一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法

摘要

本发明涉及一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法，属于生物工程领域。采用Am607菌株进行鼠李糖脂的生产方法，除在23‑42℃下进行培养和发酵生产外，其他都可以参照传统铜绿假单胞菌发酵鼠李糖脂，包括以下步骤：a)菌种活化；培养1～2天；b)利用种子培养基制备种子液；在23‑42℃培养，培养时间20～48h，测得种子液的OD600在5～6时，接种到装有发酵培养基的发酵罐中；c)将所述种子液接种到发酵培养基中发酵，通过Am607铜绿假单胞菌株在23‑42℃的发酵温度发酵生产鼠李糖脂；发酵液中的底物浓度30‑400g/L，调节pH至7.2。优选在25℃培养；优选发酵温度24℃‑28℃。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产鼠李糖脂的菌株及发酵生产方法，属于生物工程领域。

背景技术

生物表面活性剂来源于微生物和动植物，由亲水基(酸、阳离子、阴离子、单糖、双糖或多糖)和疏水基(饱和、不饱和烃链或脂肪酸)构成。与化学合成表面活性剂相比较，生物表面活性剂化学结构更复杂，功能基团多，具有降低液体表面/界面张力、形成胶束以及两相微乳液等多种表面活性功能，同时具有良好的热稳定性和化学稳定性，且产品本身无毒，环境友好，可被环境微生物降解，具有较好的生物相容性，是典型的环保型＂绿色产品＂。此外，近年研究表明，生物表面活性剂可干扰细胞膜通透性，具有一定的抗菌、抗肿瘤、抗病毒等药理作用和免疫功能，可被开发成新型生物医药和生物农药，对于缓解农药环境污染等问题具有突出作用。因此，环境问题日益严峻，人们越来越重视生物表面活性剂的开发和应用，以期代替常规的化学合成类表面活性剂，使之广泛用于石油工业、生态环境、日化用品、食品和医药工业以及绿色农业等领域。

鼠李糖脂是目前为止研究最为深入的一种阴离子生物表面活性剂，能显著降低水的表面张力改变固体表面的润湿性，具有乳化、破乳、消泡、洗涤、分散与絮凝、抗静电和润滑等多种功能。自然界中可以合成鼠李糖脂的微生物很多，其中常用的微生物是假单胞菌类，尤其以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为主，可以利用多种碳源为底物合成鼠李糖脂，如葡萄糖、蔗糖、甘油、葵花籽油、菜籽油、大豆油等各种植物油。

公开号CN101177696B的中国专利公开了一种鼠李糖脂生物发酵液的工业化制备方法，突变菌株铜绿假单胞菌VTS-1以玉米油为碳源，发酵温度控制在30～34℃。

公开号CN103589765B的中国专利公开了一种制备鼠李糖脂发酵液的方法，发酵温度控制在35-39℃。

公开号CN108342431A的中国专利公开了一种鼠李糖脂的高效发酵工艺的方法，其种子培养和发酵时的温度控制在30℃。

目前，现有利用铜绿假单胞菌，无论是以植物油还是用甘油、乙醇等以及其中的二种或两种以上的混合物为碳源发酵产鼠李糖脂，其发酵温度均在30-39℃，一般发酵温度低于 30℃或高于39℃时菌体的产脂能力都会有大幅度的下降，甚至还会出现没有产物生成的情况。

传统铜绿假单胞菌其最适宜发酵温度为30-37℃。

发明内容

本发明提供出了一种铜绿假单胞菌株，以解决目前铜绿假单孢菌株温度适应范围窄、无法实现低温(25度)发酵的技术问题。

为此，本发明需要保护的技术方案为：

技术方案一

一种铜绿假单胞菌株，该菌株为铜绿假单胞菌Am607(Pseudomonas aeruginosaAm607)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020269。

技术方案二

上述铜绿假单胞菌株的用途，用于生产鼠李糖脂。

技术方案三

上述铜绿假单胞菌株用于生产鼠李糖脂的方法，其特征在于，控制发酵温度23℃-42℃，其他发酵过程和条件控制参照传统铜绿假单胞菌株生产鼠李糖脂的一般方法。

优选，所述发酵温度限制24℃-26℃，是本发明铜绿假单胞菌Am607最适宜高产鼠李糖脂温度条件。

更进一步优选，所述发酵温度限制25℃。

所述铜绿假单胞菌Am607，可以在23-42℃的种子生产温度制备种子液；和/或在23- 42℃的发酵温度发酵生产鼠李糖脂。

所述铜绿假单胞菌Am607，其生产鼠李糖脂为亲水端为一个或者二个鼠李糖，疏水端为链长从C8到C14，包含单键或双键长度相同或不同的脂肪酸链中的一种或多种；

所述鼠李糖脂包括但不限于Rha-C10-C12,Rha-C12-C10，Rha-Rha-C10-C12,Rha-Rha- C12-C10，Rha-Rha-C10-C10，Rha-C8-C10,Rha-C10-C8，Rha-Rha-C8-C10,Rha-Rha-C10-C8， Rha-C10-C10中的一种或多种。

所述铜绿假单胞菌Am607，其发酵的底物包括但不限于是植物油、甘油和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐、烷烃、乙醇、废弃油脂、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和山梨醇中的一种或多种。

所述发酵的底物的添加量为30-400g/L。

举例而非限定，所述铜绿假单胞菌Am607，其发酵的培养基包括：

碳源 30-400g/L

氮源 每种所述氮源浓度为0.5-10g/L

无机盐 每种所述无机盐浓度为0.5-12g/L。

举例而非限定，所述碳源包括或者是植物油、甘油和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐、烷烃、乙醇、废弃油脂、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和山梨醇、中的一种或多种；

举例而非限定，所述氮源包括或者是酵母抽提物、玉米浆、尿素、氨水、硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠和硝酸铵中的一种或多种；

举例而非限定，所述无机盐包括钾盐、钠盐、钙盐、锰盐、锌盐、镁盐和铜盐中的一种或多种；所述钾盐包括氯化钾、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或多种，所述钠盐包括氯化钠、硝酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种或多种，所述钙盐包括氯化钙、硫酸钙、磷酸钙中的一种或多种，所述锰盐包括氯化锰、硫酸锰中的一种或多种，所述锰盐包氯化锌、硫酸锌中的碳酸锌中的一种或多种，所述镁盐包括氯化镁、硫酸镁、碳酸镁中的一种或多种，所述铜盐包括氯化铜、硫酸铜、硝酸铜中的一种或多种。

举例而非限定，所述铜绿假单胞菌Am607，其发酵培养基包括：

所述铜绿假单胞菌Am607，其生产方法包括以下常规步骤：

a)菌种活化；

b)利用种子培养基制备种子液；

c)将所述种子液接种到发酵培养基中发酵。

举例而非限定，所述铜绿假单胞菌Am607的培养基参照传统铜绿假单胞菌发酵鼠李糖脂，举例而非限定，可选用LB培养基。举例而非限定，所述LB培养基包括酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水。

所述铜绿假单胞菌Am607的培养基参照传统铜绿假单胞菌发酵鼠李糖脂，举例而非限定，可选用的种子培养基包括：酵母粉1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，NaCl 5-10g/L；其制备种子液可参照传统铜绿假单胞菌，举例而非限定其培养时间可以20～48h，种子成熟指标为OD

本发明的铜绿假单胞菌株，温度适应性广，最适温度区间较大(该菌株是在25-42℃条件下可以高效发酵产脂)，尤其在低温(温度25℃)下表现最优进行发酵。

本发明铜绿假单胞菌株在环境温度较低(温度25℃)的情况下发酵生产鼠李糖脂，在鼠李糖脂工业生产中，尤其在冬季环境温度较低时不需要为维持铜绿假单胞菌较高的最佳发酵温度(30℃～39℃)需要大量热水来加热，降低了电能消耗、设备投资、人员投入，降低了生产成本且利于节能减排。

附图说明

图1是实施例1中Am607的第一代的菌落照片；

图2是实施例1中Am607的第六代的菌落照片；

图3为实施例及对比例发酵液中鼠李糖脂表面活性剂的比色法检测含量曲线；

图4是由实施例2-7，9-14共12个实施例建立的浓度-温度关系曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，解释说明本发明技术方案。

本申请的发明人通过在油田附近收集部分土壤，从土壤中分离出一株铜绿假单胞菌，命名为Am401。其分离筛选步骤如下：

1.菌种的富集培养

取土壤1g溶到100ml无菌水后，吸取1mL接入于富集培养基中，置37℃恒温震荡培养箱中培养24小时(富集培养基配方为牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、双蒸水1000mL及琼脂20g，pH 7.0～7.2)；

2.分离纯化

分离纯化：

将富集培养后得到的菌悬液稀释1000倍-1000000倍后，吸取0.1ml菌悬液进行血琼脂平板(此平板购于上海生工)涂布，于37℃恒温培养箱中培养48小时，挑选菌落周围溶血圈大的菌株LB摇瓶培养后采用相同的方法涂布到蓝平板(硫酸铵0.1％，硝酸钠0.2％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾1％，磷酸氢二钠0.4％，酵母粉0.05％及余量水，pH 7.0～ 7.2，浸有原油的粗滤纸)后分离纯化培养48小时，

菌株：铜绿假单胞菌Am607(Pseudomonas aeruginosa Am607)

保藏日期：2020年07月03日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)

保藏编号：CCTCC NO:M 2020269

采用

a)菌种活化；

摇床培养1～2天；菌种活化的培养基是LB培养基，包括酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水。

b)利用种子培养基制备种子液；

在23-42℃培养，优选在25℃培养，培养时间20～48h，测得种子液的OD

c)将所述种子液接种到发酵培养基中发酵，通过

实施例1

本发明的铜绿假单胞菌

实施例2

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

实施例3

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

实施例4

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

实施例5

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

实施例6

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

实施例7

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

实施例8

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

实施例9

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

实施例10

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

实施例11

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；在25℃条件下培养36h，测得种子液的OD

实施例12

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

实施例13

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

实施例14

取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

综上实施例2-14可知，本发明菌株能在较宽的温度范围产下鼠李糖脂，其产量在接近 25度温度表现异常优异，见图4所示。

对比例1

取已有的铜绿假单胞菌株1支(保藏号CGMCC NO:1.10452)甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

对比例2

生产菌相同于对比例1，也选择已有的铜绿假单胞菌株，其保藏号CGMCC NO:1.10452。

取1支BNCC139674甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

对比例3

生产菌相同于对比例1，也选择已有的铜绿假单胞菌株，其保藏号CGMCC NO:1.10452。

取1支BNCC139674甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

对比例4

生产菌相同于对比例1，也选择已有的铜绿假单胞菌株，其保藏号CGMCC NO:1.10452。取1支甘油管种子接入种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH自然，余量为水；

铜绿假单胞菌株CGMCC NO:1.10452作为一种典型的产鼠李糖脂模式菌株，维持该铜绿假单胞菌较高的最佳发酵温度30℃～37℃。由对比例1-4可知，虽在接近25度温度下还尚能产鼠李糖脂，但其产量表现不佳。

以上各个实施例及对比例中所使用的发酵液中鼠李糖脂含量的测定方法：

发酵液中鼠李糖脂表面活性剂的比色法检测含量：

标准品溶液的配置：称取干燥恒重的鼠李糖标品，用去离子水溶解，定容于容量瓶，配置成终浓度为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的标准品溶液。

蒽酮试剂的制备：取蒽酮0.20g溶于100mL 85％的硫酸中。

检测方法：精确取标准品或发酵液1mL置于试管中，于冰水浴中加入0.2％的硫酸—蒽酮试剂4mL，加完后混合均匀浸入沸水浴中，15min后取出，用自来水冷却，室温放置20min,于620nm处测吸光值。标准品的空白用水代替鼠李糖标准品，发酵液的空白以未接种的发酵培养基代替发酵液。

1).绘制标准曲线：如图1所示。

以鼠李糖浓度为纵坐标y，吸光度为横坐标x做回归处理，得回归方程 y＝137.53x+7.8193，相关系数R＝0.9995。鼠李糖浓度在20-100mg/L时与吸光度呈现良好的线性关系。

2).发酵液中生物表面活性剂检测：

精确取标准品或发酵液1mL置于试管中，于冰水浴中加入0.2％的硫酸—蒽酮试剂4mL，加完后混合均匀浸入沸水浴中，15min后取出，用自来水冷却，室温放置20min,于620nm处测吸光值。发酵液的空白以未接种的发酵培养基代替发酵液。

鼠李糖脂产量g/L＝(137.53*A+7.8193)*3*n/1000

A:吸光度；n：样品稀释倍数。