＝7.5

二、细胞裂解液的准备

1.将细胞样品置于1.5mLRNase/DNase-free的EP管管底，所包含的液体体积尽量不要超过2μL。

2.将20μL冰冷的裂解缓冲液加入样品中，轻微震荡，将离心管在冰上孵育10分钟后，离心，收集上清液。

3.吸取2μL上清液作为转录组的模版。

4.再将300μL冰冷的裂解缓冲液补加入含有剩余上清液的EP管。

5.适当混匀，来回倒动EP管，将EP管在冰上孵育10分钟。

6.将EP管在20,000g转速下4℃离心10分钟，小心回收上清液。

7.将上清液放在一个新的EP管中。

三、转录组建库方法

1.将步骤二的第3步得到的2μL转录组模版加入200μLRNase/DNase-free的PCR管中，并向其中加入1μL 10μMoligo-dT引物和1μL dNTP mix(2.5mM each)。

2.将样品震荡混匀后置于PCR仪中72℃静置3分钟，之后迅速放入冰上冷却。

3.轻微离心后，向样品中加入逆转录反应混合液(0.5μLSuperScript II reversetranscriptase(200U/μL)、0.25μLRNase inhibitor(40U/μL)、2μL 5x SuperScript IIfirst-strand buffer、0.5μL 100mM DTT、2μL5M Betaine,0.06μL 1M MgCl

4.将样品震荡混匀并轻微离心后置于PCR仪中进行如下逆转录反应，第一步：42℃90分钟，第二步(循环10次)：50℃2分钟，42℃2分钟，第三步：70℃15分钟，第四步：保持在4℃。

5.轻微离心后，向第4步样品中加入预扩增反应混合液(12.5μLKAPAHiFiHotStart Ready Mix(2x)、0.25μLISPCR primer、2.25μLRNase-free的水)。

6.将样品震荡混匀并轻微离心后置于PCR仪中进行如下预扩增反应，第一步：98℃3分钟，第二步(循环18次)：98℃20秒，67℃15秒，72℃6分钟，第三步：72℃5分钟，第四步：保持在4℃。

7.用

8.用

9.将所得到的转录组文库进行二代测序。

四、核糖体保护的RNA片段—翻译组建库方法

1.向步骤二的第7步的离心管加入1μL RNase I(100U/μl)。在22℃下，用恒温混匀仪(Eppendorf

2.加入10μL SUPERase·in RNase抑制剂，中止核酸酶消化。

3.准备超速离心管(与Beckman MLA-150转子适配的2ml离心管)，先吸取700μL蔗糖缓冲溶液置于管底，缓慢的将上一步的300μL裂解液延着离心管壁加至蔗糖溶液顶部，用马克笔在管子的一边竖直标记一条线，将离心管放入转子时将这条线对准离心机的外边缘。

4.采用台式超速离心机(Optima MAX-XP，Beckman)，MLA-150转子(Beckman)，配套的1mL离心管(Beckman)在4℃，26,0000g条件下离心4小时沉淀核糖体。

5.从转子上取下离心管，吸出管中的上清液。

6.用50μL团块缓冲液冲洗核糖体团块所在的位置，直至完全溶解，转移至Invitrogen

7.加入1mL TRIzol抽提RNA，混匀，室温放置5分钟；再加入200μL mL的氯仿，混匀后室温放置2分钟。

8.在离心机中，4℃，12,000g的条件下离心10～15分钟。

9.将上层的水相溶液转移至一个新的EP管中，加入750μL的异丙醇和1μL的20mg/mL糖原(glycogen，RNA grade)。

10.在-20℃放置30分钟，之后以最高转速在4℃条件下离心40分钟以上。吸出上清液，用75～80％的乙醇将沉淀漂浮起来。离心5分钟后吸出上清。将盖敞开，将肝糖原沉淀晾干。

11.用6μLRNase-free的水溶解肝糖原沉淀，即得到核糖体保护的RNA。此时RNA可以在-20℃存储一周或在-80℃储存数月。

12.准备15％的尿素-TBE-PAGE的15孔胶，用注射器冲洗TBE胶的上样孔及其周围两孔，吹走多余的尿素。在1×TBE溶液中预先在210V下进行电泳20～50分钟。

13.在每个步骤11所得样品中加入6μL 2×变性上样缓冲液(Gel loading bufferII,Thermo Fisher)。

14.在80℃下将样品变性90秒，之后迅速放在冰上冷却。

15.再次用注射器仔细冲洗上样孔。上样，对于单细胞样品，每块胶可以间隔较远距离上样2～3种样品，且不上样marker溶液。

16.210V，电泳分离65分钟，至深蓝色染料跑出胶即可。

31free的1.5ml EP管中，并用刀片将胶片切成两半。(注意：为了防止样品之间的污染，每个样品使用一个刀片)

17.将RNA marker划定的29-nt至34-nt区域切下，放入一个新的EP管中。

18.从聚丙烯酰胺凝胶切片中提取RNA

(i)向步骤17的离心管中加入400μL RNA凝胶提取缓冲液，在-80放置30分钟左右。

(ii)将离心管置于22℃的恒温混匀仪内，1000rpm，轻轻混合6-8小时。

(iii)简短离心，收集管底部的液体，将400μL左右液体转移至干净的EP管中。

19.向管中加入500μL异丙醇，再加入1～1.5μL 20mg/mL糖原(glycogen，RNAgrade)，颠倒混匀，沉淀RNA。

20.将RNA用4μL RNase-free水溶解，此时RNA可以在-20℃储存一个月或在-80℃无限期储存。

21.将溶解的RNA基于diagenode公司的CAT Small RNA-seq kit的建库方法进行建库。

22.建库结束后，用

23.将所得翻译组文库进行二代测序。

采用本方法对单个GV期卵母细胞建库得到的转录组文库能捕捉到的转录本对应的基因数目较多(fpkm值大于1的基因有9000-10000个，见图1)，与采用Smart-seq(Picelli,S.et al.Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.Nat.Protoc.(2014))对10个GV期卵母细胞建库结果相近，并且数据的相关性也很强(spearman correlation＝0.92，见图3)，由此，说明本方法得到的转录组能很好的地反映单个GV期卵母细胞的转录组。与此同时，采用本发明对单细胞建库所得到的翻译组文库与采用基于Ribo-seq的方法(Ingolia,N.T.,Ghaemmaghami,S.,Newman,J.R.S.&Weissman,J.S.Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolutionusing ribosome profiling.Science324,218–223(2009))对100个GV期卵母细胞建库所得翻译组文库相比能捕捉到的正在翻译的核糖体保护片段对应的基因数目(fpkm值大于1的基因数有6000-9000个，见图2)也较相近，数据的相关性较强(spearman correlation＝0.69，见图4)。

对于翻译组而言，周期性是非常重要的一个指标，如果在数据中有一定比例的片段具有周期性，则为数据质量好，比例越高说明数据质量越优。与采用现有方法对100个GV期卵母细胞建库所得翻译组文库相比，本实验方法所获得数据质量较好，各样品具有周期性的数据比例较高(见图5)。此外，核糖体图谱数据中，在基因编码区(CDS)的比例越高，说明数据质量越优。与mRNA测序数据相比，核糖体图谱在非翻译区的片段比例会明显降低，一般低于5％为优，同时3’UTR的比例往往比5’UTR的比例更低。图6、图7说明本实验方法所获得翻译组数据质量较好，各样品在编码区的比例均在30％以上，3’UTR的比例均低于5’UTR，并都低于5％。说明本方法亦能较好的地反映单个GV期卵母细胞的翻译组。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。