一种用于检测人类FTO基因rs9939609多样性的引物探针组合及其使用方法

摘要

本发明提供了一种用于检测人类FTO基因rs9939609多样性的引物探针组合及其使用方法。用于检测人类FTO基因rs9939609多样性的引物探针组合及其使用方法，涉及分子生物学领域。本发明为针对涉及能量代谢等肥胖显著相关的、高中国人群频率的FTO基因rs9939609SNP位点多样性检测，建立简便、快速、高准确性的TaqMan探针SNP分型方法，为个性化、精准化减肥提供指导依据。

说明书

技术领域

本发明涉及引物探针组合及其应用，属于生物基因应用技术领域，具体涉及一种用于检测FTO基因rs9939609多样性的引物探针组合及其应用。

背景技术

肥胖症是指体内脂肪堆积过多和(或)分布异常，通常伴有体重增加。随着生活水平的提高和生活方式的改变，肥胖症在国内的流行已经越发明显。如今，中国的肥胖人口数量已经上升至全球第一位。肥胖不只影响形体外观，同时增加伴发糖尿病、心血管病、癌症等若干慢性病的风险；并进一步导致病死率的增加。

肥胖是基因与环境因素共同作用的结果。基因是内因，决定肥胖发生的易感性；饮食和运动水平等环境因素是外因，是触发肥胖发生的外在条件，但必须通过内因才能起作用。肥胖是一种多基因疾病，涉及到食欲控制、能量代谢、脂肪细胞分化、内分泌等方面的基因。单核苷酸多态性(SNP)，是基因突变类型之一。某些特定的SNP位点，跟肥胖症存在显著相关性。

SNP位点的检测方法有直接测序法、单碱基引物延伸反应法、TaqMan探针法、PCR－RFLP、PCR－SSP等。其中，TaqMan探针法具有简便、快速、高准确性的特点。

FTO基因是通过基因组关联研究(Genome Wide Association Studies，GWAS)技术发现的一个得以广泛验证的肥胖易感基因。FTO基因位于16号染色体(53,701,692-54,158,512)上，又称之为肥胖基因，包含9个外显子，基因长度为410kb，其内含子序列中含有多处单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点。FTO基因广泛表达于人体组织的各发育阶段，且在下丘脑、骨骼肌及脂肪等组织中高表达，参与调节饮食。

研究表明，FTO基因序列上的多个位点出现的单核苷酸突变与肥胖和Ⅱ型糖尿病及其相关指标密切相关，如体脂、BMI(Body Mass Index)、腰围、臀围和瘦素水平等。其中FTO基因rs9939609的多样性可影响人体的饱腹感，A等位基因携带者表现出食欲和摄食量的增加，表现出更频繁的饮食和对高脂饮食的偏好，即使在低能量消耗的情况下，进食量也高于非携带者，从而提高能量的摄入，导致肥胖。

因此，FTO基因rs9939609的多样性检测成为肥胖人员发现自身超重原因的关键。需要开发一种准确度高，结果稳定，便于检测FTO基因rs9939609多样性的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测FTO基因rs9939609多样性的引物探针组合，其准确度高，结果稳定，便于检测FTO基因rs9939609多样性的检测。

为达到上述目标，本发明提供一种用于检测人类FTO基因rs9939609多样性的引物探针组合，该引物探针组合包含：

引物序列的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；野生型T探针的序列如SEQ ID NO.3所示，突变型A探针序列如SEQ ID NO.4所示。

1)5'-CTAGGTTCCTTGCGACTGCTGT-3'(SEQ ID NO.1)；

2)5'-TATGCTCTCCCACTCCATTTCTG-3'(SEQ ID NO.2)；

3)NED-5'-TGAATTTtGTGATGCACTT-3'-BHQ(SEQ ID NO.3)；

4)ROX-5'-AATTTaGTGATGCACTTGG-3'-BHQ(SEQ ID NO.4)。

另一方面，本发明提供如上所述的用于检测人类FTO基因rs9939609多样性的引物探针组合在检测FTO基因rs9939609多样性的应用。

进一步地，所述应用引物探针组合，以待测样本的DNA为模板，针对FTO基因rs9939609进行荧光PCR扩增，然后根据荧光PCR曲线图，并判断其基因型别。

进一步地，所述用于检测人类FTO基因rs9939609多样性的引物探针组合在检测FTO基因rs9939609多样性的应用，检测方法如下：

1)提供权利要求1所述的引物探针组合；

2)配制PCR扩增FTO基因rs9939609多样性的荧光PCR反应体系；

3)对待测样本DNA进行荧光PCR扩增；

4)根据结果曲线判定型别，检测反应体系的荧光强度，以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct值为0或大于35：荧光曲线对应的碱基阴性；Ct小于35：荧光曲线对应的碱基阳性。

更进一步地，所述步骤2)中，所述荧光PCR反应体系每20μl组成如下：

总体积20μL。

更进一步地，所述步骤3)中，所述荧光PCR扩增条件是：95℃，1min，然后按95℃，15sec→60℃，30sec扩增40个循环。

本发明用于检测FTO基因rs9939609多样性的引物探针组合，具有如下有益效果：

1)本发明的应用TaqMan探针SNP分型方法，将FTO基因rs9939609多样性检测过程标准化，建立简便、快速、高准确性的检测方法，为个性化、精准化减肥提供指导依据；

2)本发明为针对涉及能量代谢等肥胖显著相关的、高中国人群频率的FTO基因rs9939609SNP位点多样性检测，建立简便、快速、高准确性的TaqMan探针SNP分型方法，为个性化、精准化减肥提供指导依据。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

图1是野生型样本FTO基因rs9939609荧光PCR结果示意图；

图2是杂合型样本FTO基因rs9939609荧光PCR结果示意图；

图3是突变型样本FTO基因rs9939609荧光PCR结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明应用的范围。

下列实施例中未注明具体实验方法的，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南(科学出版社，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明FTO基因rs9939609多样性的检测方法，包括步骤：

1.SNP分型探针的设计：在序列数据库GenBank，检索出包含FTO基因rs9939609位点的DNA参考序列；使用引物设计软件，设计PCR扩增引物、SNP分型探针；对PCR扩增引物、SNP分型探针进行分析，确保引物/探针的Tm值接近、无严重的复杂结构，最终设计出一对针对FTO基因rs9939609位点的特性行引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及一对特异性的分型探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

2.使用步骤1的特异性引物探针组合，配制荧光PCR扩增基因序列的反应体系。

3.使用市面上的核酸提取试剂盒，抽提样本DNA，样本可以是经保存的口腔脱落细胞、唾液、血液等样本。

4.将步骤3提取的样本DNA加入步骤2配置的荧光PCR扩增体系，在特定的扩增条件下进行荧光PCR扩增，在荧光PCR扩增的过程中检测反应体系的荧光强度。

5.荧光PCR实验结果的SNP分型方法，使用荧光定量PCR仪的自带软件，在默认参数条件下，对实验结果进行SNP分型，查验SNP分型效果，校准软件参数条件，设置数据处理的判读标准：以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct值为0或大于35：荧光曲线对应的碱基阴性；Ct小于35：荧光曲线对应的碱基阳性。

上述特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ IDNO.2所示；野生型T探针的序列如SEQ ID NO.3所示，突变型A探针序列如SEQ ID NO.4所示。

1)5'-CTAGGTTCCTTGCGACTGCTGT-3'(SEQ ID NO.1)；

2)5'-TATGCTCTCCCACTCCATTTCTG-3'(SEQ ID NO.2)；

3)NED-5'-TGAATTTtGTGATGCACTT-3'-BHQ(SEQ ID NO.3)；

4)ROX-5'-AATTTaGTGATGCACTTGG-3'-BHQ(SEQ ID NO.4)。

本发明提供了一种用于检测人类FTO基因rs9939609多样性的引物探针组合及其使用方法，涉及分子生物学领域。本发明使用引物设计软件设计出的引物探针，再经多实验扫选适合的修饰基团，以及优化淬火温度、PCR反应体系组成，最终优化出的引物探针组合及应用条件。本发明为针对涉及能量代谢等肥胖显著相关的、高中国人群频率的FTO基因rs9939609SNP位点多样性检测，建立简便、快速、高准确性的TaqMan探针SNP分型方法，为个性化、精准化减肥提供指导依据。

本发明采用标准化的操作流程和方法，快速检测人类FTO基因rs9939609多样性，使用二步法进行荧光PCR扩增，减少了热变性和延伸过程，使得荧光PCR可以快速完成检测；同时增加了dUTP以防止产物残留污染，不影响结果的准确性；并且使用了校正染料，使得加样时起指示作用。这些方式从而快速检测人体FTO基因rs9939609型别，为个性化、精准化减肥提供指导依据。

实施例FTO基因rs9939609多样性的检测

样本来源：该方法可以用于口腔脱落细胞、唾液、血液等样本DNA中的FTO基因rs9939609多样性的检测，样本DNA的提取采用TIANGEN公司的TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)DP304-03(具体抽提方法请参考试剂盒说明书)。本实例中我们选取的是100例口腔脱落细胞样本(公司内部员工采样，编号1-100)，抽提DNA。

PCR扩增：

在微量离心管中配制反应混合液，反应体系如下表1：

表1荧光PCR扩增反应体系

注：2×Luna Universal Probe qPCR Master Mix是针对实时qPCR检测和使用水解探针定量目标DNA序列而优化的2X反应液，预混液含有热启动Taq DNA聚合酶及独特校正染料，预混液中使用了dUTP，以防止产物残留污染；预混液中还加有非荧光染料，便于建立反应时进行肉眼观察。

11×：配置11份，实际需要分装10份，多余的一份分装时的误差。

FTO-F和FTO-R分别是引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，浓度均为5μM。FTO-NED-T和FTO-ROX-A分贝是探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，浓度分别为1.2μM和1.7μM。引物均为自行设计，英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1)将反应混合液轻微震荡混匀后短速离心，分装到96孔荧光定量PCR板中，每孔分装16μl。

2)加入4μl样本DNA，然后盖好PCR板盖，轻微振荡混匀后2000g离心1min；

3)将荧光定量PCR板放到QuantStudio Dx实时荧光定量PCR仪上，按照下面的程序进行设置好荧光基团后，进行荧光PCR扩增：

95℃，1min，然后按95℃，15sec→60℃，30sec扩增40个循环，此40循环在60℃时检测NED和ROX荧光信号。

4)检测荧光信号的Ct值，是采用QuantStudio Dx实时荧光定量PCR仪在60℃时检测荧光，一次可检测96份样品。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：Ct值为0或大于35：荧光曲线对应的碱基阴性；Ct小于35：荧光曲线对应的碱基阳性。检测过程所需时间约为31分钟。

野生型样本FTO基因rs9939609荧光PCR结果如图1所示；杂合型样本FTO基因rs9939609荧光PCR结果如图2所示；突变型样本FTO基因rs9939609荧光PCR结果如图3所示。

功效试验例

功效试验例中我们选取的是100例口腔脱落细胞样本(公司内部员工采样，编号1-100)，抽提DNA，比对测序与本实验法的准确性。用前述的荧光PCR进行检测，同时采用传统的测序法进行验证。

由结果可以看出，荧光PCR方法与传统测序检测方法结果的符合率为100％，荧光PCR检测效率高于传统测序方法。体检验结果如下表2所示。

表2 100例口腔脱落细胞样本检验结果

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。