一种肝硬化合并门静脉系统血栓形成的诊断模型及其应用

摘要

本发明提供了一种肝硬化合并门静脉系统血栓形成的诊断模型及其应用。本发明使用16S rRNA基因测序对有门静脉系统血栓形成的肝硬化组和无门静脉系统血栓形成的肝硬化组之间的微生物群落组成进行了分析，基于该分析结果构建了肝硬化合并门静脉系统血栓形成的诊断模型，为肝硬化合并门静脉系统血栓形成的诊断提供了新方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种肝硬化合并门静脉系统血栓形成的诊断模型及其应用。

背景技术

门静脉系统血栓(portal vein thrombosis，PVT)形成是肝硬化(livercirrhosis，LC)患者常见的并发症。根据不同的报道，肝硬化中PVT的患病率差异很大，从0.6％到25％不等，而一般人群为(0.7～1.0)/100 000。PVT的形成机制是，患者从低凝状态转变为获得性高凝状态，临床上其可发展成危及生命的并发症，如食管/胃静脉曲张破裂出血或肠梗塞。肝硬化的PVT的发病机制可能是多因素的，主要与Virchow三要素的改变有关:门静脉血流减少，高凝性和血管壁损伤。由于血流动力学改变和门脉高压，细菌移位在肝硬化中很常见。微生物及其产物从肠腔进入肠系膜淋巴结和全身循环，刺激肝内免疫信号的级联，从而促进纤维化和肝内血管张力的变化，导致门静脉高压症恶化。目前临床上存在不能及早诊断肝硬化合并门静脉系统血栓形成的问题，因此，有必要寻找一种无创、准确的诊断手段。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种诊断肝硬化合并门静脉系统血栓形成的方法。

本发明采用了如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种诊断肝硬化合并门静脉系统血栓形成的微生物标志物，所述的微生物标志物包括g__Ligilactobacillus、g__Pseudomonas、g__Parabacteroides、g__Lactococcus和/或g__Weissella。

进一步，所述的微生物标志物为g__Ligilactobacillus、g__Pseudomonas、Parabacteroides、Lactococcus和Weissella。

本发明中所述的“诊断”，是指分子或病理学状态、疾病或病症的鉴定或分类。例如，通过分子特征(例如，微生物群落、特定基因、特定基因所编码的蛋白质)，早期鉴别诊断受试者是否患有肝硬化合并门静脉系统血栓形成的风险。在本发明的具体实施方式中，所述用于诊断肝硬化合并门静脉系统血栓形成的微生物标志物为Ligilactobacillus、Pseudomonas、Parabacteroides、Lactococcus和/或Weissella，优选地，所述微生物标志物为粪便样本中的微生物标志物Ligilactobacillus、Pseudomonas、Parabacteroides、Lactococcus和Weissella联合。进一步，所述诊断肝硬化合并门静脉系统血栓形成的微生物标志物为诊断区分伴有门静脉系统血栓形成的肝硬化患者和无门静脉系统血栓形成的肝硬化的患者的微生物标志物。

本发明第二方面提供了检测样本中本发明第一方面所述的微生物标志物丰度的试剂在制备诊断肝硬化合并门静脉系统血栓形成的产品中的应用。

本发明中所述的“丰度”，是指生物样品中目标微生物的数量的量度。“丰度”也被称为“负载”。生物样品内目标核酸序列丰度的定量可能是绝对的或相对的。“相对定量”通常是基于一个或多个内部参考基因，即来自参考菌株的16S rRNA基因，比如使用通用引物并且将目标核酸序列的丰度表达为总细菌16S rRNA基因拷贝的百分比或通过大肠杆菌16SrRNA基因拷贝归一化而测定的总细菌。“绝对定量”通过与DNA标准进行比较或通过DNA浓度归一化来给出目标分子的确切数目。

进一步，所述的产品包括试剂盒、试纸、或芯片。

本发明中所述的“试剂盒”，不仅包含用于特异性检测所述微生物标志物的引物、探针、反义寡核苷酸、适体或抗体等，还包括一种或多种适用于分析方法的其他成分组合物、溶液或装置。在本发明的一个实施方式中，所述包含对所述微生物标志物具有特异性的引物的试剂盒可以是含有用于进行PCR等的扩增反应的基本元件的试剂盒。例如，用于PCR的试剂盒可以包括试管或其他合适的容器、反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTP)、酶(如Taq聚合酶和逆转录酶)、脱氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNAse)抑试剂、DEPC-水、或无菌水等。

术语“芯片”可指具有附着有吸附剂的、一般为平面的表面的固体基底。生物芯片的表面可包含多个可寻址的位置，其中每个位置可结合有吸附剂。生物芯片可适合于接合探针接口，并因此用作探针。蛋白质生物芯片适用于捕获多肽，并可包含在可寻址位置处附着有层析或生物特异性吸附剂的表面。微阵列芯片一般用于DNA和RNA基因表达检测。

本发明中使用的术语“样本”或“测试样本”指的是含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中，测试样本从生物源获取(即，“生物样本”)，比如培养中的细胞，或者是来自动物且最优选地来自人类的样本。在示例性实施方式中，所述样本是粪便。

本发明的方法和产品可以用来利用获取自个体的生物样本来检测与各种细菌有关的核酸。可以根据本领域的技术人员所熟知的任何方法将该核酸(DNA或RNA)从所述样本中分离出来。可以通过标准步骤来获取生物样本并且可以立即使用所述生物样本，或者可以在适于该类型的生物样本的条件下储存该生物样本以备后续使用。

进一步，所述的试剂包括采用如下任一种或多种方法检测样本中微生物标志物丰度的试剂：宏基因组测序、16S rDNA测序、和/或qPCR定量检测。

进一步，所述的试剂包括所述微生物标志物的特异性的引物或探针。

如本文所述的术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

如本文所述的术语“引物”的意思是，能够形成与模板链互补的碱基对(basepair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。

进一步，所述的试剂还包括所述微生物标志物的特异性的反义寡核苷酸、适配体或抗体。

术语“寡核苷酸”指的是由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任意组合构成的短聚合物。寡核苷酸的长度通常在大10个核苷酸和大约100个核苷酸之间。寡核苷酸优选地长度为15个核苷酸到70个核苷酸，最通常的是20个核苷酸到26个核苷酸。寡核苷酸可以用作引物或探针。

术语“适配体”是通过链内碱基间的氢键作用折叠形成稳定的发卡、茎环、假结、口袋、凸环和G-四链体等二级或三级结构，并与靶标产生空间结构匹配的高亲和力和特异性结合的核糖核酸和单链脱氧核糖核酸。

在本发明中，术语“抗体”以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体，多克隆抗体，具有多表位特异性的抗体，单链抗体，多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。

本发明第三方面提供了一种利用本发明第一方面所述的微生物标志物诊断或预测肝硬化合并门静脉系统血栓形成的系统，所述系统包括核酸样本分离装置、测序装置、比对装置，所述比对装置与所述测序装置相连。

进一步，所述比对装置包括数据处理单元和结果判定单元。

本发明第四方面提供了检测样本中本发明第一方面所述的微生物标志物丰度的试剂在构建预测肝硬化合并门静脉系统血栓形成的计算模型中的用途。

在本发明中，“模型”是任何数学方程式，算法，分析或程序化过程或统计技术，其采用一个或多个连续或分类输入并计算输出值，有时称为“索引”，“索引值”，“预测器”，“预测值”，“概率”或“概率得分”。“公式”的非限制性示例包括和、比率以及回归算子，例如系数或指数，生物标志物值转换和标准化，规则和指南，统计分类模型以及对历史群体进行训练的神经网络。在组(panel)和组合构造中，特别有趣的是结构和句法统计分类算法，以及利用模式识别特征的风险指数构建方法，包括已建立的技术，例如互相关，主成分分析(PCA)，因子旋转，对数回归(LogReg)，线性判别分析(LDA)，特征基因线性判别分析(EigengeneLinearDiscriminant Analysis,ELDA)，支持向量机(Support VectorMachines，SVM)，随机森林(Random Forest,RF)，递归分区树(RPART)、XGBoost(XGB)以及其他相关的决策树分类技术，ShrunkenCentroids(SC)，StepAIC，最近的Kth邻居(Kth-Nearest Neighbor)，Boosting，决策树(Decision Trees)，神经网络，贝叶斯网络，支持向量机和隐马尔可夫模型(Hidden MarkovModels)等。还进一步实现了许多此类算法技术，以执行特征(基因座)选择和规则化(regularization)规则化，例如在岭回归(ridgeregression)，lasso和elastic net等中。其他技术可用于生存和事件前时间危险分析(time to event hazardanalysis)中，包括本领域技术人员众所周知的Cox，Weibull，Kaplan-Meier和Greenwood模型。这些技术中的许多技术都可以与生物标志物选择技术结合使用，例如正向选择，后向选择或逐步选择，给定大小的所有潜在生物标志物集或组的完整枚举，遗传算法或它们本身可以包括生物标志物选择方法。这些可以与信息标准结合使用，例如Akaike的信息标准(Akaike'sInformation Criterion，AIC)或贝叶斯信息标准(Bayes InformationCriterion，BIC)，以便量化其他生物标志物和模型改进之间的权衡，并有助于最小化过度拟合。生成的预测模型可以在其他研究中进行验证，或在它们最初进行培训的研究中交叉验证，使用诸如Bootstrap，Leave-One-Out(LOO)和10倍交叉验证(10-Fold cross-validation)(10倍CV)等技术进行。在各个步骤，可以根据本领域已知的技术通过值排列来估计错误发现率。

进一步，所述计算模型的输入变量为肝硬化合并门静脉系统血栓形成的微生物标志物的丰度值。

本发明第五方面提供了一种筛选治疗肝硬化合并门静脉系统血栓形成的候选药物的方法，所述的方法包括检测化合物干预之前和干预之后的本发明第一方面所述的微生物标志物的丰度或者含量，

进一步，所述的方法包括：

(1)采集候选化合物治疗或干预前后的个体粪便样本并妥善保存；

(2)从个体粪便中提取DNA；

(3)以粪便DNA为模板，对16s rRNA基因进行PCR扩增和建库；

(4)对16s rRNA基因进行测序，获得测序结果；

(5)对测序结果进行生物信息学分析，确定所述个体的粪便中所述微生物标志物的量。

本申请所用的术语“曲线下面积”或“AUC”是指本技术领域中所众所周知的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve；ROC)的下面积。曲线下面积(AUC)测定有助于经由整体数据范围来比较分类器的准确性。具有更大的曲线下面积(AUC)的分类器具有更大的能力以在两个感兴趣的组之间准确分类未知物。在于区别两个群体方面上，受试者工作特征曲线(ROC)有用于以图表形式来表现特定的特征(例如，本发明中所描述的生物标志物和/或额外的生物医学信息的任意项目)的性能。通常，基于单一特征值，经由整个群体(例如，患者组及对照组)的上述特征数据被升序排列。然后，针对上述特征的每个值，计算对于数据的真阳性率及假阳性率。通过计算高于针对其特性的值以上的病例数之后，除以总病例数来测定上述真阳性率。通过计算高于针对其特性的值以上的对照组数之后，除以总对照组数来测定上述假阳性率。尽管该定义是指患者组的特性相对于对照组高的情况，但该定义还适用于患者组的特性相对于对照组低的情况(在这种情况下，可计算出低于上述特性的值的样本的数)。受试者工作特征曲线(ROC)可以针对其他单一计算，还可针对单一特性生成，为了提供单一和值，例如，可数学性地组合两个以上的特性(例如，加、减等)，该单一和值可由受试者工作特征曲线(ROC)来表示。附加地，能够以受试者工作特征曲线(ROC)来画出可导出单一计算值的多重特性的组合。这些特性组合可构成测试。上述受试者工作特征曲线(ROC)为表示相对于测试的假阳性率(1-特异性)的测试的真阳性率(灵敏度)的图表。

附图说明

图1为本发明所涉及的微生物标志物在肝硬化合并门静脉系统血栓形成患者样本中的差异情况统计图，

图2为有PVT的LC组和LC对照组之间肠道微生物区系的不同分布图，其中，图A是数量最多的20个门，图B是数量最多的20个属；

图3为有PVT的LC组和LC对照组中粪便微生物区系α和β多样性指数图，其中，图A为Chao1指数、图B为观察到的物种多样性指数，图C为系统发育多样性(PD)全树距离指数，图D为通过未加权相似性分析(ANOSIMs)评估检测到的粪便微生物群落之间的相似性水平的结果图；

图4为有PVT的LC组和LC对照组的粪便微生物群的分类差异图，其中，图为A为显示两组粪便样品中主要细菌的相对丰度的LDA评分直方图，图B为LEfSe分析两组之间粪便微生物群进化的结果图；

图5为评估预测模型的实验结果图，其中，图A为使用平均递减精度和基尼系数来评估预测模型中每个属的相对重要性的结果图，图B为预测模型的ROC曲线图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实验方法

1、实验设计和患者

在2022年1月至2022年12月期间进行的这项前瞻性观察研究中，连续招募了肝硬化(LC)患者。LC的诊断是基于临床、实验室和放射学分析和/或肝脏活检。PVT的诊断依据LC(2020，上海)对PVT处理的共识。纳入标准包括：年龄>18岁和<75岁，临床、影像、肝脏瞬时弹性成像(TE)和实验室值符合的良好特征的肝硬化。排除标准包括：纳入研究时的抗凝；肝细胞癌；妊娠；既往肝移植；既往经颈静脉肝内门体分流术(TIPS)/外科分流术；全身肿瘤。本研究由四川省人民医院伦理委员会批准(No.SCCT2021-525)。所有患者均征得知情同意。

2、粪便样本

所有参与者都被引导获取标准化的粪便样本收集。新鲜粪便样本在2小时内用冰袋运送到实验室。然后立即冷冻所有样本，并在分析前将其储存在-80℃。

3、DNA提取和微生物组分析

按照制造商的说明，使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒(Qiagen，德国)从粪便样品中提取微生物DNA。采用以下引物对细菌16S核糖体rna基因V3-V4区进行PCR扩增:341F正向引物(5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′，SEQ ID NO.1)和806R反向引物(5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′，SEQ ID NO.2)。扩增子从2％琼脂糖凝胶中提取，根据制造商的说明使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,usa)纯化，并使用

4、生物信息学分析

采用Usearch软件对数据进行嵌合和聚类分析。在Usearch聚类过程中，首先对Reads进行从大到小的丰度排序，然后以97％的相似度聚类得到操作分类单位(otu)。鉴定和删除嵌合体后，构建OTU-profiling表，并使用RDP数据库对基因序列进行分类。利用QIIME1的ASV表计算Chao1丰富度估计、观测物种、Shannon多样性指数、Simpson指数、Faith’s PD和Good’s盖度等α-多样性指标，并将其可视化为箱形图。利用加权的UniFrac和Bray-Curtis计算样本之间的距离来估计Beta多样性，并通过主坐标分析(PCoA)进行可视化。基于Unifrac算法进行相似性分析(ANOSIM)。利用效应量(LEfSe)的线性判别分析(LDA)确定两组间存在显著差异的类群。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析评价有PVT的肝硬化组和无PVT的肝硬化组的临床诊断价值。

5、统计分析

采用SPSS 26.0软件进行统计分析。符合正态分布的连续变量用均数±标准差表示，差异通过t检验比较。非正态分布的连续变量通过非参数检验进行比较。分类变量描述为整数和百分比，组间比较采用Fisher精确检验。p值<0.05认为有统计学意义。

实施例1与肠道微生物在肝硬化合并门静脉系统血栓形成相关的肠道微生物

检测本发明所述的微生物在8例有PVT的肝硬化患者和8例无PVT的肝硬化患者之间的差异情况。

如图1、表1所示，本发明所述的微生物在有PVT的肝硬化患者和无PVT的肝硬化患者之间呈显著差异，证明本发明所述的微生物可用于区分有PVT的肝硬化患者和无PVT的肝硬化患者。

表1本发明所涉及的微生物标志物在肝硬化合并门静脉系统血栓形成患者样本中的差异情况

实施例2检测肝硬化合并门静脉系统血栓形成患者肠道微生物区系的动态变化

1、临床特点

将12例有PVT的肝硬化患者和21例无PVT的肝硬化患者纳入这项横断面研究。受试者的人口学特征和临床参数总结如表2。合并PVT的LC患者的血小板和D-二聚体水平高于对照组。在性别、BMI、其他实验室指标、肝硬化的主要病因和Child-Pugh分级方面没有统计学意义上的差异(表2)。

表2试者的人口学特征和临床参数

BMI，身体质量指数；ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天冬氨酸转氨酶；PT，凝血酶原时间；TB，总胆汁酸；SCr，血清肌酐；INR，国际标准化比率；FIB，纤维蛋白原；WBC，白细胞.*P<0.05。

2、肝硬化合并门静脉系统血栓形成患者肠道微生物区系分析

本发明首先在门和属的水平上分析了两个组的肠道微生物的种类组成和丰度。浮游植物、变形杆菌、放线杆菌和拟杆菌合计占两组相对丰度的95％以上。与对照组相比，LC加PVT组的细菌丰度(66.2％比65.1％)和变形杆菌(17.0％比16.4％)相对较低，而放线菌(8.8％比9.7％)和拟杆菌(6.4％比3.2％)的丰度较高(图2A)。在属水平上，LC对照中最丰富的5个细菌类群是：布鲁氏菌(13.2％)、大肠埃希菌/志贺氏菌(14.3％)、链球菌(11.2％)、肠球菌(7.3％)和其他未知属(16.7％)。而在LC合并PVT组中有：布鲁氏菌(20.2％)、链球菌(11.5％)、乳杆菌(10.4％)、大肠埃希菌/志贺菌(8.3％)和其他未知属(19.7％)(图2B)。两组肠道微生物区系α多样性比较显示，LC+PVT组的Chao1、观察到的物种多样性指数和PD多样性指数均显著高于对照组。基于未加权的UniFrac的Beta多样性的PCoA表明，两组之间的群落组成差异显著(图3D)。使用LDA和LIFSE分析来确定两组之间的肠道微生物区系差异。本发明使用截止值为2.0的对数LDA分数来识别重要的分类差异，并显示了前30个差异的肠道微生物区系。本发明的结果表明，两组之间的粪便微生物区系有显著差异。本发明发现，PVT的LC中相对含量最高的是乳杆菌、厌氧丁酸菌、阿克曼杆菌、镰刀菌、假单胞菌和厌氧菌。相比之下，在LC对照组中发现肠球菌、利莫西乳杆菌、卫氏杆菌、类杆菌、副杆菌、乳杆菌、乳球菌、地中海杆菌、Phocaeicola、Collinsella和乳杆菌含量较高(图4A和B)。

实施例3肝硬化伴PVT的肠道菌群预测模型构建

鉴于本发明的研究结果已经确定了两组肠道微生物群的显着差异，本发明试图开发一组微生物小组来预测是否存在合并PVT的LC。本发明通过随机森林模型选择了5个细菌属(Ligilactobacillus,Pseudomonas,Parabacteroides,Lactococcus和Weissella)。本发明使用ROC分析来评估样本分类的准确性。在特异性和敏感性分析中，曲线下面积(AUC)为100.0％。因此，本发明认为该肠道微生物模型可以作为肝硬化合并门静脉系统血栓形成的诊断模型(图5)。

需要说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。