TIFA抑制剂在制备用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物中的应用

摘要

本发明提供了TIFA作为靶标在制备用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物中的应用。本申请发现，TIFA在脓毒症肾损伤中的表达明显升高，应用特异性siRNA序列高效抑制TIFA基因在人肾小管上皮细胞株的表达，经过Western Blotting等方法，证实降低TIFA基因的表达可以抑制细胞因子的表达，流式细胞术显示si‑TIFA能恢复HK‑2细胞线粒体跨膜电位，减少细胞焦亡。可见，本发明沉默TIFA基因可以作为新靶点在制备改善脓毒症诱导的肾损伤的药物中进行应用，解决了靶点治疗脓毒症诱导的AKI这一关键问题，为制备疗脓毒症AKI的药物提供基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及TIFA作为靶标在制备用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物中的应用。

背景技术

急性肾损伤(AKI)是一种多种病因导致的肾功能急剧丧失，AKI是脓毒症导致死亡的独立危险因素。脓毒症占所有AKI病例的45％-70％。到目前为止，脓毒症AKI尚无特异性治疗方法。因此临床迫切需要开发新的特异性更强的脓毒症AKI治疗药物。

细胞焦亡是对细胞损伤的一种保护性的炎症反应(主机防御和修复)，而炎症反应过度则会加重肾损伤。炎症小体活化既可发生在免疫细胞(主要是巨噬细胞和树突状细胞)中，也发生在一些固有肾细胞(如肾小管上皮细胞)中。细胞焦亡的生化特征主要标志炎症小体的形成、多种Caspase激活、GSDMD高表达以及大量促炎症因子的释放。焦亡经典通路中NLRP3炎症小体被激活并活化Caspase-1，切割GSDMD蛋白N端序列，活化的 Gasdermin蛋白转位到细胞膜上，形成孔洞，随后细胞肿胀，胞质外流，最终导致细胞膜破裂，并释放焦亡相关炎症因子，如IL-1和IL-18。

因此，急需开发一种用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物。

发明内容

本发明目的是提供TIFA作为靶标在制备用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物中的应用，本发明经过试验发现沉默TIFA基因可以作为新靶点在制备改善脓毒症诱导的肾损伤的药物中进行应用，解决了靶点治疗脓毒症诱导的急性肾损伤这一关键问题，为制备疗脓毒症急性肾损伤的药物提供基础。

为实现所述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了TIFA作为靶标在制备用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物中的应用。

进一步地，所述用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物为TIFA抑制剂，所述TIFA 抑制剂干扰TIFA的表达，所述干扰TIFA的表达的机制包括敲除或沉默TIFA编码基因，抑制或降低TIFA的转录和翻译功能，以及干扰TIFA蛋白功能发挥中的至少一种。

进一步地，所述TIFA抑制剂包括化学药物、TIFA抗体、TIFA的小分子抑制剂、含有所述小分子抑制剂的生物材料中的至少一种。

进一步地，所述TIFA的小分子抑制剂包括siRNA、shRNA和sgRNA中的一种。

在本发明的第二方面，提供了TIFA抑制剂在制备用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物中的应用。

在本发明的第三方面，一种用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物，所述药物包括：TIFA抑制剂；所述TIFA抑制剂包括化学药物、TIFA抗体、TIFA的小分子抑制剂、含有所述小分子抑制剂的生物材料中的至少一种。其中，所述生物材料包括含有所述TIFA的小分子抑制剂载体、转化体、病毒等。

进一步地，所述TIFA的小分子抑制剂包括siRNA，所述siRNA的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

在本发明的第四方面，提供了TIFA作为分子标志物在制备脓毒症肾损伤检测试剂盒中的应用。

在本发明的第五方面，提供了TIFA作为分子标志物在制备脓毒症肾损伤检测试剂盒中的应用。

在本发明的第六方面，提供了一种脓毒症肾损伤检测试剂盒，所述试剂盒包括TIFA检测引物，所述的引物的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供TIFA作为靶标在制备用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物中的应用，本发明经过AKI脓毒性模型的大量RNA测序方法，发现TIFA在脓毒症急性肾损伤中的表达明显升高，应用特异性siRNA序列高效抑制TIFA基因在人肾小管上皮细胞株的表达，经过Western Blotting等方法，证实降低TIFA基因的表达可以抑制细胞因子的表达，流式细胞术显示siTIFA能恢复HK-2细胞线粒体跨膜电位，减少细胞焦亡。可见，本发明沉默TIFA基因可以作为新靶点在制备改善脓毒症诱导的急性肾损伤的药物中进行应用，解决了靶点治疗脓毒症诱导的AKI这一关键问题，为制备疗脓毒症AKI的药物提供基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为实施例1中筛选和分析脓毒症诱导的AKI组与对照组之间的DEGs的结果，其中图1A为CLP术后血清肌酐(Scr)检测结果；图1B为CLP术后大鼠肾组织H&E染色证实肾损伤染色结果；图1C为差异调控基因的火山图；图1D为差异表达基因结果；

图2为实施例1中主成分分析(PCA)、M pi和蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络的结果，其中图2A为主成分分析结果；图2B为MPIs基因表达与代谢产物水平之间的相关性结果；图2C为蛋白相互作用结果；

图3为实施例1中G O和K EG G分析的结果，其中图3A为生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)结果；图3B为KEGG富集分析结果；

图4为实施例1中潜在的生物标志物的检测的结果，其中图4A为TIFA和FASN在脓毒症诱导的AKI组尿液中有差异表达的结果；图4B为LPS和ODN处理HK-2细胞后TIFA mRNA表达水平；图4C、4D、4E和4F为TIFA的蛋白表达水平结果；

图5为实施例2中检测结果，其中图5A和图5B为沉默后TIFA的mRNA和蛋白水平结果；图5C为siTIFA组经LPS和ODN处理后HK-2细胞活力恢复的结果；图5D为敲低 TIFA可保护线粒体跨膜电位的结果；图5E为转染TIFA后，ODN处理后annexin v阴性和 pi阳性细胞百分率结果；

图6实施例2中检测结果，图6A和图6B为si-TIFA转入HK-2细胞后，TIFA mRNA 和蛋白水平结果；图6C为敲除TIFA检测il-1β和IL-18水平结果。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

1、第一部分：发现TIFA在脓毒症诱导的急性肾损伤组尿液含量有差异；表明TIFA可以作为分子标志物用于制备脓毒症肾损伤检测试剂盒；具体地：

为了发现新的突变和致病基因，将AKI脓毒性模型的大量RNA测序来描述AKI期间的mRNA谱。在脓毒症肾损伤模型中共鉴定出298个差异表达基因(DEGs)，其中164个基因表达上调，134个基因表达下调。生物信息学分析(Gene Ontology,GO)、代谢-蛋白质相互作用(metabolic-protein interaction,MPIs)和京都基因基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析显示188种蛋白质与代谢产物的相互作用，DEGs主要参与炎症反应和代谢过程。

在寻找DEGs的生物学功能后，我们选择了6个潜在的生物标志物：TIFA、FASN、MCM10、CCNI、BAGS和SLC22A12。在诊断为脓毒症的24小时内，从患者的尿液中检测上述6种生物标志物。TIFA和FASN在脓毒症诱导的AKI组尿液含量有差异：脓毒症诱发的AKI患者的TIFA是无AKI脓毒症患者的1.63倍(p<0.01)；与对照组相比，脓毒症AKI 患者的FASN显著降低0.73倍，表明这些基因可能参与了脓毒症AKI的进展。TIFA是一种参与适应性和先天免疫的接合蛋白，其中TIFA表达上调最为显著。

2、第二部分：发现在脂多糖(LPS)(TLR4配体)和ODN(TLR9配体)处理HK2细胞中，TIFA的表达上调；通过siRNA沉默TIFA基因，经过Western Blotting等方法证实降低TIFA基因的表达可以抑制细胞因子的表达，通过流式细胞术证实沉默TIFA能恢复HK-2细胞线粒体跨膜电位，减少细胞焦亡，即改善脓毒症诱导的肾损伤；表明TIFA的抑制剂可以用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物，具体地：

TLRs可以识别微生物产物，并导致多种信号转导途径，调节炎症反应的性质、大小和持续时间。TLR4和TLR9可被LPS和ODN激活，体外实验检测LPS和ODN处理后HK-2 细胞中TIFA蛋白水平的变化，TIFA的表达呈剂量依赖性增加。与预测一样，在LPS+ODN 双重作用下TIFA在HK2细胞中表达上调。同样，体内实验表明小鼠CLP后18小时肾组织中可检测到TIFA蛋白水平的升高。腹腔注射LPS和ODN后，Traf2和Traf6水平也随之升高。因此，在脓毒症AKI中肾脏的Traf2和Traf6基因表达伴随着TIFA的表达水平显著增加，进一步促进了TIFA小体的形成。

研究其在脂多糖(LPS)(TLR4配体)和ODN(TLR9配体)处理HK2细胞中的作用。LPS和ODN处理后，siTIFA转入HK-2细胞后，GSDMD和Caspase-1水平也降低。沉默TIFA 降低了细胞因子(IL-1和IL-18)的表达。流式细胞术显示siTIFA能恢复HK-2细胞线粒体跨膜电位，减少细胞自缢的特征，如GSDMD。TIFA通过激活线粒体固有凋亡通路而引发焦亡，沉默TIFA基因可改善脓毒症诱导的急性肾损伤。因此，TIFA可能是一种有前景的生物标志物，参与了脓毒性AKI的发展。这些数据表明TIFAs在脓毒症中调节细胞死亡信号。

综上可知，本发明使用mRNA-seq技术来探索脓毒症诱导的AKI中mRNA的表达谱。GO、MPI和KEGG分析显示，DEGs主要参与炎症反应和代谢过程。在分析了DEGs的生物学功能后，进一步在脓毒症患者的尿液中验证了差异基因的表达。TIFA在脓毒症诱导的AKI患者尿中升高，并在焦亡中起重要作用。结果表明，TIFA通过激活线粒体凋亡通路诱导HK-2细胞焦亡，说明沉默TIFA基因可以作为新靶点在制备改善脓毒症诱导的肾损伤的治疗中应用。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的TIFA作为靶标在制备用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物中的应用进行详细说明。

实施例1、TIFA作为分子标志物用于制备脓毒症肾损伤检测试剂盒

1、筛选和分析脓毒症诱导的AKI组与对照组之间的DEGs

(1)构建脓毒症AKI小鼠模型

构建脓毒症AKI小鼠模型：用CLP的方法诱导脓毒症急性肾损伤模型，具体如下：选用8-12周龄的C57BL/6雄性小鼠，麻醉小鼠后，打开腹腔，结扎1/4长度的盲肠，用 22G针头在盲肠部位穿2个孔，挤出大便，逐层关闭腹腔，并进行液体复苏(方法学详见Peng ZY，etal.Crit Care Med.2012Feb；40(2):538-43)。对照组不进行盲肠结扎和穿孔，其余的步骤相同。

(2)血清肌酐(Scr)检测

CLP术后24小时收集血清，使用肌酐检测试剂盒(南京建成)进行血清肌酐(Scr)检测。

肌酐结果如图1A所示，可知CLP组大鼠Scr表达量是对照组的3.17倍。

(3)HE组织切片染色检测

CLP术后24小时，取适量肾脏组织使用4％多聚甲醛固定、石蜡包埋制作病理切片。将石蜡切片经脱蜡、苏木精染色、分化以及蓝化后伊红染色、洗涤脱水以及透明后封片。在光镜下对肾组织病理改变进行观察，显微镜下肾小管损伤定义为：肾小管扩张，刷状缘脱落，空泡变性，节段性基底膜裸露，肾小管细胞坏死。

大鼠肾组织H&E染色证实肾损伤染色结果如图1B所示，可知CLP组肾小管水肿，空泡形成，肾小管扩张，管腔表面的突起。

(4)根据肾脏病理、Scr水平、组织和RNA质量，20例受试者共8份样本(4份CLP 和4份对照)纳入本研究。对CLP处理组和对照组大鼠的肾皮质进行RNA测序。每个样本平均产生3200万个对端reads。使用ODESeq2 R包分析测序数据。通过设置p值阈值<0.05 和foldchange≥2或≤0.5确定各组显著差异显著度(deg)。具体包括：

①RNA分离和定量

根据制造商的说明，使用RNeasy Mini kit(Qiagen,USA)从肾脏皮质中提取总RNA。使用Qubit RNA BR assay(Thermo Fisher Scientific,USA)在Qubit

②高通量测序(NGS)

根据制造商的说明，使用TruSeq mRNA试剂盒为每个样本构建cDNA文库。对cDNA文库进行定量，然后使用NextSeq 500(Illumina,USA)进行配对末端测序。然后处理原始读取以删除适配器序列和低质量读取。

③NGS质量控制和校准

通过高通量测序获得的原始图像数据通过碱基调用分析转换为测序读数。读取质量使用FastQC评估，其中包含用于确定数据质量的信息，低质量读数被丢弃。然后使用HISAT2 (2.0.0版)将过滤后的读数与参考基因组对齐。在应用特征计数为每个转录本生成原始表达计数之前，通过StringTie处理以对齐的读取组装转录本。

④转录组数据分析

Linux平台用于执行所有进一步的生物信息学分析。使用Star Aligner将Fastq文件与从RefSeq浏览器获得的参考基因组(build hg19)进行比对。DESeq2用于估计表达转录本的水平并计算基因的差异表达水平。每个基因的表达水平使用看家基因根据每千碱基转录本的读数进行标准化。

差异调控基因的火山图见图1C。基于edgeR包分析和截断标准(fold change≥2或≤0.5,p 值≤0.05)，在脓毒症诱导的AKI和对照样本中发现了298个差异表达基因，其中164个基因表达上调，134个基因表达下调(图1D)。

⑤基因本体(GO)和通路富集分析

根据基因表达分析的结果，进行通路和GO富集分析以鉴定DEGs的功能作用。使用WebGestalt R进行京都基因和基因组百科全书(KEGG)和GO富集分析。

分析显示188种蛋白质与代谢产物的相互作用，DEGs主要参与炎症反应和代谢过程。

2、主成分分析(PCA)、M pi和蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络

主成分分析是一种统计技术，用于简化光谱数据集和确定最能解释观测差异的主成分 (PCs)。PCA模型基于两台pc，它们汇总了整个数据集80％的变化(图2A)。评分图显示，对照组(0h)与肾损伤大鼠有明显差异。PC1贡献了大部分方差(55％)。CLP组为PC1阳性组，对照组为PC1阴性组。此外，PC2贡献了25％的方差。除样本NC1外，在同一组内的样本基本一致。

为了研究基因表达与代谢产物水平之间的相关性，我们分析了MPIs(图2B)。总的来说，我们鉴定了188种蛋白质与代谢产物的相互作用。许多新的相互作用涉及炎症和代谢过程。细胞色素P450家族4亚家族B成员1(CYP4B1)和胍乙酸甲基转移酶(Gamt)是MPI的核心，是将胍乙酸转化为肌酸的甲基转移酶。CYP4B1是一种单加氧酶，催化药物代谢和胆固醇、类固醇等脂类合成的许多反应。

此外，利用STRING(https://string-db.org/)构建目标DEG的PPI网络，探索系统级合作。 PPI网络由241个唯一表达的节点和147条边组成。Smc4、Uba7和Atp5c1与其他蛋白的相互作用最多(图2C)。

3、GO和KEGG分析

为了阐明这些DEGs的潜在生物学作用，我们分析了GO功能注释分析的三大类，即生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)(图3A)。细胞代谢、初级代谢和有机物代谢过程发生显著变化。大多数这些生物学过程可能发生在细胞质和膜结合的细胞器中。参与蛋白结合、离子结合和底物特异性转运蛋白活性的deg数量增加。KEGG富集分析表明，这些基因与肾脏生理功能相关，如近端小苏打再生、矿物质吸收和胰岛素信号通路均发生显著改变(图3B)。KEGG分析结果中，昼夜节律基因差异最大，基因比为0.1。

4、潜在的生物标志物的检测

在寻找DEGs的生物学功能后，我们选择了6个潜在的生物标志物：TIFA、FASN、MCM10、CCNI、BAGS和SLC22A12。在诊断为脓毒症的24小时内，从患者的尿液中检测上述6种生物标志物，发现在脓毒症AKI模型中TIFA在肾和HK2细胞中的表达上调。具体地：

(1)在武汉大学中南医院，从患有或不患有AKI的脓毒症患者中采集尿液样本。本研究获得了武汉大学中南医院的批准，并获得了所有参与者的知情同意。

(2)人肾近端小管上皮细胞系(HK-2细胞)在37℃含10％FBS和青霉素链霉素的DMEM中，在含5％CO

(3)逆转录-定量PCR分析

使用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2(Vazyme,Inc.,Cat#RC112-01)从 HK2细胞中提取总细胞或组织RNA，并通过Nanodrop分光光度法定量。根据制造商的说明HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)RT Reagent kit试剂盒(Vazyme,Inc., Cat#R123-01)进行逆转录。使用Taq Pro Universal SYBR qPCR MasterMix(Vazyme,Inc., Cat#Q712-02)对cDNA进行实时定量PCR。

采用GAPDH作为内参使用2

GAPDH上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID NO：4)；下游引物 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO：5)；

TIFA上游引物：5’-CAAACAGGTTTCCCGAGTTCA-3’(SEQ ID NO：2)；下游引物 5’-TGTCCACGATC AGATTGGTCTT-3’(SEQ ID NO：3)。

其中，

qRT-PCR所用试剂：2×SYBR Green qPCR Mix。

qRT-PCR所用10ul体系：2×SYBR Green qPCR Mix-5μl，10ng cDNA，TIFA上下游引物1μl，其余用RNase-free水来补齐。

qRT-PCR所用程序：(95℃5min，95℃15s，60℃30s)重复39个循环，95℃15s,65℃到95℃呈0.5℃递增15s。

结果如图4A所示，表明TIFA和FASN在脓毒症诱导的AKI组尿液中含量有差异：脓毒症诱发的AKI患者的TIFA是无AKI脓毒症患者的1.63倍(p<0.01)；与对照组相比，脓毒症AKI患者的FASN显著降低0.73倍，表明这些基因可能参与了脓毒症AKI的进展。

(4)进一步检测LPS和ODN处理后HK-2细胞中TIFA的表达

体外实验，LPS和ODN处理HK-2细胞后采用所述逆转录-定量PCR分析方法进行操作，结果如图4B所示，TIFAmRNA水平随时间增加。据报道，TIFA作为一种适配器蛋白，在IL-1刺激下连接TRAF6和IRAK-1。

(5)检测了TIFA蛋白水平

为了确定转染后TIFA、TRAF2和TRAF6的表达是否受到影响，我们通过WesternBlotting检测了TIFA蛋白水平的变化。Western Blotting的操作步骤为：肾组织均化在冰冷的组织溶解缓冲液中进行。该步骤之后进行30分钟的热解，并在4℃下以10000×g离心20分钟。通过Bicinchoninic Acid(BCA)方法测量蛋白质浓度。使用SDS-PAGE分离蛋白质组分，并将蛋白质转移到PVDF膜上进行免疫印迹。膜在4℃下与针对TIFA(CST，Cat 61358,1:500稀释)、TRAF2(CST，Cat 4724,1:1000稀释)、TRAF6(Abcam，Cat 137452,1:1000 稀释)和Caspase-1(Santa，Cat sc-56036,1:1000稀释)的抗体一起孵育。然后将膜与相应的二级抗体(1:5000稀释度)在室温下孵育2小时。使用增强化学发光检测系统(Vazyme， Inc.，Cat#E412-01/02)测量免疫反应性。GAPDH(1:50000稀释)用作对照。

结果如图4C、4D、4E和4F所示，图4C和图4D中LPS和ODN处理后，TIFA的表达呈剂量依赖性增加。图4E中TIFA在LPS+ODN作用下在HK2细胞中表达上调。图4F 中，CLP后18小时肾组织中可检测到TIFA蛋白水平的升高。小鼠腹腔注射LPS和ODN 后，Traf2和Traf6水平升高。因此，TIFA在脓毒症中肾脏的表达显著增加。

5、脓毒症肾损伤检测试剂盒

由上可知，TIFA可以作为分子标志物用于制备脓毒症肾损伤检测试剂盒；

作为一种可选的实施方式，脓毒症肾损伤检测试剂盒包括：

TIFA检测引物，所述的引物的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

还包括：用于均一化的内参引物、阳性对照模板、阴性对照模板和qPCR反应常规试剂 (所述qPCR反应常规试剂本发明实施例具体采用Taq Pro Universal SYBR qPCRMaster Mix(Vazyme,Inc.,Cat#Q712-02)。

采用实时荧光定量PCR试剂盒用于检测上述分子标记物的方法，包括以下步骤：

以逆转录获得的cDNA为模板，采用所述实时荧光定量PCR试剂盒配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线；所述扩增反应体系包括：SYBR-Green I Premix ExTaq 10μL、如SEQ ID NO：2所示的引物(2μM)0.8μL、如SEQ ID NO：3所示的引物(2μM) 0.8μL、RNase-free water 6.4μL、cDNA2μL。所述扩增程序为：95℃5min，95℃30sec,61.6℃30sec,72℃30sec，除第一步外，其余共计40个循环，获得Ct TIFA；

同时用GAPDH作为均一化参照引物对逆转录合成待检测样本cDNA进行qPCR扩增，获得Ct GAPDH；GAPDH的引物如SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5所示

Ct值是指反应管中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，反映了样本所含的起始拷贝数。起始拷贝数越少，Ct越大，反之则越小。通过计算Ct TIFA-Ct GAPDH，得出ΔCt。

对ΔCt进行分析判断原则为：

将待测样本的ΔCt值与健康对照者样本的ΔCt值进行比较，并进行统计学分析获得P 值，以P<0.05为差异有统计学意义。

若P<0.05，待测样本诊断为脓毒症肾损伤；

若P≥0.05，待测样本不诊断为脓毒症肾损伤。

本发明的IFA检测引物检测TIFA的水平可用于诊断脓毒症肾损伤(AUC＝0.8039，P<0.0001)，灵敏度为84.61％，特异度为87.95％。

实施例2、TIFA作为靶标在制备用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物中的应用

1、涉及沉默TIFA的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示。

siRNA：5’-GAGCTGGGCTACCTAAATA-3’。

2、为了进一步研究TIFA在脓毒症中的作用，将所述TIFA siRNA转染HK-2细胞。采用实施例1所述的方法检测TIFA的mRNA和蛋白水平；

结果如图5A和5B所示，可知TIFA的mRNA和蛋白水平显著降低。

3、线粒体膜电位评价

HK2细胞与预热的CM、4μM的潜在敏感染料JC-1(5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯添加-咪唑基-碳菁碘化物，Yeasen,Inc.,Cat#40706ES60)，并将细胞放回培养箱。15分钟后，将它们用预热的PBS洗涤两次。使用细胞计数器(Beckman，Cytoflex)分析每个样品。在Fl-1通道中检测到JC-1单体的发射，在Fl-2通道中检测到JC-1聚集体。FlowJo 10.5.3软件(Tree Star,Ashland,OR)用于分析数据。

由图5D可知，敲低TIFA可保护线粒体跨膜电位，表现为具有绿色荧光的细胞比例减少，具有红色JC-1荧光的细胞比例增加。

由图5E可知，转染TIFA后，ODN处理后Annexin v阴性和PI阳性细胞百分率下降。LPS组的变化不如ODN组明显。

4、蛋白水平检测

按照上述Western Blotting与实时定量PCR标准操作流程，检测GSDMD、Caspase-1、 TIFA、IL-1β和IL-18表达水平。

由图6A-图6B可知，LPS和ODN处理后，GSDMD和Caspase-1水平也降低。LPS和ODN处理后，siTIFA转入HK-2细胞后，TIFAmRNA和蛋白水平均降低。

5、敲除TIFA检测IL-1β和IL-18水平

siRNA转染的方法具体为：将HK2细胞接种到六孔板(1×10

由图6C可知，敲除TIFA后，IL-1β和IL-18水平显著降低。

这些结果表明，TIFA通过激活线粒体凋亡通路诱导HK-2细胞焦亡。

6、使用Cell Counting Kit-8评估HK-2细胞的活力

由图5C可知，与si-NC组相比，siTIFA组经LPS和ODN处理后HK-2细胞活力恢复。流式细胞术显示siTIFA能恢复HK-2细胞线粒体跨膜电位，减少细胞自缢的特征，如 GSDMD。最近的研究证实，gasdermin家族介导的自燃可由线粒体固有凋亡途径触发。在健康细胞中，JC-1更多地集中在线粒体中，在线粒体中它会形成红色的聚集物，而在细胞质中则以绿色荧光单体的形式存在。线粒体跨膜电位的破坏表现为红色荧光的丧失和绿色荧光的增加。

综上可知，应用特异性siRNA序列高效抑制TIFA基因在人肾小管上皮细胞株的表达，经过Western Blotting等方法，证实降低TIFA基因的表达可以抑制细胞因子的表达，流式细胞术显示siTIFA能恢复HK-2细胞线粒体跨膜电位，减少细胞焦亡。可见，本发明沉默TIFA 基因可以作为新靶点在制备改善脓毒症诱导的肾损伤的药物中进行应用，解决了靶点治疗脓毒症诱导的AKI这一关键问题，为制备治疗脓毒症AKI的药物提供基础。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

<110> 武汉大学中南医院

<120> TIFA作为靶标在制备用于治疗和/或预防脓毒症急性肾损伤的药物中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagctgggct acctaaata 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caaacaggtt tcccgagttc a 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtccacgat cagattggtc tt 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgaag gtcggagtc 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagatggtg atgggatttc 20