诱导高水平I型干扰素的新型复制缺陷型甲型流感病毒

摘要

本发明涉及一种新型复制缺陷型甲型流感病毒及其用于抗病毒治疗的用途，所述病毒在被其感染的细胞中诱导高水平的I型干扰素(IFN)，所述病毒包含具有功能性效应结构域和非功能性RNA结合结构域的NS1蛋白，所述NS1蛋白缺失N端80个氨基酸内的至少15个氨基酸。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型复制缺陷型甲型流感病毒(influenza A virus)及其用于抗病毒治疗的用途，所述病毒在被其感染的细胞中诱导高水平的I型干扰素(type Iinterferon，IFN)，所述病毒包含具有功能性效应结构域和非功能性RNA结合结构域的NS1蛋白，所述NS1蛋白缺失N端80个氨基酸内的至少15个氨基酸。

背景技术

当甲型流感病毒通过内吞作用进入宿主细胞而进入细胞时，刺激特异性信号沿干扰素信号通路传导以激活抗病毒反应。模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)感知进入的病毒并激活干扰素(IFN)基因的转录，IFN在感染细胞以及附近未感染细胞中启动IFN刺激基因(IFN-stimulated gene，ISG)的表达，保护这些细胞免受潜在的病毒入侵。ISG编码多种抗病毒蛋白，具有多种作用模式，调节细胞凋亡；编码神经调节剂和免疫调节剂的产生；编码细胞因子和趋化因子用于激活和募集免疫细胞至感染部位、GTP分解代谢和细胞因子加工；编码STAT1用于扩增自分泌ISG表达，以及许多其它抗病毒因子。因此，ISG产物可抑制感染细胞中的病毒复制，对未感染细胞警示潜在感染，吸引免疫细胞，并在中枢神经系统中引发关于正在发生感染的警示(Shim J.M.et al.,Viruses,2017,9(8),223)。

新鉴定病毒的出现强调了开发新的抗病毒策略的必要性。

在体外、动物实验和SARS患者中的实验和初步临床研究均表明，I型IFN治疗是有益的(Loutfy et al.,2003；Cinatl et al.,2003；Haagmans et al.,2004；Hewnsley etal.,2004)。

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)是一种新出现的冠状病毒，其会引起严重急性呼吸系统疾病，新冠肺炎COVID-19。SARS-CoV是一种动物病毒，蝙蝠可能是这种病毒的宿主，这种病毒会传播给包括人类在内的其它动物。SARS-CoV主要通过人传人的方式进行传播。这些病毒通常靶向患者的呼吸系统，并导致类似于流感的症状。冠状病毒为包膜球形颗粒，其突起糖蛋白(S蛋白)形成冠状表面。S蛋白由两个亚基S1和S2组成。位于S1亚基中间(相对于S1亚基序列的氨基酸(aa)318–510)的片段是SARS-CoV中最小的受体结合结构域(receptor-binding domain，RBD)，其与宿主细胞受体血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)结合。RBD长约192个氨基酸，包括受体结合基序(receptor binding motif，RBM)。RBD与ACE2的结合导致S2亚基的构象变化和病毒颗粒的侵袭。

截至2020年11月28日，世界卫生组织报告了全球约6200万例确诊病例，导致145万例死亡。

新冠肺炎COVID-19的症状包括轻症到肺炎、肾功能障碍、呼吸系统和多器官衰竭。与之前的SARS-CoV不同，COVID-19被证明是更致命的。感染COVID-19的患者依靠自身的天然免疫力，并且通常寻求支持性护理来帮助缓解症状。对于重症病例，治疗包括机械通气和重要器官功能支持。

利用IFN治疗冠状病毒感染的临床经验很少。在一项实验中，55名健康志愿者接受了为期15天的鼻内重组IFN或安慰剂治疗，并在治疗第8天通过直接鼻内接种暴露于冠状病毒(Turner et al.,1986)。IFN治疗缩短了持续时间，并降低了冠状病毒感冒症状的严重程度，表明鼻内重组IFN-α可能是一种有效的预防性治疗感染冠状病毒的人的方法。同样，在病毒攻击前1天和攻击后3天给予IFN鼻内喷雾能够保护人类志愿者免受冠状病毒感染(Tyrell,1986)。两个临床报告描述了使用IFN治疗SARS患者((Zhao et al.,2003；Loutfyet al.,2003)。第一项研究涉及对来自广东省会广州的190名SARS患者的治疗(Zhao etal.,2003)。作者得出结论，高剂量类固醇与喹诺酮联合阿奇霉素治疗可获得最佳疗效。该研究中未观察到IFN-α的显著性。第二项研究使用了改良的IFN-α、IFN alfacon-1(

实验性和试点性临床数据有力地表明，I型IFN是SARS治疗方案的有前景的候选药物。它们不仅可用作SARS-CoV复制的抑制剂，还可用于改善已知导致SARS的失调免疫应答和炎性进程。尽管大多数研究集中于IFN-α的评估和临床应用，但在SARS-CoV复制抑制方面，IFN-β优于IFN-α(Cinatl et al.,2003)。

如今，IFN已被确定为乙型和丙型肝炎治疗方案的重要组成部分(Friedman2008)。尽管临床研究表明，鼻内IFN治疗还可防止鼻病毒感染和传播(McKinlay,2001)，但对鼻粘膜和偶见鼻部的刺激等副作用妨碍了对IFN治疗呼吸道疾病(如流感)的潜在治疗用途进行进一步深入评估。

到目前为止，还没有预防或成功治疗SARS-CoV-2感染的治疗药物。鉴于对人类健康的持续威胁，迫切需要预防性和治疗性的抗病毒治疗，以控制SARS-CoV-2和其它病毒威胁。

因此，需要一种用于预防和治疗病毒感染及其相关并发症的组合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于预防病毒感染的组合物。

该目的通过本发明的主题得以解决。

针对病毒感染的有效先天性免疫应答在很大程度上依赖于I型IFN应答及其下游级联效应，最终控制病毒复制并诱导有效的适应性免疫应答。这种I型IFN应答的成功启动能够在早期阶段抑制病毒复制和传播。

基本上，所有病毒都采用多种策略来干扰I型IFN的产生和/或下游信号传导。特别地，对于SARS-CoV-2，这种抑制策略与疾病的严重程度密切相关。先天性免疫应答在保护性或破坏性应答中起关键作用，可以为免疫干预打开一扇窗。强烈的先天性免疫应答是疾病结果的关键因素。针对病毒感染的有效先天性免疫应答在很大程度上依赖于I型IFN型应答及其下游级联效应，最终控制病毒复制并诱导有效的适应性免疫应答。这种I型IFN应答的成功启动会在早期阶段抑制病毒复制和传播。

出人意料地，发明人已经表明，在被本文所述病毒(delNS

具体地，本发明病毒诱导高水平的干扰素和其它细胞因子，但在干扰素感受态细胞(interferon-competent cell)中完全复制缺陷，本发明病毒也在干扰素缺陷细胞中显示高复制率并生长至高于8log

通过感染流感病毒变体和基于流感变体的载体诱导的高水平IFN和其它细胞因子可预防或有力减弱其它病毒的感染。因此，本文所述的本发明甲型流感病毒总体上具有预防或限制病毒诱导疾病的潜力。

本文所述的甲型流感病毒和载体可诱导高水平的IFN，其引发并增强即刻非特异性免疫应答(先天性免疫)和长期特异性免疫应答(适应性免疫)。它还刺激抗病毒分子的产生。

免疫刺激/免疫调节：

·激活自然杀伤细胞(NK)；

·激活细胞毒性T细胞(CTL)；

·激活树突状细胞(DC)；

·抑制免疫抑制调节性T细胞(Treg)。

抗病毒分子/抑制病毒复制：

·ISG15(IFN刺激基因15)；

·OAS(寡腺苷酸合成酶)；

·PKR(蛋白激酶R)；

·Mx(IFN诱导的GTP结合蛋白)。

使用本文所述流感病毒变体进行预防性治疗诱导了先天性抗病毒应答，从而提供了针对IFN敏感性病毒的保护。

因此，本文所述的甲型流感病毒不仅是对抗癌症的有希望的工具，还可能是对抗感染性疾病的全新方法。

根据本发明的实施方案，参照SEQ ID NO:1的编号，本文所述的甲型流感病毒包括N端氨基酸15至73的缺失(delNS15-73，具体地是缺少NS1蛋白的氨基酸15-73的甲型流感/新喀里多尼亚样(New Caledonia like)病毒株IVR116)、氨基酸35至50的缺失(delNS35-50，具体地是缺少NS1蛋白的氨基酸35-50的甲型流感/新喀里多尼亚样病毒株IVR116)、氨基酸35至70的缺失(delNS35-70，具体地是缺少NS1蛋白的氨基酸35-70的甲型流感/新喀里多尼亚样病毒株IVR116)、氨基酸40至60的缺失(delNS40-60，具体地是缺少NS1蛋白的氨基酸40至60的甲型流感/新喀里多尼亚样病毒IVR116)，或氨基酸40至80的缺失(delNS40-80，具体地是缺少NS1蛋白的氨基酸40至80的甲型流感/新喀里多尼亚样病毒株IVR116)。

根据具体实施方案，甲型流感病毒包括SEQ ID NO:3、5、7、9和11中任一项的序列。

本文还提供了一种药物制剂，其包含本文所述的甲型流感病毒，任选地与药学上可接受的载体组合。

本文还提供了本文所述的甲型流感病毒或药物制剂用于制备药物。

本文进一步提供了在受试者的抗病毒治疗中的用途，具体地是在由IFN敏感性病毒引起的感染的预防性或治疗性治疗中的用途。

根据实施方案，本文所述的甲型流感病毒变体用于治疗患有或将患有病毒感染的受试者。

根据实施方案，本文所述的甲型流感病毒或药物制剂用于制备用于治疗性治疗受试者的药物，具体地是用于制备用于治疗性治疗需要抗病毒治疗的受试者的药物。

具体地，抗病毒治疗对IFN敏感性病毒有效。

根据具体的实施方案，所述IFN敏感性病毒选自冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、副流感病毒、黄病毒、肝炎病毒、单纯疱疹病毒、鼻病毒和痘苗病毒。

具体地，冠状病毒是β-冠状病毒、SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV-1、HCoV-OC43、HCoV-HKU1，以及α-冠状病毒，如HCoV-NL63、HCoV-229E或PEDV。

具体地，利用本文所述的甲型流感病毒变异体(delNS

具体地，据信在病毒进入位点局部诱导IFN比外源性(局部)或全身性提供IFN更有利，因此省略了干扰素常规局部或全身施用的副作用。

根据实施方案，本文所述的流感病毒或药物制剂用于治疗由IFN敏感性病毒引起的疾病状况，其中所述疾病状况是流感，普通感冒，鼻、鼻窦、咽喉的感染，毛细支气管炎，腹泻，皮疹，肺炎，或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。

具体地，本文所述的药物制剂经配制用于局部施用，优选施用于上呼吸道和下呼吸道、鼻内、肺、口内、眼或皮肤用途，或用于全身施用，优选通过静脉内、肌内、皮下、皮内、透皮或口服施用。

具体地，本文所述的药物制剂经配制用于鼻内施用。通过鼻内施用本文所述的甲型流感病毒变体诱导IFN既安全且耐受性良好。

具体地，所述制剂以喷雾、粉末、凝胶、软膏、乳膏、泡沫或液体溶液、洗剂、漱口液、气雾化粉末、气雾化液体制剂、颗粒、胶囊、滴剂、片剂、糖浆、锭剂或用于输注或注射的制剂的形式施用于受试者。

根据具体的实施方案，药物制剂作为单独的抗病毒物质施用，或者其中治疗与一种或多种活性物质的其他治疗组合，所述活性物质优选选自抗病毒物质和抗生素物质。

在实施方案中，已经感染或具有感染IFN敏感性病毒风险的受试者接受治疗，优选地，受试者为人、狗、猫、马、骆驼、牛或猪。

在本文的实施方案中，提供了本文所述的甲型流感病毒或药物制剂用于抑制IFN敏感性病毒复制的用途。

本文还提供了利用本发明甲型流感病毒在受试者中增加干扰素产生的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述甲型流感病毒的步骤。

具体地，向受试者多次施用甲型流感病毒。

具体地，根据本发明的甲型流感病毒还包含NA和HA蛋白的修饰。

在另一个实施方案中，所述甲型流感病毒包含PB1蛋白、PB2蛋白、PA蛋白和/或NP蛋白的修饰。

本文还提供了表达本文所述的复制缺陷型甲型流感病毒的分离的核酸序列。

具体地，分离的核酸序列包括SEQ ID NO:4、6、8、10和12中的任一项序列。

附图说明

图1：NS1缺失突变体在干扰素感受态细胞中的生长。用野生型流感病毒(WT NS)和不同的缺失突变体感染人成纤维细胞，所述不同的缺失突变体包括：NS1完全缺失的delNS1，对于其它缺失突变体，显示了NS1蛋白的缺失氨基酸。

图2：NS1缺失突变体在干扰素缺陷型Vero细胞中的生长。用不同缺失突变体感染细胞，并测定病毒滴度。显示了NS1缺失的长度，delNS1指NS1蛋白完全缺失。

图3：NS1缺失突变体诱导干扰素-β。用野生型流感病毒(WT NS)和不同缺失突变体感染人成纤维细胞。delNS1的NS1完全缺失，对于其它缺失突变体，显示了NS1蛋白的缺失氨基酸。

图4：PR8 NS1蛋白的核苷酸和氨基酸序列。

图5：雪貂在甲型H1N1 pdm09野生型病毒攻击感染之前(12h)和之后(12h和24h)接受流感delNS40-60治疗。感染后第2天测定攻击病毒的肺滴度。经处理和未处理动物之间的滴度差异具有显著性(p＝0.001)。

图6：K18-hACE2小鼠在Sars-CoV-2(UVE/SARS-CoV-2/2020/FR/702)攻击感染之前(1d)接受流感delNS40-60治疗。感染后第3天测定攻击病毒的肺滴度。经处理和未处理动物之间的滴度差异具有高度显著性(p<0.0001)。

图7：K18-hACE2小鼠在Sars-CoV-2(UVE/SARS-CoV-2/2020/FR/702)攻击感染之前(1d)接受流感delNS40-60治疗，并监测体重减轻情况。图中显示了攻击后第5天的体重减轻情况。经处理和未处理动物之间的体重减轻差异具有高度显著性(p＝0.0003)。

图8：delNS40-80(SEQ ID NO:11)、delNS40-60(SEQ ID NO:9)、delNS35-70(SEQID NO:7)、delNS15-73(SEQ ID NO:3)、野生型NS1(SEQ ID NO:1)在PR8病毒主链中氨基酸序列的比对。

具体实施方式

除非另有说明或定义，本文使用的所有术语在本领域中具有通常的含义，这对于本领域技术人员来说是清楚的。例如，参考标准手册，如分子克隆：实验室手册(Sambrooket al,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"(4th Ed.),Vols.1-3,Cold SpringHarbor Laboratory Press(2012)；Lewin基因XI(Krebs et al.,"Lewin′s Genes XI",Jones&Bartlett Learning,(2017))；詹韦免疫生物学(Murphy&Weaver,"Janeway′sImmunobiology"(9th Ed.,or更近的版本),Taylor&Francis Inc,2017)。

权利要求的主题具体涉及人造产品或采用或生产这种人造产品的方法，所述人造产品可以是天然(野生型)产品的变体。尽管可能与天然结构具有一定程度的序列同一性，但可以理解，本发明的材料、方法和用途，例如具体指分离的核酸序列、氨基酸序列、融合构建体、表达构建体、转化的宿主细胞和修饰的蛋白质，都是“人造的”或合成的，因此不认为是“自然法则”的结果。

本文使用的术语“包括”、“含有”、“具有”和“包含”可以用作同义词，并且应当理解为开放性定义，允许存在其他构件或部分或元件。“由……组成”被认为是最封闭的定义，没有组成定义特征以外的其他元件。因此，“包括”的范围更广，并包含“由……组成”的定义。

本文使用的术语“约”是指相同的值或与给定值相差+/-5％的值。

如本文和权利要求书中所使用的，单数形式，例如“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文另有明确说明。

如本文所用，氨基酸是指由61种三联体密码子编码的20个天然存在的氨基酸。这20种氨基酸可以分为带中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸。

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流感病毒有三种普遍类型，即甲型、乙型和丙型，根据其内部蛋白之间不存在血清学交叉反应性来定义。甲型流感病毒根据其糖蛋白HA和NA蛋白的抗原和遗传差异进一步分为各种亚型。大多数已知的HA和NA亚型(H1至H17和N1至N10)都是从鸟类中分离出来的，鸟类被认为是流感的天然宿主。

流感病毒颗粒由包含单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋核衣壳)和内衬基质蛋白(M1)的外部脂蛋白包的膜组成。甲型和乙型流感病毒的分段基因组由八个片段组成，丙型流感病毒的分段基因组由七个片段组成，这些片段为线性、负极性、单链RNA，编码十一种多肽，一些甲型流感毒株编码十种多肽，包括RNA依赖型RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核衣壳的核蛋白(NP)；基质膜蛋白(乙型流感分别为M1、M2或BM2)；从含脂质的包膜中突出的两种表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)和核输出蛋白(NEP，也称NS2)。乙型流感病毒还编码NB(一种可能具有离子通道活性的膜蛋白)，大多数甲型流感病毒株还编码一种据信具有促凋亡特性的第11种蛋白(PB1-F2)。基因组的转录和复制发生在细胞核中，通过质膜上出芽发生组装。在混合感染期间，这些病毒可以重新分配基因。流感病毒通过HA吸附至细胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酸寡糖。内吞病毒颗粒后，细胞内体中的HA分子发生构象变化，促进膜融合，从而触发脱膜。核衣壳迁移到细胞核，在细胞核内转录病毒mRNA。病毒mRNA通过一种独特机制进行转录和加工，在这种机制中病毒核酸内切酶从细胞异源mRNA切割封端的5'-末端，然后该细胞异源mRNA作为引物，通过病毒逆转录酶从病毒RNA模板中进行转录。转录物终止于距其模板末端15至22个碱基的位点，其中寡(U)序列作为添加Poly(A)尾的信号。在如此产生的甲型流感病毒的8种病毒RNA分子中，6种是单顺反子信息，直接翻译成代表HA、NA、NP的蛋白质和病毒聚合酶蛋白质PB2、PB1和PA。其它两个转录物进行剪接，每个产生两个mRNA，在不同的阅读框中翻译产生M1、M2、NS1和NS2。在大多数甲型流感病毒中，片段2还编码第二种蛋白(PB1-F2)，其由重叠阅读框表达。换言之，8种病毒RNA片段编码11种蛋白质：9种结构性蛋白质：2种非结构性蛋白质(NS1、PB1-F2)。

“重组”病毒是已经体外操作的病毒，例如，使用重组DNA技术，以在病毒基因组中引入改变，或者以其它方式人工产生的病毒。

NS1蛋白完全缺失的流感病毒(delNS1病毒)由于缺乏IFN拮抗剂NS1，会刺激I型IFN水平升高。出人意料地，已经表明NS1蛋白的N端80个氨基酸内至少15个氨基酸的靶向缺失与delNS1病毒相比，实现了IFN诱导水平的显著增加，同时与delNS1病毒相比，这些病毒在干扰素缺陷细胞中的生长特性也得到提高，而在正常细胞中的复制受阻止。因此，这些病毒变体具有优异的抗病毒特性。

本文所述的重组流感病毒的截短NS1蛋白在NS1蛋白的N端80个氨基酸内缺失了至少15个氨基酸，因此该病毒缺乏功能性NS1蛋白，但保留其效应结构域功能。可将其称为NS1流感病毒变体。具体地，参照WT PR8 NS1蛋白(SEQ ID NO:1)的编号，所述变体包括N端氨基酸14至73、或35至50、或35至70、或40至60、或40至80的缺失，其中所述氨基末端氨基酸为编号1。

所述功能性NS1蛋白的靶向部分缺失导致流感病毒的显著减弱，这是由于在干扰素感受态细胞或生物体中缺乏复制(复制缺陷表型)。如本文所述的包含NS1缺失的病毒不能拮抗感染细胞的细胞因子产生，因此诱导自我佐剂和免疫调节作用。用本发明的重组流感病毒免疫后，免疫应答具有感染细胞中I型干扰素产量增加的标志。

NS1活性的缺乏实现了复制缺陷型病毒非常有利的特性。具体地，当鼻内递送时，其感染上呼吸道细胞并表达病毒抗原，但其不形成病毒后代，且疫苗株不会被受体脱落，使得复制缺陷型delNS1

I型干扰素是干扰素蛋白的一个大亚群，帮助调节免疫系统的活性。干扰素与干扰素受体结合。所有I型IFN均与一种称为IFN-α受体(IFNAR)的特异性细胞表面受体复合物结合。哺乳动物类型命名为IFN-α(α)、IFN-β(β)、IFN-κ(κ)、IFN-δ(δ)、IFN-ε(ε)、IFN-τ(τ)、IFN-ω(ω)和IFN-ζ(ζ，也称为limitin)。使用本文所述的复制缺陷型甲型流感病毒变体，与未感染细胞相比，感染细胞特异性地产生水平增加的干扰素-β。

根据本发明，术语“复制缺陷型”定义为与野生型流感病毒复制速率相比，在干扰素感受态宿主细胞中的复制速率降低至少95％，优选99％，优选99.9％，所述复制速率通过本领域公知的血凝试验、TCID50试验或噬斑试验测定。具体地，流感病毒是完全复制缺陷的。

本文所述的流感病毒可以是人或动物流感病毒，例如但不限于禽、马和猪。优选地，它是人流感病毒。

复制缺陷型甲型流感病毒包含具有功能性效应结构域和非功能性RNA结合结构域，所述功能性效应结构域位于NS1蛋白C端(具体包括氨基酸79-230)，所述非功能性RNA结合结构域位于NS1蛋白N端，所述NS1蛋白缺失N端80个氨基酸内的至少15个氨基酸，具体地相对于具有SEQ ID NO:1的NS1蛋白的野生型NS1蛋白，包括缺失N端氨基酸14至73、35至50、35至70、40至60、或40至80。具体地，所述NS1蛋白包括SEQ ID NO:3、5、7、9和11中任一项的序列。

作为替代实施方案，流感病毒变体包括缺失NS1蛋白N端80个氨基酸内的氨基酸16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80。

术语“功能性效应结构域”是指NS1效应结构域，其能够引发对宿主转录的抑制并介导对宿主转录终止的全局失调。效应结构域特异性抑制报告基因表达，并与CPSF30(CPSF4，剪切和多聚腺苷酸化特异性因子4)或其它CPSF亚基相互作用。

根据本发明，重组流感病毒包括修饰的血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)多肽。

由于其外部定位，HA和NA抗原代表了宿主免疫系统最重要的病毒靶结构。在特异性结合HA的抗体中，认为它们可能通过阻断感染的早期步骤来中和病毒的传染性(Kidaetal.,1983)。NA特异性抗体通常不能防止靶细胞的初始感染，但恰好能防止病毒的传播。此外，由于竞争机制，对NA的免疫应答似乎被更频繁出现的HA抗原部分抑制(Kilbourne,1976)。

神经氨酸酶(NA)以四种相同多肽的四聚体形式聚集，当嵌入病毒包膜中时，约占病毒颗粒表面总糖蛋白的10–20％，平均大小为120nm的病毒颗粒上约有40–50个NA突起和300–400个HA突起(McAuley J.L.et al.,2019；Varghese et al.,1983；Ward et al.,1983；Moules et al.,2010)。四种单体，每种约470个氨基酸，折叠成四个不同的结构域：胞质尾、跨膜区、柄和催化头。所有减毒活疫苗亚型的N端结构域序列几乎100％保守，表明NA胞质尾部涉及关键的病毒功能。在该结构域中，含有位点特异性突变的反向工程化病毒表现出改变的病毒颗粒形态和降低的复制产量(Mitnaul et al.,1996；Jin et al.,1997；Barman et al.,2004)。经工程化以编码缺乏胞质尾部的NA的减毒活病毒仍可挽救，但为显著减毒的表型(Garcia-Sastre and Palese,1995)。表达缺乏胞质尾结构域的NA的病毒的形态改变和传染性降低被认为是由于缺乏与膜相关基质M1病毒蛋白的相互作用(McAuleyJ.L.et al.,2019；Enami and Enami,1996)，这最终改变了从受感染宿主细胞出芽的效率(Jin et al.,1997；Ali et al.,2000；Barman et al.,2001；Mintaev et al.,2014)。胞质尾结构域和跨膜结构域中的决定簇均有助于糖蛋白向顶端质膜的转运。然而，胞质尾结构域在将表面NA包装至病毒颗粒中的作用仍不清楚。胞质尾结构域的完全丢失(Garcia-Sastre and Palese,1995)导致受感染细胞中的NA量减少50％。除起始甲硫氨酸之外，缺失所有尾部氨基酸仍会产生病毒，还显示病毒颗粒中掺入的NA明显较少，但在这种情况下，NA以与野生型病毒相似的水平存在于质膜中(McAuley J.L.et al.,2019；Mitnaul et al.,1996)。

术语“血凝素”和“HA”是指任何流感病毒血凝素。在某些实施方案中，血凝素是流感血凝素，例如甲型流感血凝素、乙型流感血凝素或丙型流感血凝素。典型的血凝素包括本领域技术人员已知的结构域，包括信号肽(任选)、茎(stem)结构域(也称为茎(stalk)结构域)、球状头结构域、腔结构域(任选)、跨膜结构域(任选)和胞质结构域(任选)。在功能上，血凝素糖蛋白由免疫显性球形头结构域和膜近端茎结构域构成，免疫显性球形头结构域涉及将病毒附着于宿主细胞，膜近端茎结构域介导宿主内体中病毒和细胞膜的融合。术语“茎(stem)”和“茎(stalk)”在本文中可互换使用。在甲型流感(1类和2类)和乙型流感病毒中，茎结构域更为保守，使得针对该区域的抗体能够中和多种流感病毒亚型，并被鉴定为含有中和性B细胞表位。免疫显性HA头结构域具有恒定的抗原漂移或位移。HA茎结构域由三个螺旋束构成，在功能上是病毒进出宿主细胞期间涉及膜融合的pH诱导构象变化所必需的。与HA头结构域的可变性相反，茎结构域在流感病毒株之间表现出高得多的保守水平，在所有亚型之间一些中心残基是相同的(Krystal M,et al.,1982)。茎结构域的进化速度明显慢于头结构域。此外，与蛋白的全头结构域和茎结构域相比，广泛中和性单克隆抗体靶向的茎结构域中的交叉反应性表位的进化速度更慢(Kirkpatrick E.et al.,2018)。已在甲型流感HA的茎部分内鉴定出三个保护性表位，在1类和2类流感毒株之间具有不同水平的交叉反应性。表位1位于HA的HA2区的α螺旋中心。抗体靶向该表位也可对B毒株产生保护作用，但抗体必须具有独特的性质，以适应有助于掩盖表位表面的关键修饰(Dreyfus C.,et al,2012)。表位2和3对2类甲型流感亚型具有保护作用。表位2包括HA2中长α螺旋CD的上部(Wang T.T.et al.,2010)，而表位3位于跨越融合肽和螺旋封端环区域的HA2茎的基部(Ekiert D.C.,et al.,2011)。第四种保护性茎表位位于HA1的C端部分，可提供跨两种B毒株谱系的广泛保护(Yasugi M.,et al.,2013)。产生针对任何这些保守表位的强抗体应答，可通过规避对易于抗原漂移的表位的依赖，从而提供针对流感的更广泛和更持久的保护。

具体地，流感病毒是在WO2020152318A中描述的在PB1蛋白、M蛋白和NS2蛋白中特异性地包含一个或多个氨基酸取代的高生长流感病毒。

本文使用的术语“抗原性不同”是指存在被抗体应答靶向的不同抗原位点。不同的抗原性可能是由于流感病毒抗原漂移和位移导致的HA头结构域中的氨基酸取代。使用鼠单克隆抗体mAb和与抗原漂移相关的氨基酸序列变化分析(通过HI活性降低测量)，历史上确定了“经典”的抗原位点。头结构域的大多数突变集中在与免疫逃逸相关的位点，而茎结构域的大多数突变似乎均匀地分散在整个结构域中。(Kirkpatrick et al.,2018)。

如本文所用，术语“感染”是指病毒，特别是IFN敏感性病毒在细胞或受试者中的侵袭、增殖和/或存在。感染可以是“活性”感染，即病毒在细胞或受试者中复制的感染。这种感染的特征在于病毒从最初被病毒感染的细胞、组织和/或器官扩散到其它细胞、组织和/或器官。感染也可以是潜伏性感染，即病毒不复制的感染。在某些实施方案中，感染是指由于病毒存在于细胞或受试者中，或病毒对细胞或受试者的侵袭而导致的病理状态。本文中，感染是IFN敏感性病毒的感染，所述病毒例如但不限于冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、副流感病毒、黄病毒、肝炎病毒、单纯疱疹病毒、鼻病毒和痘苗病毒以及它们的任何组合。

如本文所用，病毒疾病是指细胞或受试者中存在IFN敏感性病毒或IFN敏感性病毒侵袭细胞或受试者所导致的病理状态。在具体的实施方案中，该术语指流感、普通感冒、鼻感染、鼻窦炎、咽喉感染、细支气管炎、腹泻、皮疹，或由所述病毒引起的肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。

如本文所用，术语“流感病毒疾病”是指由于流感(例如，甲型或乙型流感)病毒存在于细胞或受试者中或流感病毒对细胞或受试者的侵袭所引起的病理状态。在具体实施方案中，该术语是指由流感病毒引起的呼吸道疾病。

如本文所用，术语“冠状病毒疾病”是指由冠状病毒(例如β-冠状病毒，例如但不限于SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV-1、HCoV-OC43和HCoV-HKU1)在细胞或受试者中的存在或冠状病毒对细胞或受试者的侵袭所引起的病理状态。在具体实施方案中，该术语是指由冠状病毒引起的呼吸系统疾病。

如本文所用，术语“核酸”包括DNA分子(例如cDNA)和RNA分子(例如mRNA或pre-mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸可以是单链或双链的。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”可互换地使用，是指动物(例如，鸟类、爬行动物和哺乳动物)。在具体实施方案中，受试者是哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴、黑猩猩和人)。在某些实施方案中，受试者是非人类动物。在一些实施方案中，受试者是农场动物或宠物。在另一个实施方案中，受试者是人。

根据具体实施方案，包含本文所述的本发明甲型流感病毒的药物制剂还可包含一种或多种佐剂。

如本文所用，“佐剂”是指增强机体对抗原的免疫应答的物质或混合物，在本公开中，佐剂可增加细胞IFN水平。

术语“稳定剂”是指能够增加病毒稳定性的任何试剂，例如可以是牛血清白蛋白、糖、壳聚糖、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)等。

“施用”是指将本公开的药物制剂引入受试者；还可以指向受试者提供本公开的制剂的行为(例如，开处方)。该制剂可以使用多种已知的途径和技术向人或动物受试者体内施用。例如，制剂可以以可注射溶液、悬浮液或乳液的形式提供，并且可通过肠胃外、皮下、口服、表皮、皮内、肌内、动脉内、腹膜内、静脉内注射，使用常规的针和注射器，或使用液体喷射注射系统给药。

制剂可局部施用至皮肤或粘膜组织，如鼻、气管、肠、舌下、直肠或阴道，或以适于呼吸或肺部施用的细碎喷雾，例如薄雾形式提供。在某些实施方案中，制剂经肌内或鼻内施用。

本文所用关于抗病毒作用的术语“有效量”应指经证实具有抗病毒作用的量(特别是预定量)。该量通常是当施用于表面或施用于受试者时足以产生有益于所需结果(包括抗病毒或临床结果)的效果的量或活性，并且因此，有效量或其同义词取决于其应用的上下文。

药物制剂的有效量是指足以治疗、预防或抑制疾病、病症或紊乱的化合物的量。这种有效剂量具体是指足以导致愈合、预防或改善与本文所述疾病或病症相关的状况的化合物的量。

在疾病的上下文中，本文所述的有效量(特别是预防或治疗有效量)的甲型流感病毒具体用于治疗、调节、减弱、逆转或影响受益于其抗病毒作用的疾病或病症。对应于这种有效量的化合物的量将根据各种因素而变化，例如根据给定的药物或化合物、制剂、施用途径、疾病或紊乱的类型、接受治疗的受试者或宿主的身份、医学状况的评估和其它相关因素，但这些均可以由本领域技术人员常规地确定。具体地，该量导致用本文所述的delNS

有效量可以在约1×10

优选的结果是显著降低发热、减少体重减轻以及减少鼻甲和肺部中的攻击病毒，表明具有抗病毒作用。具体地，将复制缺陷型甲型流感病毒施用于将受到病毒感染的受试者或处于感染早期阶段的受试者。

利用有效量的本文所述的delNS

具体地，提供了一种联合疗法，其包括使用本文所述的制剂治疗以及针对病毒引起疾病的标准疗法，特别是针对冠状病毒引起疾病的标准疗法。

药剂可与其它活性剂(例如抗病毒剂、抗炎药物或抗生素)组合应用，例如根据受试者的病毒传播风险，以防止病原体相关反应。

治疗可以与抗病毒、抗炎或抗生素治疗组合，优选地，其中药物制剂在所述抗病毒、抗炎或抗生素治疗之前、期间(例如，通过共同给药或平行给药)或之后给药。

具体地，本文所述的delNS

具体地，本文所述的delNS

药物制剂可以配制成喷雾、粉末、凝胶、软膏、乳膏、泡沫或液体溶液、洗剂、漱口液、气雾化粉末、气雾化液体制剂、颗粒、胶囊、滴剂、片剂、糖浆、锭剂或用于输注或注射的制剂。

术语“药物制剂”或“药物组合物”或“药物配制剂”是指本文所述的重组流感病毒，其包含在NS1蛋白N端80个氨基酸内缺失至少15个氨基酸的NS1蛋白，以及其它化学组分，例如药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的一个目的是促进化合物施用于生物体。

如本文所用，“药学上可接受的载体”是指载体或稀释剂，其不会引起对生物体的显著刺激且不会消除所施用的疫苗组合物的生物活性和性质。它是指与药物制剂(例如，免疫原性制剂或疫苗制剂)一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可用作液体载体，特别是对于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。E.W.Martin的“雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”中描述了合适的药物载体例子。应根据给药方式选择制剂。具体制剂也可能取决于病毒是活的还是灭活的。

可以使用单位剂量或多剂量容器，例如，密封的安瓿瓶和小瓶，或者单次使用和多次使用的喷雾剂，并且可以包含液相或干相储存，例如，储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前添加无菌液体载体，例如注射用水。优选的单位剂量制剂是含有日剂量或单位日亚剂量或多剂量的本文所述delNS

本文使用的术语“单次剂量”以下列方式理解。单次剂量或单次使用量是指用于单个受试者的给药量，如用于单个病例/程序/给药的患者(人或动物)。

本文所述的药物制剂具体提供为人或兽用药物产品或药物组合物。

本文所述的流感病毒也可用于制备重配病毒(reassortant virus)，包括6:1:1重配体、6:2重配体和7:1重配体。根据本发明的6:1:1重配体是具有6个内部基因片段、来自不同的第二种病毒分离物的NA基因片段和来自第三种分离物的HA基因片段的流感病毒；6:2重配体是具有6个内部基因片段和来自不同(第二种)病毒分离物的NA基因片段和HA基因片段的流感病毒；7:1重配体是具有来自疫苗病毒的6个内部基因片段和NA基因片段以及来自与疫苗病毒不同的病毒来源的HA基因片段的流感病毒，或者具有6个内部基因片段和HA基因片段，以及来自与疫苗病毒不同的病毒来源的NA基因片段的流感病毒。作为替代方案，5:1:2重配体也包含在本发明中。

6:2重配病毒通过反向遗传学产生。NS1可来源于任何甲型流感病毒，例如但不限于A/Puerto Rico/08/1934、A/IVR-116(一种含有来自A/Puerto Rico/08/1934的PB2、PA、NP、M和NS基因以及来自A/Texas/1/1977的PB1的实验室甲型流感毒株)、A/Hong/4801/2014、A/Texas/1/1977。

具体地，NS1蛋白源自A/Puerto Rico/08/1934。

本发明的复制缺陷型甲型流感病毒可通过本领域熟知的方法在干扰素缺陷型细胞中产生，例如Vero细胞。考虑到每天和每个受试者约8-9log

在一些实施方案中，将并入一种甲型流感病毒株的至少6个内部基因组片段以及编码不同流感病毒株的免疫原性流感表面抗原的一个或多个基因组片段的多个载体引入至宿主细胞群体中。例如，将选定甲型流感毒株的至少6个内部基因组片段(“骨架”)以及编码源自另一种病毒株的免疫原性抗原的一个或多个片段引入宿主细胞群中，所述选定甲型流感毒株例如是编码重组流感病毒的人造工程化甲型流感骨架毒株，所述重组流感病毒包含NS1片段，所述NS1片段包括NS1蛋白至少15个至多80个氨基酸的缺失，所述NS1蛋白是例如但不限于A/Puerto Rico/08/1934、A/IVR-116、A/Hong/4801/2014和A/Texas/1/1977。通常，免疫原性表面抗原包括血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)抗原中的一种或两种。在引入编码免疫原性表面抗原的单个片段的实施方案中，选定病毒的7个互补片段也被引入宿主细胞。

在进一步实施方案中，本文提供了编码NS1蛋白的甲型流感病毒载体，所述NS1蛋白具有功能性效应结构域和非功能性RNA结合结构域，所述NS1蛋白缺失N端80个氨基酸内的至少15个氨基酸。具体地，所述核酸序列选自SEQ ID NO:4、6、8、10和12。

在进一步实施方案中，本文提供了多种流感病毒载体，用于制备重配甲型流感病毒，所述重配甲型流感病毒包含修饰的NS1片段，其编码本文所述的具有功能性效应结构域和非功能性RNA结合结构域的NS1蛋白，所述NS1蛋白缺失N端80个氨基酸内的至少15个氨基酸，所述载体包括：

a)用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PB1 DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PB2 DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒HA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒NP DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒NA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒M DNA的启动子；以及用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码NS1蛋白的流感病毒NS cDNA的启动子，所述NS1蛋白具有功能性效应结构域和非功能性RNA结合结构域，所述NS1蛋白缺失N端80个氨基酸内的至少15个氨基酸，具体地编码SEQ ID NO:3、5、7、9、11中任一项的序列；任选地包括：

b)用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PB1的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PB2的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NP的DNA片段的启动子；任选地，用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒HA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒M1的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒M2的DNA片段的启动子；或用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NS2的DNA片段的启动子。

在另一个实施方案中，本文提供了多种流感病毒载体，包括：

a)用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PB1 DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PB2 DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒HA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒NP DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒NA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒M DNA的启动子；以及用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码修饰的NS片段的流感病毒NS cDNA的启动子，所述流感病毒NS cDNA编码具有功能性效应结构域和非功能性RNA结合结构域的NS1蛋白，所述NS1蛋白缺失N端80个氨基酸内的至少15个氨基酸，具体地编码SEQ ID NO:3、5、7、9、11中任一项的序列；以及

b)用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PB1的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PB2的DNA片段的启动子；和用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NP的DNA片段的启动子；以及任选地，用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒HA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒M1的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒M2的DNA片段的启动子；或用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NS2的DNA片段的启动子。

在另一个实施方案中，本文提供了多种流感病毒载体，包括：

a)用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PB1 DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PB2 DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒HA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒NP DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒NA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒M DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码修饰的NS片段的流感病毒NS cDNA的启动子，所述流感病毒NS cDNA编码具有功能性效应结构域和非功能性RNA结合结构域的NS1蛋白，所述NS1蛋白缺失N端80个氨基酸内的至少15个氨基酸，具体地编码SEQ ID NO:3、5、7、9、11中任一项的序列；

b)用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PB1的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PB2的DNA片段的启动子；和用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NP的DNA片段的启动子；以及任选地，用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒HA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒M1的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒M2的DNA片段的启动子；或用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NS2的DNA片段的启动子。

根据本发明的另一个实施方案，本文提供了制备本文所述的甲型流感病毒的方法，所述方法通过使细胞与以下载体接触：

a)用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PB1 DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PB2 DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒HA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒NP DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒NA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒M DNA的启动子；以及用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码修饰的NS片段的流感病毒NS cDNA的启动子，所述流感病毒NS cDNA编码具有功能性效应结构域和非功能性RNA结合结构域的NS1蛋白，所述NS1蛋白缺失N端80个氨基酸内的至少15个氨基酸，具体地编码SEQ ID NO:3、5、7、9、11中任一项的序列；以及任选地

b)用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PB1的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PB2的DNA片段的启动子；和用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NP的DNA片段的启动子；以及任选地，用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒HA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒M1的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒M2的DNA片段的启动子；或用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NS2的DNA片段的启动子。

在实施方案中进一步提供了制备本发明的甲型流感病毒的方法，所述方法通过使细胞与以下载体接触：

a)用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PB1 DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PB2 DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒HA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒NP DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒NA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接至与转录终止序列连接的流感病毒M DNA的启动子；以及用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接至编码修饰的NS片段的流感病毒NS cDNA的启动子，所述流感病毒NS cDNA编码具有功能性效应结构域和非功能性RNA结合结构域的NS1蛋白，所述NS1蛋白缺失N端80个氨基酸内的至少15个氨基酸，具体地编码SEQ ID NO:3、5、7、9、11中任一项的序列，

b)用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PB1的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PB2的DNA片段的启动子；和用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NP的DNA片段的启动子；以及任选地，用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒HA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒M1的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒M2的DNA片段的启动子；或用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NS2的DNA片段的启动子。

在进一步方面，本文提供了制备本文所述的甲型流感病毒的方法，所述方法通过使细胞与以下载体接触：

a)用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PB1 DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒PB2 DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒HA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒NP DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒NA DNA的启动子；用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到与转录终止序列连接的流感病毒M DNA的启动子；以及用于vRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码包含修饰的NS片段的重组流感病毒的流感病毒NS cDNA的启动子，所述流感病毒NS cDNA编码从其N端至C端包含NS1蛋白的融合蛋白，所述NS1蛋白具有功能性效应结构域和非功能性RNA结合结构域，所述NS1蛋白缺失N端80个氨基酸内的具有至少15个氨基酸；用于mRNA产生的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PA的DNA片段的启动子；用于mRNA产生的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PB1的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒PB2的DNA片段的启动子；和用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NP的DNA片段的启动子；以及任选地，用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒HA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NA的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒M1的DNA片段的启动子；用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒M2的DNA片段的启动子；或用于mRNA生产的载体，其包含可操作地连接到编码流感病毒NS2的DNA片段的启动子。

本发明还包括以下项：

1.复制缺陷型甲型流感病毒，所述甲型流感病毒在被其感染的细胞中诱导高水平的I型干扰素(IFN)，所述甲型流感病毒包含具有功能性效应结构域和非功能性RNA结合结构域的NS1蛋白，所述NS1蛋白缺失N端80个氨基酸内的至少15个氨基酸。

2.根据第1项所述的甲型流感病毒，参照SEQ ID NO:1的编号，所述甲型流感病毒包含N端氨基酸15至73、35至50、35至70、40至60或40至80的缺失。

3.根据第1或2项所述的甲型流感病毒，其中所述病毒包括SEQ ID NO:3、5、7、9和11中任一项的序列。

4.药物制剂，包含根据第1至3项中任一项所述的甲型流感病毒，任选地与药学上可接受的载体组合。

5.根据第1至3项中任一项所述的甲型流感病毒，或根据第4项所述的药物制剂，用于制备用于治疗性治疗受试者的药物。

6.根据第1至3项中任一项所述的甲型流感病毒，或根据第4项所述的药物制剂，用于制备用于治疗性治疗需要抗病毒治疗的受试者的药物。

7.根据第5或6项所用的甲型流感病毒或药物制剂，其中所述抗病毒治疗对IFN敏感性病毒有效。

8.根据第5至7项中任一项所用的流感病毒或药物制剂，其中所述IFN敏感性病毒选自冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、副流感病毒、黄病毒、肝炎病毒、单纯疱疹病毒、鼻病毒和痘苗病毒。

9.根据第5至8项中任一项所用的流感病毒或药物制剂，其中所述冠状病毒是β-冠状病毒、SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV-1、HCoV-OC43、HCoV-HKU1，以及α-冠状病毒，例如HCoV-NL63、HCoV-229E或PEDV。

10.根据第5至9项中任一项所用的流感病毒或药物制剂，用于治疗由IFN敏感性病毒引起的疾病状况，其中所述疾病状况是流感，普通感冒，鼻、鼻窦、咽喉的感染，毛细支气管炎，腹泻，皮疹或肺炎，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。

11.根据第4项所述的药物制剂，其经配制用于局部施用，优选施用于上呼吸道和下呼吸道、鼻内、肺、口内、眼或皮肤用途，或用于全身施用，优选通过静脉内、肌内、皮下、皮内、透皮或口服施用，具体地，经配制用于鼻内施用。

12.根据第11项所述的药物制剂，其中所述药物制剂以喷雾、粉末、凝胶、软膏、乳膏、泡沫或液体溶液、洗剂、漱口液、气雾化粉末、气雾化液体制剂、颗粒、胶囊、滴剂、片剂、糖浆、锭剂或用于输注或注射的制剂的形式施用于受试者。

13.根据第5项所述的药物制剂，其中所述制剂作为单独的抗病毒物质施用，或其中所述制剂与包含一种或多种活性物质的其他制剂组合，优选地，所述活性物质选自抗病毒物质和抗生素物质。

14.根据第4项所述的药物制剂，其中已经感染IFN敏感性病毒或具有感染IFN敏感性病毒风险的受试者接受治疗，优选地，受试者为人、狗、猫、马、骆驼、牛或猪。

15.根据第1至3项中任一项所述的甲型流感病毒或根据第4项所述的药物制剂用于抑制IFN敏感性病毒的复制的用途。

16.使用第1至3项中任一项所述的甲型流感病毒来增加受试者中干扰素产生的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的所述甲型流感病毒的步骤。

17.根据第16项所述的方法，其中向受试者多次施用所述甲型流感病毒。

18.根据第1至3项中任一项所述的甲型流感病毒，还包含NA和HA蛋白的修饰。

19.根据第1至3项中任一项所述的甲型流感病毒，还包含PB1蛋白、PB2蛋白、PA蛋白和/或NP蛋白的修饰。

本文描述的示例是对本发明的举例说明，而不旨在对本发明构成限制。已经根据本发明描述了本发明的不同实施例。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以对本文描述和示出的技术进行许多修改和变化。因此，应当理解，这些实施例仅是说明性的，并不限制本发明的范围。

实施例1：野生型流感病毒和NS1缺失突变体在干扰素感受态人成纤维细胞中的生长。在培养基中存在0.5％10×TrypLE胰蛋白酶的情况下，将野生型流感病毒、NS1缺失突变体(NS1基因完全缺失)和不同NS1缺失突变体以MOI为0.01进行感染后，分析了它们在干扰素感受态人成纤维细胞中的生长特性。与感染后(p.i.)24小时后生长至滴度5.55log

本发明编码NS1蛋白的NS基因的核苷酸(Nt)序列和NS1蛋白的氨基酸序列如下：

DelNS15-73的氨基酸序列：

MDPNTVSSFQVDCFDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSRDWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIMDKNIILKANFSVIFDRLETLILLRAFTEEGAIVGEISPLPSLPGHTAEDVKNAVGVLIGGLEWNDNTVRVSETLQRFAWRSSNENGRPPLTPKQKREMAGTIRSEV(SEQ ID NO:3)。

DelNS15-73的Nt序列：

AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACTGACATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGCGATCATGGATAAGAACATCATACTGAAAGCGAACTTCAGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTGCTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTGCTGAGGATGTCAAAAATGCAGTTGGAGTCCTCATCGGGGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTCGAGTCTCTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGAGAAATGGCGGGAACAATTAGGTCAGAAGTTTGAAGAAATAAGATGGTTGATTGAAGAAGTGAGACACAAACTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAACATTTATGCAAGCCTTACATCTATTGCTTGAAGTGGAGCAAGAGATAAGAACTTTCTCGTTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT(SEQ ID NO:4)。

DelNS35-50的氨基酸序列

MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSRDWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIMDKNIILKANFSVIFDRLETLILLRAFTEEGAIVGEISPLPSLPGHTAEDVKNAVGVLIGGLEWNDNTVRVSETLQRFAWRSSNENGRPPLTPKQKREMAGTIRSEV(SEQ IDNO:5)。

DelNS35-50的Nt序列

AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATGGTCTGGACATCGAGACAGCCACACGTGCTGGAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAAGAATCCGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACTGACATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGCGATCATGGATAAGAACATCATACTGAAAGCGAACTTCAGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTGCTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTGCTGAGGATGTCAAAAATGCAGTTGGAGTCCTCATCGGGGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTCGAGTCTCTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGAGAAATGGCGGGAACAATTAGGTCAGAAGTTTGAAGAAATAAGATGGTTGATTGAAGAAGTGAGACACAAACTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAACATTTATGCAAGCCTTACATCTATTGCTTGAAGTGGAGCAAGAGATAAGAACTTTCTCGTTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT(SEQ ID NO:6)。

DelNS35-70的氨基酸序列

MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSRDWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIMDKNIILKANFSVIFDRLETLILLRAFTEEGAIVGEISPLPSLPGHTAEDVKNAVGVLIGGLEWNDNTVRVSETLQRFAWRSSNENGRPPLTPKQKREMAGTIRSEV(SEQ ID NO:7)。

DelNS35-70的Nt序列

AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATGAAGAATCCGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACTGACATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGCGATCATGGATAAGAACATCATACTGAAAGCGAACTTCAGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTGCTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTGCTGAGGATGTCAAAAATGCAGTTGGAGTCCTCATCGGGGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTCGAGTCTCTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGAGAAATGGCGGGAACAATTAGGTCAGAAGTTTGAAGAAATAAGATGGTTGATTGAAGAAGTGAGACACAAACTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAACATTTATGCAAGCCTTACATCTATTGCTTGAAGTGGAGCAAGAGATAAGAACTTTCTCGTTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT(SEQ ID NO:8)。

DelNS40-60的氨基酸序列

MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSRDWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIMDKNIILKANFSVIFDRLETLILLRAFTEEGAIVGEISPLPSLPGHTAEDVKNAVGVLIGGLEWNDNTVRVSETLQRFAWRSSNENGRPPLTPKQKREMAGTIRSEV(SEQ ID NO:9)。

DelNS40-60的Nt序列

AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATGGAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAAGAATCCGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACTGACATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGCGATCATGGATAAGAACATCATACTGAAAGCGAACTTCAGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTGCTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTGCTGAGGATGTCAAAAATGCAGTTGGAGTCCTCATCGGGGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTCGAGTCTCTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGAGAAATGGCGGGAACAATTAGGTCAGAAGTTTGAAGAAATAAGATGGTTGATTGAAGAAGTGAGACACAAACTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAACATTTATGCAAGCCTTACATCTATTGCTTGAAGTGGAGCAAGAGATAAGAACTTTCTCGTTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT(SEQ ID NO:10)。

DelNS40-80的氨基酸序列

MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDMASVPASRYLTDMTLEEMSRDWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIMDKNIILKANFSVIFDRLETLILLRAFTEEGAIVGEISPLPSLPGHTAEDVKNAVGVLIGGLEWNDNTVRVSETLQRFAWRSSNENGRPPLTPKQKREMAGTIRSEV(SEQ ID NO:11)。

DelNS40-80的Nt序列

AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACTGACATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGCGATCATGGATAAGAACATCATACTGAAAGCGAACTTCAGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTGCTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTGCTGAGGATGTCAAAAATGCAGTTGGAGTCCTCATCGGGGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTCGAGTCTCTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGAGAAATGGCGGGAACAATTAGGTCAGAAGTTTGAAGAAATAAGATGGTTGATTGAAGAAGTGAGACACAAACTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAACATTTATGCAAGCCTTACATCTATTGCTTGAAGTGGAGCAAGAGATAAGAACTTTCTCGTTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT(SEQ ID NO:12)。

图1显示了NS1缺失突变体在干扰素感受态细胞中的生长。用野生型流感病毒(WTNS)和不同的缺失突变体感染人成纤维细胞，所述不同的缺失突变体包括：NS1完全缺失的delNS1，对于其它缺失突变体，显示了NS1蛋白的缺失氨基酸。

实施例2：野生型流感病毒和NS1缺失突变体在干扰素缺陷型Vero细胞中的生长。在培养基中存在0.5％10×TrypLE胰蛋白酶的情况下，分析了不同NS1缺失突变体(显示了缺失长度)以MOI为0.001感染后在Vero细胞上的生长特性。感染48小时后收获上清液，并测定不同缺失突变体的病毒滴度。重要的是，所有NS1缺失突变体生长至高于8log

图2显示了NS1缺失突变体在干扰素缺陷型Vero细胞中的生长。用不同缺失突变体感染细胞，并测定病毒滴度。显示了NS1缺失的长度。

实施例3：NS1缺失突变体诱导干扰素β。

分析了野生型流感病毒、NS1基因完全缺失的NS1缺失突变体和不同的NS1缺失突变体以MOI为10感染人成纤维细胞后，诱导干扰素(IFN)β的能力。感染后(p.i.)2小时，向培养基中补充10％ FCS。感染后24小时，通过ELISA分析上清液中是否存在IFN。所有缺失突变体诱导的IFN水平都显著高于NS1完全缺失的病毒和野生型病毒(图3)。

图3显示了NS1缺失突变体对干扰素β的诱导作用。用野生型流感病毒(WT NS)和不同的缺失突变体感染人成纤维细胞。delNS1的NS1完全缺失，对于其它缺失突变体，显示了NS1蛋白的缺失氨基酸。在中间缺失突变体中发现了>300pg/ml的大量IFN-β，但未在完全缺失突变体或野生型中发现。

实施例4：

在动物模型中测试了delNS40-60缺失突变体(NS1蛋白氨基酸40-60缺失的甲型流感/新喀里多尼亚病毒)的抗病毒活性。在雪貂模型中测试了对流感病毒的抑制作用，并在小鼠ACE2模型中检测了对Sars-CoV-2的抑制作用。雪貂在感染疫情流感H1N1pdm09野生型病毒前后的不同时间点接受delNS40-60处理。攻击后，鼻腔冲洗液滴度中的H1N1pdm09攻击病毒显著减少(图5)，表明这种治疗具有保护作用。在小鼠模型中，在感染Sars-CoV-2病毒之前和/或之后的不同时间点用delNS40-60处理小鼠。感染后肺部的Sars-CoV-2攻击病毒显著减少(图6)，表明治疗具有保护作用。对于疾病的另一个指标，用delNS40-60预处理，体重减轻也从约20％显著降低至5％(图7)。

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                         序列表

<110>  蓝天免疫疗法有限责任公司

<120>  诱导高水平I型干扰素的新型复制缺陷型甲型流感病毒

<130>  P23JM1WN00384AT

<150>  EP20210630.8

<151>  2020 - 11 - 30

<160>  12

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  230

<212>  PRT

<213>  人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>  全长NS1蛋白的氨基酸序列

<400>  1

Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp

1               5                   10                  15

His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe

            20                  25                  30

Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser

        35                  40                  45

Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gln Ile

    50                  55                  60

Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr

65                  70                  75                  80

Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu

                85                  90                  95

Glu Met Ser Arg Asp Trp Ser Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala

            100                 105                 110

Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile

        115                 120                 125

Ile Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Asp Arg Leu Glu Thr Leu

    130                 135                 140

Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile

145                 150                 155                 160

Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Ala Glu Asp Val Lys Asn

                165                 170                 175

Ala Val Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val

            180                 185                 190

Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asn Glu

        195                 200                 205

Asn Gly Arg Pro Pro Leu Thr Pro Lys Gln Lys Arg Glu Met Ala Gly

    210                 215                 220

Thr Ile Arg Ser Glu Val

225                 230

<210>  2

<211>  890

<212>  DNA

<213>  人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>  全长NS基因的核苷酸序列

<400>  2

agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag      60

attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat     120

tccttgatcg gcttcgccga gatcagaaat ccctaagagg aaggggcagc accctcggtc     180

tggacatcga gacagccaca cgtgctggaa agcagatagt ggagcggatt ctgaaagaag     240

aatccgatga ggcacttaaa atgaccatgg cctctgtacc tgcgtcgcgt tacctaactg     300

acatgactct tgaggaaatg tcaagggact ggtccatgct catacccaag cagaaagtgg     360

caggccctct ttgtatcaga atggaccagg cgatcatgga taagaacatc atactgaaag     420

cgaacttcag tgtgattttt gaccggctgg agactctaat attgctaagg gctttcaccg     480

aagagggagc aattgttggc gaaatttcac cattgccttc tcttccagga catactgctg     540

aggatgtcaa aaatgcagtt ggagtcctca tcgggggact tgaatggaat gataacacag     600

ttcgagtctc tgaaactcta cagagattcg cttggagaag cagtaatgag aatgggagac     660

ctccactcac tccaaaacag aaacgagaaa tggcgggaac aattaggtca gaagtttgaa     720

gaaataagat ggttgattga agaagtgaga cacaaactga agataacaga gaatagtttt     780

gagcaaataa catttatgca agccttacat ctattgcttg aagtggagca agagataaga     840

actttctcgt ttcagcttat ttaataataa aaaacaccct tgtttctact                890

<210>  3

<211>  171

<212>  PRT

<213>  人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>  DelNS15-73的氨基酸序列

<400>  3

Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Asp Glu

1               5                   10                  15

Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu Thr

            20                  25                  30

Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Asp Trp Ser Met Leu Ile Pro

        35                  40                  45

Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile

    50                  55                  60

Met Asp Lys Asn Ile Ile Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Asp

65                  70                  75                  80

Arg Leu Glu Thr Leu Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Glu Gly Ala

                85                  90                  95

Ile Val Gly Glu Ile Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Ala

            100                 105                 110

Glu Asp Val Lys Asn Ala Val Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu Glu Trp

        115                 120                 125

Asn Asp Asn Thr Val Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp

    130                 135                 140

Arg Ser Ser Asn Glu Asn Gly Arg Pro Pro Leu Thr Pro Lys Gln Lys

145                 150                 155                 160

Arg Glu Met Ala Gly Thr Ile Arg Ser Glu Val

                165                 170

<210>  4

<211>  713

<212>  DNA

<213>  人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>  DelNS15-73的Nt序列

<400>  4

agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag      60

attgctttga tgaggcactt aaaatgacca tggcctctgt acctgcgtcg cgttacctaa     120

ctgacatgac tcttgaggaa atgtcaaggg actggtccat gctcataccc aagcagaaag     180

tggcaggccc tctttgtatc agaatggacc aggcgatcat ggataagaac atcatactga     240

aagcgaactt cagtgtgatt tttgaccggc tggagactct aatattgcta agggctttca     300

ccgaagaggg agcaattgtt ggcgaaattt caccattgcc ttctcttcca ggacatactg     360

ctgaggatgt caaaaatgca gttggagtcc tcatcggggg acttgaatgg aatgataaca     420

cagttcgagt ctctgaaact ctacagagat tcgcttggag aagcagtaat gagaatggga     480

gacctccact cactccaaaa cagaaacgag aaatggcggg aacaattagg tcagaagttt     540

gaagaaataa gatggttgat tgaagaagtg agacacaaac tgaagataac agagaatagt     600

tttgagcaaa taacatttat gcaagcctta catctattgc ttgaagtgga gcaagagata     660

agaactttct cgtttcagct tatttaataa taaaaaacac ccttgtttct act            713

<210>  5

<211>  214

<212>  PRT

<213>  人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>  DelNS35-50的氨基酸序列

<400>  5

Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp

1               5                   10                  15

His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe

            20                  25                  30

Leu Asp Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gln Ile

        35                  40                  45

Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr

    50                  55                  60

Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu

65                  70                  75                  80

Glu Met Ser Arg Asp Trp Ser Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala

                85                  90                  95

Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile

            100                 105                 110

Ile Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Asp Arg Leu Glu Thr Leu

        115                 120                 125

Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile

    130                 135                 140

Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Ala Glu Asp Val Lys Asn

145                 150                 155                 160

Ala Val Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val

                165                 170                 175

Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asn Glu

            180                 185                 190

Asn Gly Arg Pro Pro Leu Thr Pro Lys Gln Lys Arg Glu Met Ala Gly

        195                 200                 205

Thr Ile Arg Ser Glu Val

    210

<210>  6

<211>  842

<212>  DNA

<213>  人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>  DelNS35-50的Nt序列

<400>  6

agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag      60

attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat     120

tccttgatgg tctggacatc gagacagcca cacgtgctgg aaagcagata gtggagcgga     180

ttctgaaaga agaatccgat gaggcactta aaatgaccat ggcctctgta cctgcgtcgc     240

gttacctaac tgacatgact cttgaggaaa tgtcaaggga ctggtccatg ctcataccca     300

agcagaaagt ggcaggccct ctttgtatca gaatggacca ggcgatcatg gataagaaca     360

tcatactgaa agcgaacttc agtgtgattt ttgaccggct ggagactcta atattgctaa     420

gggctttcac cgaagaggga gcaattgttg gcgaaatttc accattgcct tctcttccag     480

gacatactgc tgaggatgtc aaaaatgcag ttggagtcct catcggggga cttgaatgga     540

atgataacac agttcgagtc tctgaaactc tacagagatt cgcttggaga agcagtaatg     600

agaatgggag acctccactc actccaaaac agaaacgaga aatggcggga acaattaggt     660

cagaagtttg aagaaataag atggttgatt gaagaagtga gacacaaact gaagataaca     720

gagaatagtt ttgagcaaat aacatttatg caagccttac atctattgct tgaagtggag     780

caagagataa gaactttctc gtttcagctt atttaataat aaaaaacacc cttgtttcta     840

ct                                                                    842

<210>  7

<211>  194

<212>  PRT

<213>  人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>  DelNS35-70的氨基酸序列

<400>  7

Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp

1               5                   10                  15

His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe

            20                  25                  30

Leu Asp Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val

        35                  40                  45

Pro Ala Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg

    50                  55                  60

Asp Trp Ser Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys

65                  70                  75                  80

Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile Ile Leu Lys Ala

                85                  90                  95

Asn Phe Ser Val Ile Phe Asp Arg Leu Glu Thr Leu Ile Leu Leu Arg

            100                 105                 110

Ala Phe Thr Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile Ser Pro Leu Pro

        115                 120                 125

Ser Leu Pro Gly His Thr Ala Glu Asp Val Lys Asn Ala Val Gly Val

    130                 135                 140

Leu Ile Gly Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val Arg Val Ser Glu

145                 150                 155                 160

Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asn Glu Asn Gly Arg Pro

                165                 170                 175

Pro Leu Thr Pro Lys Gln Lys Arg Glu Met Ala Gly Thr Ile Arg Ser

            180                 185                 190

Glu Val

<210>  8

<211>  782

<212>  DNA

<213>  人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>  DelNS35-70的Nt序列

<400>  8

agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag      60

attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat     120

tccttgatga agaatccgat gaggcactta aaatgaccat ggcctctgta cctgcgtcgc     180

gttacctaac tgacatgact cttgaggaaa tgtcaaggga ctggtccatg ctcataccca     240

agcagaaagt ggcaggccct ctttgtatca gaatggacca ggcgatcatg gataagaaca     300

tcatactgaa agcgaacttc agtgtgattt ttgaccggct ggagactcta atattgctaa     360

gggctttcac cgaagaggga gcaattgttg gcgaaatttc accattgcct tctcttccag     420

gacatactgc tgaggatgtc aaaaatgcag ttggagtcct catcggggga cttgaatgga     480

atgataacac agttcgagtc tctgaaactc tacagagatt cgcttggaga agcagtaatg     540

agaatgggag acctccactc actccaaaac agaaacgaga aatggcggga acaattaggt     600

cagaagtttg aagaaataag atggttgatt gaagaagtga gacacaaact gaagataaca     660

gagaatagtt ttgagcaaat aacatttatg caagccttac atctattgct tgaagtggag     720

caagagataa gaactttctc gtttcagctt atttaataat aaaaaacacc cttgtttcta     780

ct                                                                    782

<210>  9

<211>  209

<212>  PRT

<213>  人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>  DelNS40-60的氨基酸序列

<400>  9

Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp

1               5                   10                  15

His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe

            20                  25                  30

Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu

        35                  40                  45

Lys Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro

    50                  55                  60

Ala Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Asp

65                  70                  75                  80

Trp Ser Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile

                85                  90                  95

Arg Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile Ile Leu Lys Ala Asn

            100                 105                 110

Phe Ser Val Ile Phe Asp Arg Leu Glu Thr Leu Ile Leu Leu Arg Ala

        115                 120                 125

Phe Thr Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile Ser Pro Leu Pro Ser

    130                 135                 140

Leu Pro Gly His Thr Ala Glu Asp Val Lys Asn Ala Val Gly Val Leu

145                 150                 155                 160

Ile Gly Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val Arg Val Ser Glu Thr

                165                 170                 175

Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asn Glu Asn Gly Arg Pro Pro

            180                 185                 190

Leu Thr Pro Lys Gln Lys Arg Glu Met Ala Gly Thr Ile Arg Ser Glu

        195                 200                 205

Val

<210>  10

<211>  827

<212>  DNA

<213>  人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>  DelNS40-60的Nt序列

<400>  10

agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag      60

attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat     120

tccttgatcg gcttcgccga gatggaaagc agatagtgga gcggattctg aaagaagaat     180

ccgatgaggc acttaaaatg accatggcct ctgtacctgc gtcgcgttac ctaactgaca     240

tgactcttga ggaaatgtca agggactggt ccatgctcat acccaagcag aaagtggcag     300

gccctctttg tatcagaatg gaccaggcga tcatggataa gaacatcata ctgaaagcga     360

acttcagtgt gatttttgac cggctggaga ctctaatatt gctaagggct ttcaccgaag     420

agggagcaat tgttggcgaa atttcaccat tgccttctct tccaggacat actgctgagg     480

atgtcaaaaa tgcagttgga gtcctcatcg ggggacttga atggaatgat aacacagttc     540

gagtctctga aactctacag agattcgctt ggagaagcag taatgagaat gggagacctc     600

cactcactcc aaaacagaaa cgagaaatgg cgggaacaat taggtcagaa gtttgaagaa     660

ataagatggt tgattgaaga agtgagacac aaactgaaga taacagagaa tagttttgag     720

caaataacat ttatgcaagc cttacatcta ttgcttgaag tggagcaaga gataagaact     780

ttctcgtttc agcttattta ataataaaaa acacccttgt ttctact                   827

<210>  11

<211>  189

<212>  PRT

<213>  人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>  DelNS40-80的氨基酸序列

<400>  11

Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp

1               5                   10                  15

His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe

            20                  25                  30

Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr

        35                  40                  45

Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Asp Trp Ser Met Leu

    50                  55                  60

Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln

65                  70                  75                  80

Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile Ile Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile

                85                  90                  95

Phe Asp Arg Leu Glu Thr Leu Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Glu

            100                 105                 110

Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His

        115                 120                 125

Thr Ala Glu Asp Val Lys Asn Ala Val Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu

    130                 135                 140

Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe

145                 150                 155                 160

Ala Trp Arg Ser Ser Asn Glu Asn Gly Arg Pro Pro Leu Thr Pro Lys

                165                 170                 175

Gln Lys Arg Glu Met Ala Gly Thr Ile Arg Ser Glu Val

            180                 185

<210>  12

<211>  767

<212>  DNA

<213>  人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223>  DelNS40-80的Nt序列

<400>  12

agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag      60

attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat     120

tccttgatcg gcttcgccga gatatggcct ctgtacctgc gtcgcgttac ctaactgaca     180

tgactcttga ggaaatgtca agggactggt ccatgctcat acccaagcag aaagtggcag     240

gccctctttg tatcagaatg gaccaggcga tcatggataa gaacatcata ctgaaagcga     300

acttcagtgt gatttttgac cggctggaga ctctaatatt gctaagggct ttcaccgaag     360

agggagcaat tgttggcgaa atttcaccat tgccttctct tccaggacat actgctgagg     420

atgtcaaaaa tgcagttgga gtcctcatcg ggggacttga atggaatgat aacacagttc     480

gagtctctga aactctacag agattcgctt ggagaagcag taatgagaat gggagacctc     540

cactcactcc aaaacagaaa cgagaaatgg cgggaacaat taggtcagaa gtttgaagaa     600

ataagatggt tgattgaaga agtgagacac aaactgaaga taacagagaa tagttttgag     660

caaataacat ttatgcaagc cttacatcta ttgcttgaag tggagcaaga gataagaact     720

ttctcgtttc agcttattta ataataaaaa acacccttgt ttctact                   767