一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签及呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法

摘要

本发明提供了一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签及呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法，属于免疫层析检测技术领域。本发明在硅球双层量子点作信号标签的基础上，集成了多种免疫层析试纸条从而实行多通道联检，此免疫层析四联卡可以检测多种复杂真实样本，实现呼吸道病毒的高灵敏、高特异性四通道联合检测，扩大检测范围，从而可快速筛查病毒类型，同时可精确定量病原浓度。同时，本发明提供的基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡制备方法简单、成本低，可实现批量生产。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫层析检测技术领域，特别涉及一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签及呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法。

背景技术

呼吸道病毒引起的急性呼吸道感染有广泛的传播范围和极高的死亡率，呼吸道传染病已成为全球性卫生问题，并在全球范围内造成重大经济损失。人类主要感染的呼吸道病毒有新冠病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒等。患者感染急性呼吸道病毒的病症极其相似，这对医师指导临床治疗产生不利的效果，并且还影响了控制疫情发展。呼吸道病毒诊断和监测对于识别新毒株的出现、改进对潜在流行病和大流行的预测以及为疫苗战略提供信息至关重要。诊断数据有助于实时监测，可作为感染控制干预措施的基础，有利于遏制疫情发展，恢复社会发展秩序。

核酸检测是诊断呼吸道病毒感染的金标准，病毒分离培养、酶联免疫吸附测定等技术也是检测呼吸道病原体的经典方法，但这些技术耗时长，需要专业的操作人员和生物安全实验室，不适用于现场快速诊断。横向流动免疫层析检测技术，具有操作简便、检测时间短、使用场景灵活等优势，在新突发疫情的感染者大规模筛查中有巨大的应用潜力。目前市场上使用的胶体金法免疫层析试剂盒，存在检测通道少，检测靶标单一，灵敏度不足、无法定量等问题，对病原体精准筛查造成很大的误差，不利于感染者临床治疗和疫情防控。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签及呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法，本发明提供的基于硅球双层量子点的免疫信号标签能够同时实现多种呼吸道病毒的快速准确高灵敏定量检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签，包括硅球双层量子点纳米颗粒和修饰在所述硅球双层量子点纳米颗粒表面的呼吸道病毒标记抗体；

所述硅球双层量子点纳米颗粒包括SiO

所述呼吸道病毒标记抗体包括抗腺病毒抗体、抗新冠病毒抗体、抗甲流病毒抗体或抗乙流病毒抗体。

优选的，所述SiO

所述硅球双层量子点纳米颗粒的粒径为230～260nm。

优选的，所述羧基化量子点为羧基化CdSe/ZnS量子点，所述羧基化量子点的粒径为10～15nm。

本发明提供了上述基于硅球双层量子点的免疫信号标签的制备方法，包括以下步骤：

将SiO

将所述SiO

将所述SiO

将所述SiO

将所述硅球双层量子点纳米颗粒与羧基活化剂混合，进行羧基活化，得到活化的硅球双层量子点纳米颗粒；

将所述活化的硅球双层量子点纳米颗粒与呼吸道病毒标记抗体混合，进行孵育，封闭未结合位点，得到基于硅球双层量子点的免疫信号标签。

本发明提供了上述硅球双层量子点的免疫信号标签在非诊断目的检测呼吸道病毒中的应用。

本发明提供了一种基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡，包括腺病毒检测试纸条、新冠检测试纸条、甲流检测试纸条和乙流检测试纸条；

每种试纸条包括样品垫、共轭垫、NC膜和吸收垫；所述共轭垫包被有上述基于硅球双层量子点的免疫信号标签，所述基于硅球双层量子点的免疫信号标签的呼吸道病毒标记抗体种类与试纸条检测病毒种类对应；

所述NC膜设有检测线和质控线，所述检测线包被有与试纸条检测病毒种类对应的病毒捕获抗体，所述质控线包被有山羊抗鼠IgG抗体。

本发明提供了一种呼吸道病毒四通道联合检测免疫层析试剂盒，包括上述基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡和运行缓冲液。

优选的，以体积百分含量计，所述运行缓冲液包括8～12％吐温-20；8～12％胎牛血清；余量的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度为10mM。

本发明提供了一种非诊断目的的呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法，包括以下步骤：

将待测样品与运行缓冲液混合，得到待测液；

将所述待测液加至上述基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡的样品垫，静置后观察每种试纸条NC膜表面检测线的荧光条带，若荧光显色则待测样品含有该种病毒；

分别测试试纸条T线的荧光强度，根据所述荧光强度和预定的标准曲线获得待测样品中试纸条所对应病毒的含量；所述标准曲线为该种病毒含量与荧光强度的线性关系曲线。

优选的，所述静置的时间为10～20min。

本发明提供了一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签，包括硅球双层量子点纳米颗粒(简写为SiO

本发明提供了上述基于硅球双层量子点的免疫信号标签的制备方法，此法操作简单，适合工业化批量生产。

本发明提供了一种基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡，包括腺病毒检测试纸条、新冠检测试纸条、甲流检测试纸条和乙流检测试纸条；每种试纸条包括样品垫、共轭垫、NC膜和吸收垫；所述共轭垫包被有上述基于硅球双层量子点的免疫信号标签，所述基于硅球双层量子点的免疫信号标签的呼吸道病毒标记抗体种类与试纸条检测病毒种类对应；所述NC膜设有检测线和质控线，所述检测线包被有与试纸条检测病毒种类对应的病毒捕获抗体，所述质控线包被有山羊抗鼠IgG抗体。本发明在硅球双层量子点作信号标签的基础上，集成了多种免疫层析试纸条从而实行多通道联检，此免疫层析四联卡可以检测多种复杂真实样本，实现呼吸道病毒的高灵敏、高特异性四通道联合检测，扩大检测范围从而可快速筛查病毒类型，同时可精确定量病原浓度。同时，本发明提供的基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡制备方法简单、成本低，可实现批量生产。

本发明提供了一种非诊断目的的呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法，此检测方法既可肉眼定性，亦可荧光定量，对免疫四联卡的工作环境和使用人员要求低。同时，本发明的检测方法灵敏度高、检测范围广、可一次性检测四种呼吸道病毒，在短时间内可快速筛查患者感染病毒类型，具有广阔的实际应用前景。实施例结果表明，本发明提供的检测方法对腺病毒、新冠N蛋白、甲流病毒和乙流病毒的可视化灵敏度分别为5×10

附图说明

图1为本发明硅球双层量子点纳米微球的制备方法示意图；

图2为本发明硅球双层量子点纳米微球制备过程中各阶段产物电镜表征图，其中图2(a)为硅球纳米颗粒电镜图；图2(b)为硅球单层量子点纳米微球电镜图；图2(c)为硅球双层量子点纳米微球电镜图；

图3为本发明硅球双层量子点纳米微球表面修饰标记抗体的制备过程；

图4为基于硅球双层量子点的四联检免疫层析系统检测四种呼吸道病毒的流程图，其中a(i)为采集和处理呼吸道样本示意图，a(ii)为硅球量子点免疫层析四联卡工作原理图，a(iii)为干事荧光分析仪记录四联卡中检测线和质控线的荧光信号示意图，b为新冠病毒免疫层析检测试纸条工作原理图；

图5为在紫外光照射下，硅球双层量子点的四通道联检免疫层析系统检测不同浓度的腺病毒的检测试纸条照片，以及相对应的校准曲线；

图6为在紫外光照射下，硅球双层量子点的四通道联检免疫层析系统检测不同浓度的新型冠状病毒N蛋白的检测试纸条照片，以及相对应的校准曲线；

图7为在紫外光照射下，硅球双层量子点的四通道联检免疫层析系统检测不同浓度的甲型流感病毒的检测试纸条照片，以及相对应的校准曲线；

图8为在紫外光照射下，硅球双层量子点的四通道联检免疫层析系统检测不同浓度的乙型流感病毒的检测试纸条照片，以及相对应的校准曲线；

图9为检测腺病毒、新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的胶体金试纸检测结果图；

图10为硅球双层量子点的四通道联检免疫层析系统检测腺病毒、新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的特异性检测结果图；

图11为硅球双层量子点的四通道联检免疫层析系统检测腺病毒、新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的重复性检测结果图；

图12为硅球双层量子点的四通道联检免疫层析系统检测腺病毒、新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的实际样本加标模拟实验结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签，包括硅球双层量子点纳米颗粒和修饰在所述硅球双层量子点纳米颗粒表面的呼吸道病毒标记抗体；

所述硅球双层量子点纳米颗粒包括SiO

所述呼吸道病毒标记抗体包括抗腺病毒抗体、抗新冠病毒抗体、抗甲流病毒抗体或抗乙流病毒抗体。

本发明提供的基于硅球双层量子点的免疫信号标签包括硅球双层量子点纳米颗粒。在本发明中，所述硅球双层量子点纳米颗粒包括SiO

在本发明中，单层羧基化量子点外壳包括聚乙烯亚胺层和分布在所述聚乙烯亚胺层表面的羧基化量子点。在本发明中，所述聚乙烯亚胺的数均分子量优选为24000～25000。在本发明中，单层聚乙烯亚胺层的厚度优选为5～10nm，更优选为6～8nm。

在本发明中，所述羧基化量子点优选为羧基化CdSe/ZnS量子点，简写为CdSe/ZnS-COOH，所述CdSe/ZnS-COOH的荧光发射波长为631nm。在本发明中，所述CdSe/ZnS-COOH的来源优选为市售。

在本发明中，所述硅球双层量子点纳米颗粒的粒径优选为230～260nm，更优选为240～250nm。

在本发明中，所述呼吸道病毒标记抗体的来源为市售。作为本发明的具体实施例，所述抗腺病毒抗体购买于常州中美新歆生物科技有限公司，型号为ACT-ADV-001；所述抗新冠病毒抗体、抗甲流病毒抗体、抗乙流病毒抗体均购买于广州菲鹏生物股份有限公司，所述抗新冠病毒抗体的型号为COV19-PS-Mab2、抗甲流病毒抗体的型号为FLUA-REAB-G1-007、抗乙流病毒抗体的型号为FLUA-REAB-G1-005的来源均为市售。

本发明提供了上述基于硅球双层量子点的免疫信号标签的制备方法，包括以下步骤：

将SiO

将所述SiO

将所述SiO

将所述SiO

将所述硅球双层量子点纳米颗粒与羧基活化剂混合，进行羧基活化，得到活化的硅球双层量子点纳米颗粒；

将所述活化的硅球双层量子点纳米颗粒与呼吸道病毒标记抗体混合，进行孵育，封闭未结合位点，得到基于硅球双层量子点的免疫信号标签。

本发明将SiO

将正硅酸乙酯与乙醇、氨水和水混合，进行水解反应，得到SiO

在本发明中，所述正硅酸乙酯与乙醇、氨水、水的体积比优选为4:100:4:6。

在本发明中，所述混合、水解反应优选在搅拌的条件下进行；所述水解反应的温度优选为室温，时间优选为2～3h，更优选为2.5h。

在本发明中，所述水解反应后，本发明优选对所得水解反应液进行离心、洗涤和干燥，得到SiO

在本发明中，所述第一层聚乙烯亚胺溶液的浓度优选为1～5mg/mL。在本发明中，所述SiO

在本发明中，所述超声混合的功率优选为600～800W，更优选为700W，时间优选为30～35min。

所述超声混合后，本发明优选对所得混合液进行离心和水洗。在本发明中，所述离心的速率优选为6000～6200rpm，时间优选为6～10min。在本发明中，所述水洗的次数优选为2次。在本发明中，所述洗涤后的SiO

本发明将所述SiO

在本发明中，所述超声混合的功率优选为600～800W，更优选为700W，时间优选为40～45min。在本发明中，所述超声混合的过程中，大量带负电荷的CdSe/ZnS-COOH通过静电吸附作用均匀分布在带强正电的SiO

所述超声混合后，本发明优选对所得混合液进行离心和水洗。在本发明中，所述离心的速率优选为5500rpm，时间优选为6min。在本发明中，所述水洗的次数优选为1次。在本发明中，所述洗涤后的SiO

本发明将所述SiO

在本发明中，所述超声混合的功率优选为600～800W，更优选为700W，时间优选为30～35min。

所述超声混合后，本发明优选对所得混合液进行离心和水洗。在本发明中，所述离心的速率优选为5300rpm，时间优选为6min。在本发明中，所述水洗的次数优选为2次。在本发明中，所述洗涤后的SiO

本发明将所述SiO

在本发明中，所述超声混合的功率优选为600～800W，更优选为700W，时间优选为40～45min。在本发明中，所述超声混合的过程中，羧基量子点再次吸附在PEI层外表面，形成SiO

所述超声混合后，本发明优选对所得混合液进行离心和水洗。在本发明中，所述离心的速率优选为5000rpm，时间优选为6min。在本发明中，所述水洗的次数优选为1次。在本发明中，所述洗涤后的SiO

本发明将所述硅球双层量子点纳米颗粒与羧基活化剂混合，进行羧基活化，得到活化的硅球双层量子点纳米颗粒。在本发明中，所述硅球双层量子点纳米颗粒优选以2-(N-吗啉)乙磺酸溶液的形式加入，所述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液的浓度优选为0.01M，pH值优选为5.8。在本发明中，所述硅球双层量子点纳米颗粒的质量与2-(N-吗啉)乙磺酸溶液的体积比优选为1mg:0.5mL～1mg:1mL。

在本发明中，所述羧基活化剂优选包括碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，所述碳二亚胺溶液的浓度优选为0.1M，所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度优选为0.1M；所述碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺的体积比优选为2:1。

在本发明中，所述硅球双层量子点纳米颗粒的质量与羧基活化剂的体积比优选为1mg:30μL。在本发明中，所述羧基活化的温度优选为室温，时间优选为15～16min。在本发明中，所述羧基活化优选在超声的条件下进行。

在本发明中，所述羧基活化后，本发明优选对所得羧基活化液进行离心，离心后所得固体重悬于PBST溶液中保存，所述PBST溶液的浓度优选为0.01M，pH值优选为7.4。

本发明将所述活化的硅球双层量子点纳米颗粒与呼吸道病毒标记抗体混合，进行孵育，封闭未结合位点，得到基于硅球双层量子点的免疫信号标签。在本发明中，所述孵育的温度优选为室温，时间优选为2～3h。

本发明通过加入封闭剂来封闭未结合位点。在本发明中，所述封闭剂优选为BSA，所述封闭未结合位点的时间优选为1h。

封闭未结合位点后，本发明优选对所得产物进行离心和洗涤，所述洗涤用洗涤剂优选为PBST溶液。

所述洗涤后，本发明将所得产物重悬于PBST溶液，并加入金标稀释液，保存4℃冰箱中待用。

在本发明中，硅球双层量子点纳米微球的制备过程如图1所示；硅球双层量子点纳米微球制备过程中各阶段产物电镜表征如图2所示，其中图2中(a)为硅球纳米颗粒电镜图；图2中(b)为硅球单层量子点纳米微球电镜图；图2中(c)为硅球双层量子点纳米微球电镜图；硅球双层量子点纳米微球表面修饰标记抗体的制备过程如图3所示。

本发明提供了上述硅球双层量子点的免疫信号标签在非诊断目的检测呼吸道病毒中的应用。

本发明提供了一种基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡，包括腺病毒检测试纸条、新冠检测试纸条、甲流检测试纸条和乙流检测试纸条；

每种试纸条包括样品垫、共轭垫、NC膜和吸收垫；所述共轭垫包被有上述基于硅球双层量子点的免疫信号标签，所述基于硅球双层量子点的免疫信号标签的呼吸道病毒标记抗体种类与试纸条检测病毒种类对应；

所述NC膜设有检测线和质控线，所述检测线包被有与试纸条检测病毒种类对应的病毒捕获抗体，所述质控线包被有山羊抗鼠IgG抗体。

本发明对所述样品垫、共轭垫和吸收垫的具体材质没有特殊的要求，使用本领域常规的上述组件即可。

在本发明中，所述抗腺病毒抗体(ACT-ADV-001)购买于常州中美新歆生物科技有限公司、抗新冠病毒抗体(COV19-PS-Mab2)、抗甲流病毒抗体(FLUA-REAB-G1-007)、抗乙流病毒抗体(FLUA-REAB-G1-005)均购买于广州菲鹏生物股份有限公司。

在本发明中，所述山羊抗鼠IgG抗体购买于生工生物工程(上海)股份有限公司，型号为D110261。

在本发明中，所述硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡还优选包括承载所述腺病毒检测试纸条、新冠检测试纸条、甲流检测试纸条和乙流检测试纸条的基底背板，所述基底背板的材质优选为塑料。

在本发明中，所述基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡的制备方法，优选包括以下步骤：

将抗腺病毒抗体硅球修饰的双层量子点纳米颗粒、抗新冠病毒抗体修饰的双层量子点纳米颗粒、抗甲流病毒抗体修饰的双层量子点纳米颗粒、抗乙流病毒抗体修饰的双层量子点纳米颗粒分别施加在不同的玻璃纤维膜上，得到四个包被不同病毒抗体的共轭垫；

将腺病毒捕获抗体、新冠病毒捕获抗体、甲流病毒捕获抗体、乙流病毒捕获抗体施加在不同的NC膜上形成检测线，并在NC膜上施加山羊抗鼠IgG抗体形成质控线，得到四个NC膜；

对所述共轭垫、NC膜以及样品垫、吸收垫进行干燥，分别组装不同病毒对应的检测试纸条，将裁剪好的试纸条整合到四联卡中，得到基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡。

在本发明中，所述抗腺病毒抗体硅球修饰的双层量子点纳米颗粒、抗新冠病毒抗体修饰的双层量子点纳米颗粒、抗甲流病毒抗体修饰的双层量子点纳米颗粒、抗乙流病毒抗体修饰的双层量子点纳米颗粒的施加方式优选为喷洒，喷洒量均为200μL。

在本发明中，所述腺病毒捕获抗体、新冠病毒捕获抗体、甲流病毒捕获抗体、乙流病毒捕获抗体的施加方式优选为喷洒，喷洒量优选为220～240μL。

本发明优选在干燥箱中进行所述干燥，所述干燥的温度优选为37℃，时间优选为4h。

本发明对所述组装的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的组装方式即可。

本发明提供了一种呼吸道病毒四通道联合检测免疫层析试剂盒，包括上述基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡和运行缓冲液。

在本发明中，以体积百分含量计，所述运行缓冲液包括10％吐温-20、10％胎牛血清和余量的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度为10mM。

本发明提供了一种非诊断目的的呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法，包括以下步骤：

将待测样品与运行缓冲液混合，得到待测液；

将所述待测液加至上述基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡的样品垫，静置后观察每种试纸条NC膜表面T线的荧光条带，若荧光显色则待测样品含有该种病毒；

分别测试试纸条T线的荧光强度，根据所述荧光强度和预定的标准曲线获得待测样品中试纸条所对应病毒的含量；所述标准曲线为该种病毒含量与荧光强度的线性关系曲线。

本发明将待测样品与运行缓冲液混合，得到待测液。在本发明中，所述待测样品优选为唾液样本、咽拭子样本和鼻拭子样本。

在本发明中，所述待测样品与运行缓冲液的体积比优选为1：1。

本发明将所述待测液加至上述基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡的样品垫，静置后观察每种试纸条NC膜表面检测线的荧光条带，若荧光显色则待测样品含有该种病毒。在本发明中，所述待测液的滴加量优选为90～100μL。

在本发明中，所述静置的时间优选为10～20min，更优选为15min，所述静置的过程中，待测样品中的呼吸道病毒抗原与共轭垫中免疫信号标签发生免疫反应，抗原抗体发生特异性结合，形成免疫标签-抗原复合物。在毛细作用下，复合物中的抗原被捕获抗体捕获，形成双抗夹心复合结构，免疫标签在检测线处不断富集，在紫外激发光照射下产生荧光信号。本发明根据检测线区域荧光条带有无来判定受检人呼吸道病毒感染的阴阳性和病毒感染类型，还可以根据荧光条带的强弱来判断受检人为强阳还是弱阳。本发明优选使用365nm激发波长的紫外灯观察荧光显色结果。

本发明分别测试试纸条检测线的荧光强度，根据所述荧光强度和预定的标准曲线获得待测样品中试纸条所对应病毒的含量；所述标准曲线为该种病毒含量与荧光强度的非线性关系曲线。本发明优选使用干式荧光分析仪测试荧光强度。

在本发明中，所述标准曲线的获得方法，优选包括以下步骤：

提供梯度已知浓度的呼吸道病毒抗原溶液；

以所述梯度已知浓度的呼吸道病毒抗原溶液作为待测样品，将待测样品与运行缓冲液混合，得到待测液；

将所述待测液加至上述基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡对应的样品垫，静置后测试不同浓度呼吸道病毒抗原溶液对应的荧光强度，以呼吸道病毒抗原溶液的浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。

在本发明中，基于硅球双层量子点的四联检免疫层析系统检测四种呼吸道病毒的流程图如图4所示。

下面结合实施例对本发明提供的基于硅球双层量子点的免疫信号标签及呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1基于硅球双层量子点的免疫信号标签的制备

(1)制备200nm的SiO

依次将100mL无水乙醇、6mL去离子水、4mL氨水加入到200mL广口瓶中，加入干净的搅拌子，磁力搅拌20min。一次性快速加入4mL正硅酸乙酯溶液，室温条件下搅拌2h。结束反应后，6000rpm/8min离心收集SiO2沉淀物，无水乙醇洗涤3次后，将产物置于真空烘箱中60℃真空干燥6h，得到SiO2颗粒干粉备用。

(2)制备SiO

称取约10mg的200nmSiO

(3)制备单层量子点壳SiO

将100μLCdSe/ZnS-COOH水溶液加入到30mL上述制备的SiO

(4)制备SiO

将5mLPEI溶液中(1mg/mL)加入到30mL上述制备的SiO

(5)制备双层量子点壳SiO

将100μLCdSe/ZnS-COOH水溶液加入到制备的SiO

(6)将1mgSiO

实施例2基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡的制备

基于硅球双层量子点的呼吸道病毒检测免疫层析四联卡是由四种呼吸道病毒免疫层析检测试纸条组成。每种免疫层析试纸由一个样品垫、一个含有特异性免疫SiO

(1)制备4种共轭垫

将200μL抗ADV抗体修饰的SiO

(2)制备4种NC膜

将ADV捕获抗体SARS-CoV-2NP捕获抗体、Flu-A捕获抗体、Flu-B捕获抗体和山羊抗鼠IgG抗体以1μL/cm的速率均匀喷洒在NC膜上，喷洒量最佳为220～240μL，构建四组T线和C线。

(3)制备4种免疫层析试纸条

将所有免疫层析组件放入37℃的干燥箱中4小时，然后依次连接到塑料背板卡上，将组装好的免疫层析试纸卡切成3.3毫米宽的条状。

(4)制备免疫层析四联卡

将4种呼吸道病毒检测试纸条整合到四联卡中，装入避光锡纸袋中，加入干燥剂塑封保存。

实施例3呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测

(1)采集受检人咽喉部唾液样本，并将咽拭子伸入运行缓冲液中并重复搅拌均匀；其中以体积百分含量计，所述运行缓冲液包括10％吐温-20、10％胎牛血清和余量的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度为10mM；

(2)将含有样本的运行缓冲液滴在硅球双层量子点免疫层析四联卡的样品孔中，等待免疫反应15分钟；

(3)用365nm激发波长的紫外灯观察检测结果，根据检测线区域荧光条带有无来判定受检人感染阴阳性和病毒感染类型，还可以根据荧光条带的强弱来判断受检人为强阳还是弱阳。通过干式荧光分析仪记录检测线的荧光信号来进行病毒定量分析。所得结果示意图如图4中的a(iii)所示。

图5～8为硅球双层量子点的四通道联检免疫层析系统检测四种呼吸道病毒的测试分析结果图。图5～8为在紫外光照射下，不同浓度的腺病毒、新型冠状病毒N蛋白、甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测试纸条照片，以及相对应的校准曲线。由图可知，四联卡检测线区域中荧光条带的亮度随抗原或病毒浓度的降低而减弱，腺病毒、新冠N蛋白、甲流病毒和乙流病毒的可视化灵敏度分别为5×10

图9为检测腺病毒、新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙流胶体金试纸检测结果，各呼吸道病毒的胶体金检测灵敏度分别为10

图10为硅球双层量子点的四通道联检免疫层析系统检测腺病毒、新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的特异性检测结果图，检测系统与非靶标呼吸道病毒无交叉反应现象，说明了本发明提出的硅球量子点四联检技术的特异性良好。

图11为硅球双层量子点的四通道联检免疫层析系统检测腺病毒、新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的重复性检测结果；图11中(a)和(c)分别为中浓度组和低浓度组时T线对应的荧光强度。图11中(b)和(d)分别为中浓度组和低浓度组时的比色和荧光照片。结果显示各浓度组的组间差异小，说明本发明提出的硅球量子点四联检技术具有优异的稳定性。

图12硅球双层量子点的四通道联检免疫层析系统检测腺病毒、新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的实际样本加标模拟实验结果图，回收率在91.8～98.4％范围内。

综上，本申请发明的一种基于硅球双层量子点的免疫信号标签及呼吸道病毒四通道联合免疫层析检测方法，可高灵敏地多重分析复杂样品中的呼吸道病毒。四通道联合检测免疫层析技术的操作和成本都大幅降低。硅球双层量子点标签与不同抗呼吸道病毒抗体相结合从而合成的4种免疫-信号标签，并将其引用于4种不同呼吸道病毒的免疫层析试纸条，将检测通量提升为四通道，大大提高了量子点免疫层析检测病毒抗原的效率，在一次试验中实现了对腺病毒、新冠、甲流和乙流四种主要呼吸道病毒的四通道同时高灵敏检测，并且检测时间短，不受场所和操作人员限制。该四通道联合检测免疫层析新技术在实际样本中表现出高稳定性和良好的准确性，是一种有实际应用价值的病毒快速鉴定方法。另外，本发明基于的硅球双层量子点的四通道联检免疫层析检测方法可以利用不同特异性抗体对其他病原体进行快速、灵敏的诊断，具有很大的应用潜能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。