外泌体蛋白在制备辅助诊断间质性肺疾病产品中的应用

摘要

本发明公开了外泌体蛋白在制备辅助诊断间质性肺疾病产品中的应用，属于蛋白质检测技术领域，所述外泌体蛋白选自外泌体上LAMC1、PSMA3、PTPRG，所述产品包括样本处理液、磁珠包被物、发光物标记的检测抗体、发光底物、蛋白校准品。本发明提供了外泌体上LAMC1、PSMA3、PTPRG在制备辅助诊断间质性肺疾病产品的应用，有更高的特异性和灵敏度，在间质性肺疾病早期诊断中具有重要的临床价值和推广前景。

说明书

技术领域

本发明涉及标志物检测技术领域，尤其涉及一种外泌体蛋白检测技术领域。

背景技术

间质性肺疾病(Interstitial Lung Disease，ILD)是全身性疾病的一个重要类别，是家族性、支气管肺炎和肺部感染以外的非感染性广泛性肺部疾病。ILD的特点是呈不均匀性的肺结构损害和肺部炎症反应，在一般常规胸部X线片影像检查中容易出现表面性的稠滞、结节性的肺部改变等现象。ILD的发作可由多种原因导致，具体可分类为免疫性学病、非免疫性学病和特发性肺结节病，常见的免疫性学病有硝酸苯酚致病性肺病、特发性间质性肺病和肺结核，而非免疫性学病包括肺部慢性职业性疾病、肺部外源性化学性或物理性损伤，以及各种集合病(如系统性硬化症、硫酸钠肺炎、结核性肺炎等)。

ILD的诊断是基于这类病人的肺功能检测、胸部CT检查、胸部X线检查、组织病理学检查以及血液检测结果，结果需要融合病人的临床、影像学以及实验室检查等多方面信息，在对ILD的临床表现进行准确诊断和调整治疗方案时，存在许多困难和不足。血清学诊断具有及时性强、诊断成本低、过程简便等优势。KL-6(Krebs Von den Lungen-6，涎液化糖链抗原)检测是一项有效的诊断间质性肺疾病的实验室检查项目，已被广泛应用于临床，可以在早期诊断间质性肺疾病，从而改善患者的预后，但KL-6检测存在假阴性较多等问题。因此在ILD的诊断过程中，需要结合多种检测手段和临床信息，综合分析和评估，以确保诊断的准确性和有效性。

外泌体或细胞外囊泡(exosomes)是微小膜质囊泡，其直径在30-100nm之间。它们是一种细胞内外交换载体，可分布于体内多个组织中，包括体液。外泌体的组分包括膜脂、多糖、蛋白质和核酸等。外泌体在血液诊断中有着重要的价值和优势，因为它们可以提供血液中缺乏或无法获得的原始细胞组分信息。外泌体和血液样本中的研究已表明，外泌体可用于发现临床上有重要价值的生物分子。外泌体的用途可以很好的进行艾滋病毒的诊断和治疗监测，比传统的方法更精确和可行。此外，外泌体也可用于诊断癌症和心脏病，更加精确的分析出身体的病变状况，并为临床治疗提供有价值的信息。它们可以用来进行快速、精准、非侵入性和有效的病理和临床诊断，然而现有的间质性肺疾病血清学诊断技术在临床符合率较低。

发明内容

本发明的目的在于提供外泌体蛋白在制备辅助诊断间质性肺疾病产品中的应用，以解决间质性肺疾病血清学诊断技术在临床符合率较低的问题。

针对间质性肺疾病血清学诊断临床符合率较低的问题，本发明通过提取ILD患者和健康人血清样本的外泌体后进行质谱测序，获得了一系列外泌体来源的蛋白信息，并通过差异化分析筛选到能够有效区分ILD和健康人的靶标。通过对这些靶标进行免疫检测验证，我们进一步筛选出LAMC1(层粘连蛋白γ1)、PSMA3(人蛋白酶体α亚基3型)、PTPRG(蛋白酪氨酸磷酸酶受体G)三个具有较高临床价值的蛋白靶标，基于此开发出以外泌体上LAMC1、PSMA3、PTPRG蛋白质作为标志物用于辅助诊断间质性肺疾病的产品及其检测方法。

本发明提及的健康人是指没有任何肺部疾病的人群。

LAMC1(层粘连蛋白γ1)，分子量为177.6KDa，是胞内的分泌大分子糖蛋白，在基底膜和平滑肌中表达。在介导细胞附着和渗透中起关键作用。有研究表明LAMC1可以作为识别H-1PV(溶瘤病毒)易感性的生物标志物，依据其表达水平对癌症患者进行分类，以便于预测不同类型的癌症对基于H-1PV的抗癌疗法的敏感性和反应性。最新研究发现LAMC1的上调可以促进ESCC细胞增殖和迁移，可能是食管鳞状细胞癌(ESCC)的潜在治疗靶点和预后标志物。LAMC1基因在成纤维细胞中存在特异性表达，但其与间质性肺疾病以及肺纤维化的相关性仍未见报道。

人蛋白酶体α亚基3型(PSMA3)，分子量28.4KDa,是20S蛋白酶体复合物的17个必需亚基之一，有助于20S蛋白酶体复合物的完整组装。20S蛋白酶参与大多数细胞内蛋白质的蛋白水解降解。受损的复合体组装或功能失调的蛋白酶体可能与特定疾病的潜在病理生理学相关，蛋白酶体是泛素-蛋白酶体系统(UPS)和相应的细胞蛋白质质量控制(PQC)的关键组成部分。蛋白质泛素化和随后的蛋白酶体水解和降解是调节细胞周期、细胞生长和分化、基因转录、信号转导和细胞凋亡的重要机制。UPS参与炎症反应的调节。这种活性通常归因于蛋白酶体在NF-κB激活中的作用，NF-κB进一步调节促炎细胞因子如TNF-α、IL-β、IL-8、粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、前列腺素和一氧化氮(NO)的释放。此外，UPS还在炎症反应中发挥作用，作为白细胞增殖的调节剂，主要通过细胞周期素的蛋白水解和CDK的降解抑制剂。受损的蛋白酶体复合物导致蛋白水解活性降低以及蛋白质酶体复合物积累。这种蛋白质积累可能与神经退行性疾病、心血管疾病、炎症反应和自身免疫性疾病和恶性肿瘤相关。

PTPRG属于受体酪氨酸磷酯酶家族成员蛋白，可以通过去磷酸化的方式抑制多种酪氨酸激酶的活性。受体酪氨酸磷酯酶(receptor tyrosine phosphatases)为单次跨膜蛋白受体，受体胞内区具有蛋白酪氨酸磷酯酶的活性，胞外配体与受体结合激发该酶活性，使特异的胞内信号蛋白的磷酸酪氨酸残基去磷酸化，其作用是控制磷酸酪氨酸残基的寿命，使静止细胞具有较低的磷酸酪氨酸残基的水平。它的作用不是简单的与RPTK相反，可能与酪氨酸激酶一起协同工作，如参与细胞周期调控。白细胞表面的CD45也属于这类受体，对具体配体的尚不了解。

为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：

外泌体蛋白在制备辅助诊断间质性肺疾病产品中的应用，所述外泌体蛋白选自外泌体上LAMC1、PSMA3、PTPRG。

辅助诊断肺部疾病产品包括辅助诊断间质性肺疾病试剂或试剂盒。

进一步地，所述产品包括样本处理液、磁珠包被物、发光物标记的检测抗体、发光底物、蛋白校准品。

进一步地，所述产品包括样本处理液、磁珠包被物工作液、发光物标记的检测抗体工作液、发光底物、蛋白校准品。

进一步地，所述磁珠包被物工作液的制备过程包括：磁珠活化，活化后的磁珠与捕获抗体孵育，然后加入封闭剂处理，接着超声处理，得到捕获抗体包被磁珠即磁珠包被物，使用磁珠包被物稀释液稀释磁珠包被物。

进一步地，所述磁珠包被物工作液的详细制备过程包括：磁珠缓冲液和磁珠混匀得到磁珠浓度为10mg/mL的磁珠溶液，依次加入20mg/mL EDC溶液25μL和40mg/mLNHS溶液25μL，室温反应60min，后通过磁分离去除上清，1mL磁珠缓冲液重悬磁珠，加入200μg待包被的捕获抗体，室温孵育2h，然后加入100μL封闭剂，室温孵育1h，重复多次磁分离和PBS缓冲液重悬，功率10％超声处理磁珠重悬液，分离去上清，磁珠包被物稀释液稀释捕获抗体包被磁珠，得到的磁珠包被物工作液的浓度为0.8mg/mL。

进一步地，所述磁珠缓冲液是MES缓冲液；

所述捕获抗体选自LAMC1捕获抗体、PSMA3捕获抗体、PTPRG捕获抗体；

所述封闭剂是含质量分数1％BSA的PBS缓冲液；

磁珠包被物稀释液成分为：按质量分数计，TRIS 0.1％，NaCl 0.9％，BSA 3％，Tween-200.1％，叠氮钠0.1％，其余为水。

进一步地，所述发光物标记的检测抗体工作液的制备过程包括：检测抗体加入标记缓冲液，再加入已偶联NHS的发光物混匀反应；往反应液中加入淬灭剂反应，得到发光物标记的检测抗体，使用标记物保存液稀释为发光物标记的检测抗体保存液，使用发光标记物稀释液稀释发光物标记的检测抗体保存液，得到发光物标记的检测抗体工作液。

进一步地，所述发光物标记的检测抗体工作液的制备过程包括：将200μg的检测抗体加入到500μL标记缓冲液中，再加入10mg/mL已偶联NHS的发光物25μL，混匀反应60min，加入淬灭剂，室温反应30min，得到发光物标记的检测抗体，使用标记物保存液稀释为200μg/mL发光物标记的检测抗体保存液；使用标记物稀释液稀释发光物标记的检测抗体保存液，得到0.4μg/mL发光物标记的检测抗体工作液。

进一步地，所述检测抗体选自LAMC1检测抗体、PSMA3检测抗体、PTPRG检测抗体；

标记缓冲液是0.1M的碳酸氢钠缓冲液；

淬灭剂是含质量分数10％赖氨酸的水溶液；

标记物保存液是：按质量分数计，含0.2％BSA和0.1％PC300的PBS溶液；

所述标记物稀释液的成分为：按质量分数计，MES 1％、NaCl 0.9％、BSA2％、Tween-200.1％、十二烷基肌氨酸钠(NLS)0.2％、SB3-140.2％、牛γ-球蛋白0.05％、Proclin 3000.1％，其余为水,pH6.0。

进一步地，所述发光物为吖啶酯、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶中的任意一种；

在本说明书公开的前提下，本领域技术人员能够准确理解所述发光底物可以视发光物具体种类而进行具体选择，比如，发光物为吖啶酯时，发光底物可以选择为：AE预激发液、激发液；

样本处理液包括以下重量百分比的原料：TRIS 0.9％、EDTA-2Na0.05％、NaCl0.9％、BSA 2％、CHAPS 1％、Tween-800.5％、海藻糖2％、ProClin 3000.1％，其余为水,pH7.5；

所述蛋白校准品选自LAMC1蛋白校准品、PSMA3蛋白校准品、PTPRG蛋白校准品。

一种应用所述辅助诊断间质性肺疾病产品进行外泌体蛋白含量检测的化学发光检测方法，步骤如下：

(1)对待测外泌体样本进行预处理：待测外泌体样本与样本处理液混合反应；

(2)将步骤(1)得到的预处理后的样本与磁珠包被物工作液混合，反应得到磁珠-抗原复合物；

(3)将步骤(2)得到的磁珠-抗原复合物与发光物标记的检测抗体工作液混合，反应得到磁珠-抗原-检测抗体复合物；

(4)将步骤(3)得到的磁珠-抗原-检测抗体复合物与发光底物混合，反应，检测发光强度；

(5)使用标准曲线法，根据步骤(4)检测得到的发光强度计算得到待测外泌体样本中蛋白的含量。

更优地，步骤(1)中待测外泌体样本与样本处理液的体积比为1：(2-30)。

更优地，步骤(1)中待测外泌体样本与样本处理液的体积比为1:2、1：5、1:10、1:12、1:15、1:18、1:20、1:22、1:25、1:28或1:30。

更优地，步骤(1)中外泌体样本与样本处理液反应时间1-120min；优选的，反应时间为1-10min。

更优地，反应时间为1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。

更优地，步骤(1)中外泌体样本与样本处理液反应温度为25-42℃；优选的，反应温度为35-40℃。

更优地，反应温度为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃。

更优地，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中反应时间为1-120min；优选地，反应时间为5-15min。

更优地，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中反应时间为5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min。

更优地，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中反应温度为25-42℃；优选的，反应温度为35-40℃。

更优地，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中反应温度为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。

更优地，待测外泌体样本可以为全血、血清、血浆、支气管肺泡灌注液或尿液中的任意一种待测样本制备得到。

更优地，待测外泌体样本的制备方法为全自动外泌体提取仪器或试剂盒法，优选地，使用全自动外泌体提取仪器。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明首次提供了外泌体上LAMC1、PSMA3、PTPRG蛋白质中任意一项或两项以上蛋白检测用于间质性肺疾病辅助诊断的策略，利用化学发光法检测发光强度并计算浓度值，该诊断策略相比于传统血清检测试剂盒有更高的特异性和灵敏度，实现了外泌体上蛋白的稳定检测，在间质性肺疾病早期诊断中具有重要的临床价值和推广前景；对于外泌体蛋白质的研究具有重要价值。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图1是测试例1中健康人样本与ILD阳性血清KL-6阴性患者和ILD阳性血清KL-6阳性患者样本检测结果对比的统计图。

图2是测试例2对ILDs阳性血清KL-6阴性样本和ILDs阳性血清KL-6阳性样本中外泌体LAMC1、外泌体PSMA3、外泌体PTPRG检测结果制作的ROC曲线图。

具体实施方式

下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

本说明书中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

本说明书中缩略语和关键术语定义：

实施例1：

本实施例提供一种外泌体上LAMC1蛋白的检测方法，包括如下步骤：

(1)磁珠包被物的制备步骤：

1)将磁珠试剂置于血液混匀仪上分散10min以上，使磁珠完全分散均匀；

2)准备1支离心管，用移液器移取1)分散的磁珠试剂，后通过磁分离去除上清得到磁珠10mg，往离心管中加入1mL的磁珠缓冲液，得到浓度为10mg/mL磁珠溶液；

3)向2)所得磁珠溶液中依次加入25μL的EDC溶液(20mg/mL)和25μL的NHS(40mg/mL)溶液，室温反应60min，后通过磁分离去除上清；

4)使用1mL磁珠缓冲液重悬磁珠，然后加入200μg待包被的LAMC1捕获抗体，室温孵育2h；

5)将100μL封闭剂加入步骤4)的溶液中，室温孵育1h；

6)将5)所得溶液置于磁分离器上，通过磁分离去除上清，然后加入1mL PBS缓冲液重悬，如此重复3次；

7)将上述6)得到的磁珠重悬液置于触摸式超声波细胞粉碎机上，功率10％；

8)将7)超声后的磁珠重悬液置于磁分离器上，通过磁分离去除上清，得到捕获抗体包被磁珠；

9)使用磁珠包被物稀释液稀释捕获抗体包被磁珠，得到磁珠包被物工作液，稀释后得到的磁珠包被物工作液的浓度为0.8mg/mL。

磁珠缓冲液是MES缓冲液。

封闭剂是含质量分数1％BSA的PBS缓冲液。

磁珠包被物稀释液成分为：按质量分数计，TRIS 0.1％，NaCl 0.9％，BSA 3％，Tween-200.1％，叠氮钠0.1％，其余为水。

(2)发光物标记的检测抗体制备步骤：

1)将200μg的LAMC1检测抗体加入到提前准备好的500μL标记缓冲液中，再加入25μL已偶联NHS的吖啶酯(浓度：10mg/mL)。

2)将步骤1)的混合液体至于恒温混匀仪上，反应60min；

3)结束后，向步骤2)反应液中加入100μL淬灭剂，室温反应30min，再通过脱盐柱方法去除未反应的物质，得到的发光物标记的检测抗体(吖啶酯标记的LAMC1检测抗体)使用标记物保存液稀释，得到浓度为200μg/mL发光物标记的检测抗体保存液,2-8℃保存。

吖啶酯标记的LAMC1检测抗体工作液制备：将200μg/mL的发光物标记的检测抗体保存液使用标记物稀释液稀释，得到浓度为0.4μg/mL的吖啶酯标记的LAMC1检测抗体工作液。

标记缓冲液是0.1M的碳酸氢钠缓冲液。

淬灭剂是含质量分数10％赖氨酸的水溶液。

标记物保存液是：按质量分数计，含0.2％BSA和0.1％PC300的PBS溶液。

标记物稀释液成分为：按质量分数计，MES 1％、NaCl 0.9％、BSA 2％、Tween-200.1％、十二烷基肌氨酸钠(NLS)0.2％、SB3-140.2％、牛γ-球蛋白0.05％、Proclin3000.1％，其余为水,pH6.0。

(3)外泌体样本预处理步骤：

将外泌体样本进行预处理：将20μL外泌体样本与180μL样本处理液混合，然后37℃下反应5min。

其中，样本处理液包括以下重量百分比的原料：TRIS 0.9％、EDTA-2Na0.05％、NaCl 0.9％、BSA 2％、CHAPS 1％、Tween-800.5％、海藻糖2％、ProClin 3000.1％，其余为水,pH7.5。

(4)外泌体样本中LAMC1含量的检测与计算：

取步骤(3)得到的预处理后的样本20μL，加入步骤(1)得到的磁珠包被物工作液50μL，混匀后37℃孵育5min；然后经磁分离，洗涤除去未结合物质，并吸除上清，得到的磁珠-抗原复合物。

(5)向步骤(4)得到的磁珠-抗原复合物中加入步骤(2)得到的吖啶酯标记的LAMC1检测抗体工作液50μL，混匀后37℃孵育5min；然后经磁分离，除去未结合物质，并吸除上清，得到磁珠-抗原-检测抗体复合物。

(6)向步骤(5)得到的磁珠-抗原-检测抗体复合物中加入发光底物(100μL AE预激发液和100μL激发液)，充分混匀后测定最大发光强度；依据标准品检测得的发光强度拟合成标准曲线，通过标准曲线计算出待测样本中LAMC1含量。

实施例2：

与实施例1的主要区别在于：所述捕获抗体为PSMA3捕获抗体，所述检测抗体为PSMA3检测抗体。

实施例3：

与实施例1的主要区别在于：所述捕获抗体为PTPRG捕获抗体，所述检测抗体为PTPRG检测抗体。

测试例1：

本测试例的样本中，ILDs阴阳性基于高分辨率CT和其他临床结果综合判定。

健康人样本与ILD患者样本检测结果对比：

采用实施例1所述的方法制备LAMC1检测所需试剂，采用实施例2所述的方法制备PSMA3检测所需试剂，采用实施例3所述的方法制备PTPRG检测所需试剂。

取35例健康人群血清样本，41例采用市售血清KL-6检测产品检测得到结果阴性的ILD阳性患者血清样本，49例采用市售血清KL-6检测产品检测得到结果阳性的ILD阳性患者血清样本。

使用试剂盒法提取上述血清样本的外泌体。然后使用全自动化学发光免疫分析仪(shine i2910)采用上述LAMC1检测所需试剂、PSMA3检测所需试剂、PTPRG检测所需试剂对提取出的外泌体进行检测。结果见图1。

结果分析：由图1结果可知，无论是采用市售血清KL-6检测产品检测得到结果阳性的ILD阳性患者血清样本还是采用市售血清KL-6检测产品检测得到结果阴性的ILD阳性患者血清样本，其外泌体上LAMC1、PSMA3、PTPRG蛋白检测发光值均显著高于健康人群血清样本的外泌体上LAMC1、PSMA3、PTPRG蛋白检测发光值。ILD阳性患者样本与健康人群样本之间表现出非常显著的差异(P<0.0001)。

以上结果表明，对于市售血清KL-6检测产品无法有效检出的ILD阳性患者，采用本发明的检测试剂及方法可以有效识别外泌体上的LAMC1、PSMA3、PTPRG。相比于检测血清KL-6，检测外泌体上LAMC1、PSMA3、PTPRG来辅助诊断间质性肺疾病明显具有更高的灵敏度和特异性。

测试例2：

外泌体LAMC1、PSMA3、PTPRG检测ILDs结果ROC曲线绘制：

使用测试例1检测得到的结果，按照ILDs阳性血清KL-6阴性和ILDs阳性血清KL-6阳性，分别制作外泌体LAMC1、PSMA3、PTPRG检测结果的ROC曲线，结果见图2。

结果分析：结合图2可知，对于ILDs阳性血清KL-6阴性样本，外泌体LAMC1的ROC曲线的AUC＝0.9735，外泌体PSMA3的ROC曲线的AUC＝0.9857，外泌体PTPRG的ROC曲线的AUC＝0.9875；对于ILDs阳性血清KL-6阳性样本，外泌体LAMC1的ROC曲线的AUC＝0.9901，外泌体PSMA3的ROC曲线的AUC＝0.9942,外泌体PTPRG的ROC曲线的AUC＝0.9971。可得出初步结论：对于ILDs样本血清样本，无论血清KL-6测值是否阳性，外泌体LAMC1、PSMA3、PTPRG均能有效检出大部分。以上结果表明了外泌体LAMC1、PSMA3、PTPRG检测在间质性肺疾病诊断过程中相比于血清KL-6检测具有非常显著的优势，可以弥补血清KL-6用于ILD诊断时灵敏度不足、假阴性较多的问题。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。