一种改善内皮细胞高糖损伤的金乌贼墨多糖及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种改善内皮细胞高糖损伤的金乌贼墨多糖及其制备方法和应用。所述金乌贼墨多糖是由岩藻糖、半乳糖胺、甘露糖、N‑乙酰葡萄糖胺构成的多糖骨架，并在甘露糖的C‑3位上具有葡萄糖醛酸支链，是重均分子量为10～16kDa；硫酸化度为8％～15％的氨基多糖。经实验验证，所述金乌贼墨多糖与同类化合物比较，其能够有效改善内皮细胞状态，保持血管内皮正常滤过功能的作用，同时其出血副作用风险，显著低于同类多糖，更具使用安全性，进而所述金乌贼墨多糖可用于开发糖尿病后期病变辅助治疗药物，填补目前市场上此类产品的空白。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种改善内皮细胞高糖损伤的金乌贼墨多糖及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病是一种由于血糖长时间高出正常水平所引起的全身性进行性疾病，其并发症多且严重。长期血糖增高，会致使大血管、微血管受损，并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等多种组织器官，糖尿病死亡者有一半以上为心脑血管所致。其中糖尿病肾病、糖尿病心血管并发症、糖尿病性脑血管病是主要并发症。目前，临床治疗多以控血糖为主，兼以调节血脂、血小板功能为辅，尚无针对性特效药物。国家药监局最新批准的1类治疗2型糖尿病新药多格列艾汀片也是针对葡糖糖降解的葡萄糖激酶(GK)全激活剂，基本为控糖药，而很少有针对循环系统、泌尿系统造成的器质性损伤的治疗药物。

目前，针对内皮细胞损伤及细胞NO损伤等治疗用化合物数量较多，且种类复杂，以中药提取物为主，但真正能够走上临床开发的较少。而多糖类化合物的治疗效果也取得社会肯定。其中，关注度较大研究比较透彻的肝素类似物已在美国启动四期临床，但其本身为抗血栓药物，具有出血性风险，而对抗葡萄糖损伤，维持内皮组织半透膜特性上作用较弱。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种能够改善内皮细胞高糖损伤的金乌贼墨多糖，其可在高糖损伤状态，维持内皮组织正常滤过作用，并维持内皮细胞正常状态。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种改善内皮细胞高糖损伤的金乌贼墨多糖，是由岩藻糖、半乳糖胺、甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺构成的多糖骨架，并在甘露糖的C-3位上具有葡萄糖醛酸支链；其结构示意式如下：

其中，R

进一步的，所述金乌贼墨多糖的重均分子量为10kDa-16kDa，其硫酸化度为8％～15％。

本发明还提供了所述的金乌贼墨多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)从墨囊中取金乌贼墨，加入缓冲液研磨混悬均匀；

(2)超声处理研磨后的金乌贼墨，低温浸泡后离心，取上清液加入木瓜蛋白酶进行酶解，得到酶解金乌贼墨；

(3)将所述酶解金乌贼墨沸水浴变性后，低温离心取上清液，加入除蛋白剂去除变性蛋白质，离心再次取上清液；

(4)将所述上清液浓缩，分离沉淀得到粗多糖；

(5)将所述粗多糖经纯化分离、透析、冷冻干燥得到金乌贼墨多糖。

进一步的，所述步骤(1)中，金乌贼墨和缓冲液的体积比为0.5～2：1～2。

进一步的，所述步骤(2)中，酶解条件为：木瓜蛋白酶浓度为1‰～3‰，酶解温度为50℃～60℃，孵育时间为1h～2h。

进一步的，所述步骤(3)中，上清液和除蛋白剂的体积比为2～4：0.5～1。

进一步的，所述除蛋白剂为Sevag试剂。

本发明还提供了所述的金乌贼墨多糖在制备治疗血管炎症的药物中的应用。

进一步的，所述血管炎症为由糖尿病引物的血管内皮炎症。

进一步的，所述血管内皮炎症为糖尿病引起的肾小球微血管内皮和肾小管内皮炎症。

进一步的，所述药物中含有的金乌贼墨多糖的浓度为10μg/ml-60μg/ml。

进一步的，所述药物的活性成分为金乌贼墨多糖及其药学上可接受的盐。

进一步的，所述金乌贼墨多糖能够有效改善内皮细胞葡萄糖损伤状态，并维持内皮组织正常滤过功能。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1、本发明选用金乌贼的墨汁作为原料，提取并制备得到了一种新的金乌贼墨多糖，其是由岩藻糖、半乳糖胺、甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺构成的多糖骨架，在甘露糖C-3位上含有一个葡萄糖醛酸，重均分子量为10～16kDa；硫酸化度为8％～15％的氨基多糖。

2、所述金乌贼墨多糖可有效改善内皮细胞状态，保持血管内皮正常滤过功能的作用，可用于治疗长期高血糖造成的血管内皮细胞损伤而致的血管炎症，以及高糖引起的肾小球微血管内皮和肾小管内皮炎症。

3、所述金乌贼墨多糖长期使用出现出血风险显著低于同类药物，更具有安全性。

4、所述金乌贼墨多糖可用于开发糖尿病后期病变辅助治疗药物或保健品，填补目前市场上此类产品的空白。

附图说明

图1为金乌贼多糖的洗脱曲线。

图2为金乌贼墨多糖的红外光谱图。

图3为金乌贼墨多糖对高糖损伤下HUVEC细胞状态的影响；其中A为未损伤对照细胞状态，B为葡萄糖损伤细胞状态，C为加入多糖组细胞状态。

图4为金乌贼墨多糖对高糖损伤下对大鼠主动脉弓内皮损伤改善情况：a:空白组b:模型组c:舒洛地特治疗组d：金乌贼墨多糖治疗组。

具体实施方式

结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

实施例1、金乌贼墨多糖的制备

新鲜的乌贼墨囊储存在-80℃～-50℃，在2℃-5℃解冻，将金乌贼墨和磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.01mol/L，pH 7.4)进行研磨混悬均匀，所述金乌贼墨和磷酸盐缓冲液的用量体积比为1：2。反复进行超声处理研磨后的乌贼墨(每次超声2～10s，间隔5～10s，超声10～100次)，并于2～4℃搅拌浸泡24～72h，24℃，10000rpm，离心20min，收集上清2次。上清液加入1‰～3‰的木瓜蛋白酶，45～65℃进行酶解1～2h。酶解后的乌贼墨汁进行沸水浴变性处理，沸水浴时间为10～30min，冷却后，于4℃、8000rpm，离心40min离心分离上清液。上清液中加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)经搅拌器搅拌20～50min，4℃静置1～2h，离心分离上清去除变性蛋白质，重复操作2～3次。所述上清液和Sevag试剂的用量体积比为4：1，6000～15000rpm离心30～60min。上清液经旋转蒸发浓缩后，加入4倍体积的无水乙醇，于4℃静置1～2h，6000～10000rpm离心10～30min分离沉淀粗多糖。粗多糖经冷冻干燥后的产量为1％～3％。

粗多糖经色谱法进行纯化分离制得目的化合物。将干燥的1g粗多糖SIP溶于5mL蒸馏水，60～80℃加热溶解10～30min，于3000～5000rpm离心5～10min，不溶物重复上述操作，合并2次上清液，经已活化的C18固相萃取小柱去除部分色素，用超纯水洗脱3个柱体积，旋转蒸发浓缩收集液。取1g经C18柱层析后的粗多糖浓缩液上DEAE-52纤维素离子交换柱(2.5cm×20cm)，用蒸馏水和梯度浓度NaCl溶液(0～2mol/L)梯度洗脱，流速0.5～1mL/min，每管2～5mL。用硫酸苯酚法检测洗脱液中的多糖含量，隔管检测绘制洗脱曲线(图1)，并根据洗脱曲线按峰收集，旋转蒸发浓缩收集液，经2000～5000Da透析袋透析48～72h，冷冻干燥得到目标多糖化合物，产量为50％～80％。

金乌贼墨多糖的结构如下所示：

，

其中R

金乌贼墨多糖是由岩藻糖、半乳糖胺、甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺构成的多糖骨架，并在甘露糖的C-3位上具有葡萄糖醛酸支链；其分子量为：10～16kDa；硫酸化度为8％～15％。

金乌贼墨多糖的红外光谱图如图2所示：图中显示了多糖的特征吸收峰，具体而言，3468.35cm

实施例2、多糖化合物对高糖损伤下HUVEC细胞增殖的影响

SRB为一种能与生物大分子的碱性氨基酸结合的水溶性蛋白染料，其结合于细胞中量的多少可以反映总蛋白量，进而反映细胞数的多少。在540nm处的OD值与活细胞数呈良好的线性关系。

人血管内皮HUVEC细胞置于含25mM葡萄糖、10％热灭活FBS(胎牛血清)、2mM左旋谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100g/ml链霉素的McCoy’s 5A培养基中，于37℃、5％ CO

将处于对数生长期的HUVEC细胞分别以5000个/孔(180μl/孔)接种于96孔板，培养24h后，加入金乌贼墨多糖或者糖胺聚糖(终浓度如表1所示)，每个浓度设4个复孔。药物作用72h后，每孔加入50％(m/v)冰冷的三氯乙酸(TCA)固定细胞，SRB染色后，加入150μl/孔的Tris溶液，于酶标仪上测定540nm处的OD值。

细胞生长的抑制率按以下公式计算：

抑制率＝[(OD540对照孔－OD540给药孔)/OD540对照孔]×100％

检测结果见表1所示，与空白组相比，高糖损伤后，HUVEC细胞活力明显降低。加入不同浓度的金乌贼墨多糖或糖胺聚糖后，细胞活力均有一定程度的恢复；而与糖胺聚糖相比，金乌贼墨多糖在60μg/ml时，效果显著优于前者。

表1受试化合物对HUVEC细胞增殖的影响(SRB法)

注：*：与25mM葡萄糖对照组比较，P≤0.05；#：同浓度样品比较，P≤0.05。

实施例3、化合物对高糖损伤下HUVEC细胞状态的影响

人血管内皮HUVEC细胞置于含10％热灭活FBS(胎牛血清)、2mM左旋谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100g/ml链霉素的McCoy’s 5A培养基中，于37℃、5％ CO2的细胞培养箱中培养。每两天换液一次，细胞80％融合后，胰酶消化，传代，保持细胞在良好的对数生长期。

消化传代后分别做不损伤、25mM葡萄糖损伤及25mM葡萄糖损伤加终浓度为60μg/ml金乌贼墨多糖处理，于37℃、5％ CO

倒置显微镜下(图3)观察，空白对照组细胞分布均匀，多为扁平多角形铺路石状镶嵌排列，贴壁较牢，边界形态清晰，胞浆丰富，细胞核呈圆形或椭圆形，偶见双核，表明其正在进行分裂增殖，细胞状态好；模型组的HUVEC细胞数量减少，细胞形态萎缩变形，胞体变小，细胞间隙增宽，边界模糊不清，提示细胞通透性增高，细胞接近凋亡，有的细胞已经碎裂；金乌贼墨多糖组细胞状态较模型组明显恢复，细胞数量增多，形态趋于正常。由此说明，金乌贼墨多糖对高糖损伤的HUVEC细胞有明显的保护作用。

实施例4、化合物对高糖损伤下血管内皮细胞滤过作用的影响

HUVEC细胞以10000个/孔密度接种至Hanging Cell Culture Inserts，空白对照组加入标准DMEM培养基，模型组、对照组1、对照组2和给药组分别添加25mM葡萄糖溶液，同时对照组1、对照组2和给药组分别加入60μg/ml的依诺肝素、舒洛地特及金乌贼墨多糖，培养5天后，将培养基换成不含酚红的1640培养液，加入400μg/ml FITC标记的BSA温育3小时，底孔中的培养液移至96Well Assay Plate，检测荧光强度，并计算白蛋白滤过率：

白蛋白滤过率(％)＝(受试化合物组的荧光强度值-NC组的荧光强度值)/NC组的荧光强度值*100

结果如表2所示，与25mM葡萄糖对照组相比，金乌贼墨多糖组的荧光密度值显著降低，说明金乌贼墨多糖可以有效恢复血管内皮细胞的屏障作用，减少白蛋白的滤过率，且效果优于舒洛地特和依诺肝素。

表2受试化合物对高糖损伤下HUVEC细胞滤过作用的影响

注：*：与25mM葡萄糖对照组比较，P≤0.05；***：与25mM葡萄糖对照组比较，P≤0.001；##：与空白对照组比较，P≤0.01；###：与空白对照组比较，P≤0.001。

实施例5、化合物对糖尿病引起的动脉血管炎症的治疗作用

实验动物：雄性SD大鼠75只，体重200±2g。

实验材料：链脲佐菌素(sigma公司)；葡萄糖(索莱宝)。

实验方法：取体重为200g左右的SD雄性大鼠40只，适应性饲养一周后，禁食不禁水12h后，次日早上称重，随机选取10只为空白组，喂食正常饲料，其余大鼠作为糖尿病组，喂食高脂高糖饲料(饲料组成：20％蔗糖、4％胆固醇、10％猪油、1％胆酸钠)30天。30天后，禁食不禁水12h，糖尿病组腹腔注射链脲佐菌素30mg/kg，连续给药2天，空白组注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，7天后尾尖采血测定血糖值。

分组给药：选取16.7mmol/L＜空腹血糖值＜21mmol/L，并且有明显多饮、多食、多尿症状的糖尿病组大鼠，根据血糖值随机分为3组(组间差不大于1.1mmol/L)，连续给药45天。

表3实验分组给药情况

二型糖尿病常伴随血脂异常，主动脉会有血脂聚集及内皮损伤。如图4所示，HE染色分析观察到，金乌贼墨多糖对Ⅱ型糖尿病形成的大鼠主动脉弓内皮损伤具有改善作用。

实施例6、化合物抗凝血特征

样品及对照品：依诺肝素拿注射液：克赛(0.4ml/4000AxalU)。舒洛地特注射液：意大利阿尔法韦士曼，规格：2ml:600LSU*10支/盒。生理盐水：山东齐都药业有限公司。

实验动物：SPF级SD大鼠；6-8周龄；雄性。

实验方法：大鼠腹部皮下注射给药后，在1.5h采血，检测凝血四项。

给药剂量：依诺肝素、舒洛地特、金乌贼墨多糖给于4mg/kg，对照组注射同等体积的生理盐水；每组做6个平行。

检测结果如表4-7所示，金乌贼墨多糖组APTT明显低于依诺肝素组及舒洛地特组，表明其抗凝效果较弱，出血副作用较低。

表4化合物对APTT的影响(单位：S)

**：与金乌贼墨多糖组比较，P≤0.01；

表5化合物对PT的影响(单位：S)

表6化合物对TT的影响(单位：S)

表7化合物对的影响(单位：S)

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。