一种治疗阿尔兹海默病的外泌体混合液及其制备方法

摘要

本申请涉及阿尔兹海默病治疗药物的技术领域，具体公开了一种治疗阿尔兹海默病的外泌体混合液及其制备方法。所述外泌体混合液包括Exo‑miR‑431和Exo‑miR‑140‑5p‑in；所述外泌体混合液中外泌体含量为(1.5‑10)×1011个/mL。本申请的外泌体混合液可用于阿尔兹海默病的治疗，其具有显著改善阿尔兹海默病的优点。

说明书

技术领域

本申请涉及阿尔兹海默病治疗药物的技术领域，更具体地说，它涉及一种治疗阿尔兹海默病的外泌体混合液及其制备方法。

背景技术

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)俗称老年痴呆，病理特征包括老年斑、神经元纤维缠结和迈纳特基底核的胆碱能神经元丢失，导致海马体萎缩，知觉(包括认知、个性、思想、行为乃至嗅觉和味觉等)逐渐丧失。该疾病的主要病理特征是脑神经元内、外的β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)的逐渐积累并形成斑块，阻隔了神经元之间的正常沟通。阿尔兹海默病的病理机制包括：①淀粉样蛋白假说：M2型小胶质细胞可吞噬Aβ斑块，但Aβ斑块数量过多会导致M2型小胶质细胞功能耗竭而逐渐丧失，并且引起神经毒性等，导致神经元细胞死亡和神经变性。②Tau蛋白假说：Tau蛋白是微管相关蛋白之一，可调节微管蛋白装配体的稳定性。但是阿尔兹海默病患者的Tau蛋白表现为高度磷酸化或者出现突变，在神经细胞处形成神经元纤维缠结或者在树突、轴突处形成线状缠结。③炎症假说：反应性神经胶质增生和神经炎症是阿尔兹海默病的标志。M1型小胶质细胞过度激活后会释放IL-1β和TNF-α等细胞因子，损伤神经元的树突和棘突，进而使得神经突触逐渐丧失。④乙酰胆碱假说：乙酰胆碱是胆碱能神经元重要的神经递质，乙酰胆碱的合成减少直接导致胆碱能神经元的损伤。

基于以上致病假说，目前治疗阿尔兹海默病的药物有：胆碱酯酶抑制剂(加兰他敏、多奈哌齐、重酒石酸卡巴拉汀和四氢氨基吖啶)，受体诘抗剂(美金刚——N-甲基-D-天冬氨酸，N-methyl-D-aspartate，NMDA)。但是以上几种药物难以治愈或者延缓疾病进展，并伴有严重的副作用。随后开发的抗胆碱酯酶(AChE)抑制剂能够缓解疾病症状，但是效果不大，但也为阿尔兹海默病患者带来了治疗的希望。

因此，提供一种新的、治疗效果更显著的药物组合物是必要的。

发明内容

为了提高阿尔兹海默病的治疗效果，本申请提供一种治疗阿尔兹海默病的外泌体混合液及其制备方法。

第一方面，本申请提供一种治疗阿尔兹海默病的外泌体混合液，采用如下的技术方案：

一种治疗阿尔兹海默病的外泌体混合液，所述外泌体混合液包括Exo-miR-431和Exo-miR-140-5p-in；所述外泌体混合液中外泌体含量为(1.5-10)×10

通过采用上述技术方案，以上述两种外泌体(Exo-miR-431和Exo-miR-140-5p-in)协同作用，能够显著改善阿尔兹海默病。其中，Exo-miR-431指的是外泌体miR-431，其内含有外源基因miR-431；Exo-miR-140-5p-in指的是外泌体miR-140-5p-in，其内含有外源基因miR-140-5p-in。以上两种外泌体通过协作抑制M1型小胶质细胞过渡激活并激发M2型小胶质细胞发挥吞噬Aβ斑块的作用，最终显著实现治疗阿尔兹海默病的效果。

可选的，所述外泌体的粒径分布为50-140nm；所述外泌体的中值粒径为59nm，D90为76nm，D10为56nm。

第二方面，本申请提供一种上述述治疗阿尔兹海默病的外泌体混合液的制备方法，采用如下的技术方案：

一种上述述治疗阿尔兹海默病的外泌体混合液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：制备重组慢病毒，所述重组慢病毒上包括基因miR-431、基因miR-140-5p-in、抗性基因和筛选标记基因；

使得重组慢病毒和干细胞接触，在32-38℃下培养，收集上清，收集外泌体，得到外泌体混合液。

通过采用上述技术方案，通过将基因miR-431和基因miR-140-5p-in插入慢病毒后再转染人脂肪间充质干细胞，随后通过培养该人脂肪间充质干细胞得到本申请所需的外泌体。通过将两种基因(基因miR-431和基因miR-140-5p-in)插入慢病毒，这两种基因能够该体系中均高度表达，以获得高产量的基因miR-431和基因miR-140-5p-in。

可选的，所述制备方法还包括将外泌体混合液磁化处理的步骤。

可选的，所述磁化处理的条件包括：磁化强度为5-8A/m，磁化时间为15-30min，磁化温度为0-10℃。

通过采用上述技术方案，以适当的条件对外泌体进行磁化处理，能够通过增大外泌体膜结构的通透性，膜结构外的电荷和能量分布等，最终使得Exo-miR-431和Exo-miR-140-5p-in能够更完全、充分地释放其中的外源基因至靶细胞外，或者使得Exo-miR-431和Exo-miR-140-5p-in能够更好地和靶细胞融合后将外源基因释放至靶细胞内，以发挥其作用。

在该方案中，磁化强度、时间需要控制在一定范围内，否则会对外泌体带来较大的影响，使得功能物质被破坏，反而会带来负面的治疗作用或者无治疗作用。

在一些实施方案中，磁化处理时的磁化强度为5-6.3A/m、5.8-7.6A/m或者6.7-8A/m；在一些实施方案中，磁化处理时的磁化时间为15-19min、17-22min、20-25min、23-27min或者26-30min。

在一些实施例中，磁化处理时的磁化强度为5A/m、5.7A/m、5.7A/m、6.1A/m、6.7A/m、7.5A/m或者8A/m；在一些实施方案中，磁化处理时的磁化时间为15min、16.5min、18.4min、19.6min、20.7min、22.6min、24.3min、26.2min、27.1min、28.5min、29.7min或者30min。

可选的，所述抗性基因为嘌呤霉素抗性基因；

使得重组慢病毒和干细胞接触并在32-38℃下培养时，还包括以含有嘌呤霉素的培养基筛选培养的步骤。

通过采用上述技术方案，以抗性基因筛选含有重组慢病毒的干细胞，实现纯化，以进一步扩大培养目标干细胞。

可选的，所述干细胞选自脂肪间充质干细胞、脐带血间充质干细胞中的任意一种。

可选的，所述重组慢病毒的制备方法包括以下步骤：

基因重组：将基因miR-431、基因miR-140-5p-in、抗性基因和筛选标记基因连接在慢病毒基因上，得到重组慢病毒；

病毒包装：将重组慢病毒和宿主细胞接触，培养，使得重组慢病毒在宿主细胞内包装，随后离心后取上清。

可选的，所述基因miR-431的序列如SEQ ID NO.1，所述基因miR-140-5p-in的序列如SEQ ID NO.2；制备所述重组慢病毒的慢病毒基因序列如SEQ ID NO.3所示。

可选的，抗性基因的序列如SEQ ID NO.4；所述筛选标记基因的序列如SEQ IDNO.5。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、由于本申请通过以Exo-miR-431和Exo-miR-140-5p-in协作治疗阿尔兹海默病，这两种外泌体具有优异的协作效果，以显著改善痴呆小鼠的病症。

2、本申请通过将基因miR-431和基因miR-140-5p-in同时插入慢病毒后转染人脂肪间充质干细胞，随后获得高表达的外泌体Exo-miR-431/140-5p-in，该外泌体内含有大量的外源基因miR-431和外源基因miR-140-5p-in。将该外泌体用于痴呆状小鼠后，两种基因协作下显著改善小鼠相关行为和指标。

3、在将Exo-miR-431/140-5p-in用于治疗前，本申请进一步以磁化处理该外泌体，以进一步改善其治疗效果。

附图说明

图1是实施例1的人脂肪间充质干细胞和普通人脂肪间充质干细胞中基因miR-431和基因miR-140-5p-in的表达水平图；

图2是实施例1得到的外泌体的粒径分布图；

图3是实施例1、对比例5和对比例6的外泌体治疗痴呆小鼠的行为学结果图；

图4是实施例1、对比例5和对比例6的外泌体治疗痴呆小鼠的海马体内炎症相关因子基因表达水平图；

图5是实施例1、对比例5和对比例6的外泌体治疗痴呆小鼠的海马体内组织学检查结果图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明，予以特别说明的是：以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，以下实施例中所用原料除特殊说明外均可来源于普通市售。

本申请中，miR是micro RNA的缩写，指的是微小RNA；Exo是exosome的缩写，指的是外泌体；miR-140-5p-in中的in是inhibitor的缩写，指的是抑制物。

制备例

以下制备例1至制备例7是重组慢病毒的制备例。

制备例1

重组慢病毒的制备方法为：

步骤I：设计基因miR-431，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；设计基因miR-140-5p-in，其基因序列如SEQ ID NO.2所示；准备慢病毒，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；设计嘌呤霉素抗性基因，其基因序列如SEQ ID NO.4；设计绿色荧光蛋白筛选标记基因，其基因序列如SEQ ID NO.5所示。

将基因miR-431和miR-140-5p-in、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒基因上，得到重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。

步骤II：将步骤I得到的重组慢病毒加入培养293T细胞的培养瓶中进行培养，重组慢病毒不断地在293T细胞中包装，随后离心，收集293T细胞培养液的上清液(含有大量包装好的重组慢病毒)，并在-20℃保存备用。

制备例2

本制备例和制备例1的不同之处在于，以基因miR-17-92替换基因miR-431，基因miR-17-92的序列如SEQ ID NO.6所示。其他同制备例1。

具体的，重组慢病毒的制备方法为：

步骤I：设计基因miR-17-92，其基因序列如SEQ ID NO.6所示；设计基因miR-140-5p-in，其基因序列如SEQ ID NO.2所示；慢病毒、嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白筛选标记基因均和制备例1相同。

将基因miR-17-92和miR-140-5p-in、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒基因上，得到重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。

步骤II和制备例1相同。

制备例3

本制备例和制备例1的不同之处在于，以基因miR-17-92替换基因miR-140-5p-in，基因miR-17-92的序列如SEQ ID NO.6所示。其他同制备例1。

具体的，重组慢病毒的制备方法为：

步骤I：设计基因miR-17-92，其基因序列如SEQ ID NO.6所示；设计基因miR-431，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；慢病毒、嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白筛选标记基因均和制备例1相同。

将基因miR-17-92和miR-431、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒基因上，得到重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。

步骤II和制备例1相同。

制备例4

本制备例和制备例1的不同之处在于，以基因miR-30d-5p替换基因miR-140-5p-in，基因miR-30d-5p的序列如SEQ ID NO.7所示。其他同制备例1。

具体的，重组慢病毒的制备方法为：

步骤I：设计基因miR-30d-5p，其基因序列如SEQ ID NO.6所示；设计基因miR-431，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；慢病毒、嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白筛选标记基因均和制备例1相同。

将基因miR-30d-5p和miR-431、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒基因上，得到重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。

步骤II和制备例1相同。

制备例5

本制备例和制备例1的不同之处在于，以基因miR-30d-5p替换基因miR-431，基因miR-30d-5p的序列如SEQ ID NO.7所示。其他同制备例1。

具体的，重组慢病毒的制备方法为：

步骤I：设计基因miR-30d-5p，其基因序列如SEQ ID NO.7所示；设计基因miR-140-5p-in，其基因序列如SEQ ID NO.2所示；慢病毒、嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白筛选标记基因均和制备例1相同。

将基因miR-30d-5p和miR-140-5p-in、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒基因上，得到重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。

步骤II和制备例1相同。

制备例6

本制备例和制备例1的区别在于，不将基因miR-140-5p-in插入慢病毒中，仅仅以基因miR-431插入慢病毒后制备得到重组慢病毒。

具体的，重组慢病毒的制备方法为：

步骤I：基因miR-431、慢病毒、嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白筛选标记基因均同制备例1。

将基因miR-431、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒基因上，得到重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。

步骤II同制备例1。

制备例7

本制备例和制备例1的区别在于，不将基因miR-431插入慢病毒中，仅仅以基因miR-140-5p-in插入慢病毒后制备得到重组慢病毒。

具体的，重组慢病毒的制备方法为：

步骤I：基因miR-140-5p-in、慢病毒、嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白筛选标记基因均同制备例1。

将基因miR-140-5p-in、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒基因上，得到重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。

步骤II同制备例1。

制备例8

脂肪间充质干细胞的制备方法为：

(1)、获得脂肪间充质干细胞的细胞团重悬液：

从整形美容机构获取无菌的脂肪组织，先用0.01mol/L无菌PBS缓冲液冲洗脂肪组织，直至其无血色。然后将脂肪组织用无菌眼科剪刀和镊子清理干净后剪成约1mm

(2)、扩大培养：将步骤(1)中获得的细胞团重悬液在37℃、5Vol.％CO

实施例

实施例1

外泌体混合液的制备方法为：

步骤一、在T175培养瓶内加入人间充质干细胞无血清基础培养基(AM-V SerumFree Medium；货号SC-2013-G-A，天津灏洋)，并转接制备例8制得的人脂肪间充质干细胞，并添加1wt％青链霉素、适量的制备例1制得的重组慢病毒，然后在37℃下培养24h。

步骤二、随后更换T175瓶中的人间充质干细胞无血清基础培养基为人间充质干细胞无血清选择培养基，并添加2μg/mL嘌呤霉素，在37℃下持续筛选培养，直至全部人脂肪间充质干细胞都在荧光显微镜下可见明显的绿色荧光。

步骤三、再继续以人间充质干细胞无血清选择培养基扩增并开始持续收集培养上清液，并以3D Flo Trix viva EXO外泌体收获系统(产自北京华龛公司)将培养上清液浓缩，得到外泌体混合液。

实施例2

本实施例和实施例1的区别在于，在步骤三之后还包括步骤四，具体的，步骤四为：对步骤三得到的外泌体混合液进行磁化处理，具体处理条件是：在磁化强度为6A/m、温度为0℃的条件下磁化20min。其他同实施例1。

对比例

对比例1-6

对比例1-6和实施例1的区别在于重组慢病毒的选择不同。

具体的：

对比例1是以等量的制备例2制得的重组慢病毒替换实施例1的重组慢病毒；

对比例2是以等量的制备例3制得的重组慢病毒替换实施例1的重组慢病毒；

对比例3是以等量的制备例4制得的重组慢病毒替换实施例1的重组慢病毒；

对比例4是以等量的制备例5制得的重组慢病毒替换实施例1的重组慢病毒；

对比例5是以等量的制备例6制得的重组慢病毒替换实施例1的重组慢病毒；

对比例6是以等量的制备例7制得的重组慢病毒替换实施例1的重组慢病毒。

效果表征

1、Realtime-PCR检测

将实施例1的被重组慢病毒感染的人脂肪间充质干细胞与普通脂肪间充质干细胞进行Realtime-PCR检测，结果见图1。从图1的结果可知，实施例1的人脂肪间充质干细胞在转染重组慢病毒后，其基因miR-431和基因miR-140-5p-in在mRNA水平上的表达强度显著提高。其中，基因miR-431在mRNA水平上的表达强度增大了35倍，基因miR-140-5p-in在mRNA水平上的表达强度增大了46倍。这一结果充分表明了该方法能够同时实现基因miR-431和基因miR-140-5p-in在mRNA水平上的高效表达。

2、以纳米颗粒跟踪分析(NTA)的方法检测实施例1浓缩后获得的外泌体混合液的浓度，具体结果见图2。图2的结果表明，Exo-miR-431/140-5p-in的粒径为53-135nm，中值粒径为59nm，D90为76nm，D10为56nm。对比例1和对比例2的检测结果与该结果类似。

3、动物实验

选择6月龄的已出现痴呆症状的APP/PS1小鼠，治疗组分别为Exo-miR-431(施用对比例5的外泌体)、Exo-miR-130-5p-in(施用对比例6的外泌体)和Exo-miR-431/140-5p-in(施用实施例1的外泌体)三组(每组10只)，另外10只6月龄C57BL/6小鼠做正常组，10只未治疗的6月龄APP/PS1小鼠做对照组。治疗1个月后对比四组动物的痴呆相关病情改善，并从炎性介质角度探讨其起效机制。

3.1、行为学评估

3.1.1、对各组小时进行旷场实验和新物体识别实验，结果见图3。结果表明：实施例1小鼠的运动功能和情绪状态都接近正常组，显著优于对比例5、对比例6和对照组。

3.1.2、对各组小鼠进行水迷宫实验，结果见图3。实施例1小鼠的跨平台次数、到达平台所需时间以及平台停留时间都接近正常组，显著好于对比例5、对比例6和对照组。综合评价各组的行为学改善情况，实施例1的外泌体对小鼠病症的改善程度显著优于对比例5和对比例6。

3.2、脑海马体内炎性介质检测

通过qPCR法检测海马组织的炎性细胞因子(IL-1β、TNF-α)的相对mRNA表达水平，具体结果见图4。实施例1小鼠海马组织的炎性细胞因子的mRNA表达水平都接近正常组，显著低于对比例5、对比例6和对照组。说明实施例1的外泌体能够显著抑制IL-1β和TNF-α这两种损伤神经元树突和棘突的细胞因子的基因表达，进而显著降低IL-1β和TNF-α对神经元细胞的损伤，从而治疗阿尔兹海默病。

通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测海马组织，具体结果见图4。该结果表明：实施例1的Aβ斑块对应的mRNA的表达水平都接近正常组，显著低于对比例5、对比例6和对照组。

3.3、脑海马体内组织学检查

通过电子显微镜观察海马组织，具体结果见图5。其中，实施例1小鼠的树突和棘突密度、神经突触数量和密度都与正常组接近，显著多于对比例5、对比例6和对照组的。

总的来说，Exo-miR-431/140-5p-in治疗阿尔兹海默病的效果显著好于Exo-miR-431和Exo-miR-140-5p-in单独治疗的效果。

基于以上研究，本申请进一步研究了实施例2、对比例1-4的外泌体的治疗效果，具体过程及结果如下所述。

选择6月龄的已出现痴呆症状的APP/PS1小鼠，治疗组分别为Exo-miR-431/140-5p-in并且磁化处理(施用实施例2的外泌体)、Exo-miR-17-92/140-5p-in(施用对比例1的外泌体)、Exo-miR-431/17-92(施用对比例2的外泌体)、Exo-miR-431/30d-5p(施用对比例3的外泌体)、Exo-miR-30d-5p/140-5p-in(施用对比例4的外泌体)这五组(每组10只)，另外10只6月龄C57BL/6小鼠做正常组，10只未治疗的6月龄APP/PS1小鼠做对照组。治疗1个月后对比四组动物的痴呆相关病情改善。

4.1、参照上述方法进行行为学评估实验，具体结果见表1。

表1不同方案的小鼠行为学评估实验结果

备注：表1的各组数据为平均值。

从表1的数据结果中看出，以Exo-miR-431/140-5p-in(实施例1和实施例2)治疗小鼠时，能够显著改善痴呆小鼠的行为学特征。对比实施例1和实施例2发现，对Exo-miR-431/140-5p-in做磁化处理后再用于痴呆小鼠治疗，其效果更佳。可能是因为磁化处理本身对外泌体有有一定的作用效果，改善了外泌体的电荷分布、能量分布等，也会对外泌体的膜结构有一定影响，从而影响外泌体膜结构的通透性，使得外泌体内的物质更容易释放，或者更加容易和靶细胞发生膜融合，以更好地将外源基因释放至靶细胞间或者靶细胞内。因此最终带来更好的治疗效果。

但是同时也能发现，并不是以随意两种微小RNA基因插入得到慢病毒的重组慢病毒转染人脂肪间充质干细胞，以制备得到的外泌体治疗痴呆小鼠后，就会获得较好的治疗效果。其中的Exo-miR-17-92具有修复神经细胞的作用，Exo-miR-30d-5p将具有破坏神经细胞作用的M1型小胶质细胞逆转为具有修复神经元作用的M2型小胶质细胞。但是对比例1、对比例4和实施例1的数据结果表明，Exo-miR-140-5p-in与Exo-miR-17-92或者Exo-miR-140-5p-in与Exo-miR-30d-5p协作时难以实现优异的改善痴呆状小鼠行为学的作用。其原因可能是：基因miR-17-92和基因miR-140-5p-in同时插入慢病毒并转染人脂肪间充质干细胞时难以高效表达，因此导致Exo-miR-140-5p-in/17-92的表达产物不够，难以发挥较好的作用；也可能是因为基因miR-17-92和基因miR-140-5p-in同时加入用于治疗痴呆状小鼠时，外源基因miR-17-92和外源基因miR-140-5p-in对小鼠本身基因的调控为无效调控或者负面调控，因此难以实现协作改善痴呆状小鼠行为学的效果。但是对比例2、对比例3和实施例1的数据结果结果表明，Exo-miR-431与Exo-miR-17-92或者Exo-miR-431与Exo-miR-30d-5p协作时同样难以实现优异的改善痴呆状小鼠行为学的作用，其原因可能还是和外源基因表达量或者外源基因调控效果有关。

4.2、参照上述方法进行脑海马体内组织学检查，具体结果见表2。

表2不同方案的小鼠脑海马体内组织学检查结果

备注：表2的各组数据为平均值。

同样的，外源基因的表达量和调控效果的差异，也会使得不同外泌体对痴呆状小鼠海马体内的相关指标有不同的影响结果。表4中对比例1、对比例4和实施例1的数据结果表明，Exo-miR-140-5p-in与Exo-miR-17-92或者Exo-miR-140-5p-in与Exo-miR-30d-5p协作时难以实现优异的改善痴呆状小鼠行为学的作用。对比例2、对比例3和实施例1的数据结果结果表明，Exo-miR-431与Exo-miR-17-92或者Exo-miR-431与Exo-miR-30d-5p协作时同样难以实现优异的改善痴呆状小鼠行为学的作用。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。