一种灰盖鬼伞来源的蛋白酶基因的重组表达及其重组酶降解大豆渣的应用

摘要

本发明公开了一种灰盖鬼伞来源的蛋白酶基因的重组表达及其重组酶降解大豆渣的应用，属于分子生物学和基因工程领域。本发明实现了灰盖鬼伞来源的蛋白酶基因mpr的同源重组表达。获得的灰盖鬼伞重组菌株经摇瓶发酵后的胞外蛋白酶酶活可达41000U/L左右。纯化后的蛋白酶的比酶活为204.38U/mg。酶学性质分析结果表明，该蛋白酶的最适温度为50℃，且在30‑50℃范围内保持1h后该蛋白酶能保持70％以上的酶活；该蛋白酶的最适pH为8.0，在pH范围6.5‑9.0时，该蛋白酶的酶活效率能保持在70％以上，同时，该蛋白酶可有效将大豆渣蛋白水解成小分子肽。

说明书

技术领域

本发明涉及一种灰盖鬼伞来源的蛋白酶基因的重组表达及其重组酶降解大豆渣的应用，属于分子生物学和基因工程领域。

背景技术

蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物和微生物中，是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其降解多肽的方式分成内肽酶和端肽酶两类。前者可把大分子量的多肽链从中间切断，形成分子量较小的肽和蛋白；后者又可分为羧肽酶和氨肽酶，它们分别从多肽的游离羧基末端或游离氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸。蛋白酶按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

微生物由于生长速度快、可控性强、所需空间和时间少，且具有生物多样性等特点备受关注。微生物蛋白酶又分为细菌蛋白酶、真菌蛋白酶和病毒蛋白酶。大部分商用的中性和碱性蛋白酶来源于细菌。与细菌相比，真菌来源的蛋白酶种类更多，包括酸性、中性和碱性蛋白酶。许多真菌如青霉菌、镰刀菌、曲霉菌和酵母菌等都能产生胞外蛋白酶。自1985年Jacobs等首次成功克隆出地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因以来，利用基因工程技术对蛋白酶基因进行克隆与表达,构建高产蛋白酶工程菌成为研究热点，为菌种选育提供了新的途径。目前，蛋白酶主要在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、以及丝状真菌中表达。

蛋白酶在工业上具有广泛的应用，据统计，在所有工业所使用酶制剂中，蛋白水解酶所占的比例最大，大约为75％。蛋白酶在食品、制革、饲料、洗涤、纺织、营养和医药等多个方面发挥重要作用。例如，中性蛋白酶可将大豆蛋白水解成大豆多肽，获得的大豆多肽具有高营养性，降压降脂，减少胆固醇的生理功效；利用中性蛋白酶将鸡蛋清蛋白适度水解生产活性多肽，可以开发成功能食品以及医药保健品；中性蛋白酶也能将肌原纤维与弹性蛋白溶解从而变成无规则的结构，使肉质得到了嫩化；经中性蛋白酶处理后，可使麦汁中含氮物质在各种组分比例中更为合理，有助于提高啤酒的品质与稳定性。

在豆制品的工业生产中，会产生大量的大豆渣废水，这些废水在长时间未处理会造成严重的环境污染。同时，大豆渣废水中也富含大量的营养物质，这其中就包括：大豆异黄酮，大豆乳清蛋白、大豆低聚糖等。回收利用这些营养成分，可在保护环境的同时避免资源的浪费。利用蛋白酶降解大豆渣蛋白不仅能够去除大豆渣中的大分子蛋白，还能够进一步提升该蛋白的利用价值。目前用于降解大豆渣蛋白的蛋白酶主要来源于细菌，此类蛋白酶的热稳定性较差.例如枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在pH 7.0、60℃处理15min后，该蛋白酶失活90％，从而限制了该蛋白酶的应用。所以，筛选性能优良的蛋白酶具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种真菌来源的重组蛋白酶及其表达菌株和应用。通过遗传学手段对含有该蛋白酶的灰盖鬼伞菌株进行改造，即在该菌株中过表达蛋白酶Mpr。改造过后的菌株在液体培养基YMG中纯培养5 -6天蛋白酶酶活提高至41000U/L。对粗酶液进行收集，浓缩以及透析，采用阴离子交换层析的方法进行纯化。收集纯化过后的酶液，计算得率，进行酶学性质分析以及应用研究。具体技术内容如下：

本发明提供了一种蛋白酶Mpr，所述蛋白酶Mpr为：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)氨基酸序列SEQ ID NO.1经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；

(3)与氨基酸序列SEQ ID NO.1具有80％以上同源性的突变氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白酶Mpr来源于灰盖鬼伞(Coprinopsiscinerea)。

在本发明的一种实施方式中，所述真菌来源蛋白酶Mpr的分子量为36kDa，等电点为10.45。所述蛋白酶Mpr的最适pH为7.5，最适温度为50℃，其中Cu

本发明还提供了编码上述蛋白酶Mpr的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pYSK-lcc1为表达载体。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体为：包含上述蛋白酶基因的重组表达载体pYSK-mpr，该载体上的启动子来源于双孢菇；终止子来源于灰盖鬼伞的lcc1。

本发明还提供了所述表达载体pYSK-mpr的构建方法，将pYSK-lcc1上的lcc1基因替换为mpr基因；使该基因受到载体pYSK-lcc1中的启动子调控，得到重组表达载体pYSK-mpr。

本发明还提供了表达上述蛋白酶Mpr，或携带上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以灰盖鬼伞(Coprinopsiscinerea)FA2222为表达宿主。

本发明中重组菌株C.cinerea FA2222/pYSK-mpr可过表达蛋白酶，其构建方法为：

(1)将pYSK-lcc1上的lcc1基因替换为mpr基因，获得过表达质粒pYSK-mpr；

(2)将获得的过表达质粒pYSK-mpr通过转化进入灰盖鬼伞FA2222中，经过再生、初筛、复筛制得到过表达蛋白酶Mpr的菌株。

本发明还提供了一种降解大豆渣的方法，所述方法为，将上述蛋白酶Mpr或上述重组细胞或采用重组细胞表达得到的重组酶添加至含有大豆渣的反应体系中进行降解。

在本发明的一种实施方式中，将其作为蛋白水解酶用于工业大豆渣的降解过程中，可以显著将大豆渣中的大分子蛋白降解为小分子肽。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中的反应条件为，反应温度为40℃，反应时间为0.5-2.5h。

本发明还提供了上述蛋白酶Mpr，或上述重组载体，或上述重组细胞在降解大豆渣或制备降解大豆渣的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。

本发明还提供了一种培养上述C.cinerea FA2222/pYSK-mpr重组菌株的方法，所述方法为，将C.cinerea FA2222/pYSK-mpr添加至种子培养基中，于37℃，120rpm条件下摇床培养5-6天。

在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的成分包含4g/L的葡萄糖、4g/L酵母提取物以及10g/L的麦芽提取物。

本发明还提供了一种上述蛋白酶的分离纯化方法，所述蛋白酶纯化方法为阴离子交换层析法纯化，缓冲液为20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)、NaCl(0.02 -2.0mol/L,pH7.5)以及线性梯度洗脱(1.0mL/min)。

有益效果

(1)本发明获得的表达真菌蛋白酶Mpr的重组菌，摇瓶发酵得到的蛋白酶Mpr的酶活为41000U/L，纯化过后的蛋白酶比酶活为204.38U/mg，最适反应温度为50℃；最适反应pH为8.0，具有重要的应用潜力。

(2)本发明提供的真菌蛋白酶Mpr在最适反应条件下对大豆渣中的蛋白有较高的水解效果，大分子蛋白经过该蛋白酶水解过后，形成了小分子肽或氨基酸。

附图说明

图1为本发明重组表达载体的构建示意图。

图2为本发明重组表达载体的酶切验证结果；其中，M：2K plusII Marker。

图3为本发明重组菌摇瓶培养胞外蛋白酶酶活曲线图。

图4为本发明重组蛋白酶的SDS-PAGE图；箭头为蛋白酶Mpr的条带位置。

图5为本发明的重组酶的酶学性质分析结果；图5中的a是蛋白酶Mpr的最适pH；图5中的b是蛋白酶Mpr的pH稳定性；图5中的c是蛋白酶Mpr的最适温度；图5中的d是蛋白酶Mpr的温度稳定性。

图6为本发明的重组酶降解大豆渣的应用效果；其中，M：预染蛋白Marker 17-180kDa；Control：未加蛋白酶的样品；0h、0.5h、1h、1.5h、2.0h、2.5h分别为水解时间取样。

具体实施方式

下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。

实验材料和试剂

下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。

实验材料和试剂

下述实施例中所涉及的菌株灰盖鬼伞(C.cinerea FA2222)和表达载体pYSK-lcc1均公开于：张晶娜,周刚,刘娟娟,方泽民,肖亚中.漆酶Lcc9在灰盖鬼伞菌中的同源过表达[J].生物学杂志,2022,39(06):47-51。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所涉及的

下述实施例中所涉及的培养基如下：

菌株培养以及产酶培养基YMG：10g麦芽浸膏，4g葡萄糖，4g酵母提取物于1000mL去离子水中，115℃条件下灭菌处理30min。

大肠杆菌培养基LB：10g氯化钠，10g蛋白胨，2g酵母膏，用纯水定容至1000mL，121℃条件下灭菌处理20min。

下述实施例中所涉及的缓冲液：

MM(50mL)缓冲液：1M甘露醇25mL，0.2M马来酸盐12.5mL，无菌水12.5mL。

MMC(50mL)缓冲液：1M甘露醇25mL，0.2M马来酸盐12.5mL，1M CaCI

下述实施例中所涉及的检测方法：

蛋白酶Mpr酶活检测：

采用福林酚试剂显色法对本发明的蛋白酶进行活性分析。具体方法如下：在pH7.0，40℃条件下，取1mL在40℃条件下预热10min的酪蛋白溶液(10g/L)，加入1mL预热的Mpr酶液，40℃条件下反应10min，取出加入2ml 0.4mol/L三氯乙酸，摇匀，静止10min，在12000rpm离心5min，去1mL上清液至10mL离心管，加入5mL 0.4mol/L碳酸钠和1mL福林试剂，40℃反应20min，于680nm处测定其吸光值。

蛋白酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解底物酪蛋白生成1μmol酪氨酸所需的酶量为1个活性单位(U)。

比酶活的检测：

采用蛋白含量检测试剂盒BCA测定蛋白含量，在该蛋白含量下测定蛋白酶酶活，获得蛋白含量以及蛋白酶酶活。

蛋白酶比酶活单位定义：在特定条件下，单位重量(mg)蛋白质所具有的酶活力(U)。

实施例1：表达蛋白酶Mpr的基因工程菌株的构建

(1)表达载体的构建

如图1所示，质粒pYSK-lcc1含有灰盖鬼伞菌株的lcc1基因序列(SEQ ID NO.4)、lcc1终止子序列(SEQ ID NO.3)以及双孢蘑菇gpdII启动子(SEQ ID NO.2)。通过融合PCR与体外同源重组将lcc1编码区替换为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白酶mpr过表达片段。

蛋白酶基因与载体扩增：

设计蛋白酶基因的扩增引物F和R，提取C.cinerea FA2222基因组，使用引物F和R扩增目的基因，同时使用引物L22和L24扩增pYSK-lcc1载体(带有双胞蘑菇gpdII启动子和lcc1终止子)，扩增体系如表1。扩增产物进行核酸凝胶电泳跑胶，电泳胶进行回收。

表1目的基因扩增体系

所涉及的引物如下表2所示：

表2引物序列

融合PCR连接及产物验证：

使用融合PCR方法进行体外连接，并将连接产物转入大肠杆菌JM109感受态中进行扩增，构建表达载体pYSK-mpr，挑取单克隆菌株转入对应抗性的LB培养基中过夜培养，提取质粒，进行PCR验证及酶切验证，酶切结果如图2所示。

结果显示：连接产物在快切酶Sac I和EcoR I酶切的作用下，被分割成两条基因条带，且对应的条带大小与预期一致。

(2)灰盖鬼伞原生质体制备

选取1块长势较好的C.cinerea FA2222培养皿，于超净工作台中向培养皿中加入5mL无菌水，采用酒精灯灼烧灭菌的药匙轻微的刮取菌丝，经孢子过滤器过滤，取滤液。于2600×g，4℃条件下离心10min，无菌条件下弃上清，加入8mL MM缓冲液进行重悬洗涤孢子，再次以上述条件离心，弃上清，得到孢子沉淀。

向上述收集的孢子沉淀中加入1mL细胞裂解液，重悬孢子，并置于37℃恒温培养箱中孵育3.5-4h。间隔15min无菌取样并于显微镜下观察孢子裂解效果，孢子裂解效果达到60％以上时，加入5mL现配的MMC缓冲液。终止酶解反应。于640×g，4℃条件下离心10min，无菌条件下弃上清。加入适量MMC缓冲液，调整原生质体浓度。

(3)碱裂解法提取质粒pYSK-mpr

挑取步骤(1)得到的转化后的单菌落，接种到5mL含有适当抗生素的LB培养基中，于37℃条件下剧烈振摇下培养过夜。将培养物转移到一个15mL的试管中，于4℃，2000×g离心10min后收集菌体，用轻缓抽吸的方法，尽可能吸干培养液。

将细菌沉淀重悬于200μL用冰浴冷的碱裂解液I中，剧烈震荡，将悬浮液转移到微量离心管中。加400μL新配制的碱裂解液Ⅱ到每管细菌悬液中，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。切勿旋涡震荡，将离心管置于冰上。加300μL预冷的碱裂解液Ⅲ，反复颠倒数次，使之在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上3-5min。用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，转移600μL上清到一只洁净离心管中。加等体积的酚氯仿，通过剧烈震荡混合有机相和水相，然后用微量离心机于4℃以最大转速离心2min，转移上层水相到另一离心管中。在室温下加600μL异丙醇以从上清中沉淀核酸，剧烈震荡混合溶液，于室温下放置2min。用微量离心机在室温下以最大转速离心5min，收集核酸沉淀。缓慢吸去上清液，将离心管倒置于纸巾上，使所有液体流干，再将吸附于管壁上的液滴除尽。加1mL 70％乙醇于沉淀中并将试管颠倒数次，用微量离心机在室温下以最大转速离心2min，回收DNA，再次用轻微抽吸的方法除去上清。除去管壁上的酒精液滴,将开口的试管置于室温直到酒精挥发并在管内没有可见的薄体存在，用30uL的灭菌去离子水(不含RNA酶)重新溶解核酸，温和震荡几秒钟，贮于20℃。

(4)质粒pYSK-mpr转化及C.cinerea FA2222/pYSK-mpr转化子筛选

质粒pYSK-mpr转化：

将步骤(3)提取得到的蛋白酶表达载体pYSK-mpr转入步骤(2)得到的C.cinereaFA2222原生质体中；按照下表3所示成分加入提前预冷的1.5mL EP管中：

表3真菌转化体系

将含有混合液的EP管置于冰上静置20min，加入500μL无菌的PEG溶液小心混匀，室温反应5min。加入灭菌后的STC缓冲液1mL，在再生培养基平板上涂布350μL混合液。将含有混合液的平板置于37℃恒温培养箱中培养3天。用接种环取出单克隆转化子，转接至YMG培养基上培养3-4天后，挑取小菌丝块于YMG固体培养基中正常培养。

对步骤(4)中的已经长到培养基边缘的转化子，刮取菌丝。利用试剂盒(MightyPrep reagent for DNA)提取不同灰盖鬼伞转化子的基因组，以L22、L24和基因组为模板扩增蛋白酶mpr基因序列，PCR反应体系如下表4所示，以1％浓度的核酸凝胶电泳检测阳性率。获得阳性转化子即为蛋白酶Mpr表达重组菌株C.cinerea FA2222/pYSK-mpr。

表4阳性转化子验证体系

实施例2：重组蛋白酶Mpr的制备

(1)蛋白酶基因mpr在灰盖鬼伞中的表达

将实施例1制备得到的验证结果呈阳性的转化子C.cinerea FA2222/pYSK-mpr接种于YMG固体培养基上，待平板长到边缘时，再转接到100mL YMG液体培养基的250mL三角瓶中，37℃，120rpm条件下振荡培养5-6天。采用菌体破碎仪对摇瓶中的菌体进行破碎匀浆，无菌条件下取15mL菌液接种至含300mL YMG液体培养基的1L三角瓶中，于37℃，120rpm下摇瓶振荡培养。采用8层纱布过滤发酵液，12000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

结果如下：

每24h取样检测蛋白酶酶活，在反应96h后得到的蛋白酶有最高酶活41000U/L，如图3所示。同时，蛋白电泳结果如图4所示，蛋白条带所对应的分子量为36kDa左右，分子量结果与预期一致。制备得到培养96h后的重组蛋白酶发酵上清液。

(2)重组蛋白酶的纯化

通过8层纱布收集摇瓶表达的重组蛋白酶上清液，经浓缩后用20mM Tris-HCl缓冲液置换其中的培养基。采用阴离子交换层析进行纯化。具体为：取蛋白酶浓缩液置于预先用20mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡过得阴离子柱中，然后用终浓度为1.0mol/L的NaCl进行浓度线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液进行酶活性和比酶活测定。

结果显示，制备得到的蛋白酶Mpr纯酶的酶活为：22000U/L，比酶活为：204.38U/mg。

实施例3：重组蛋白酶Mpr的性质分析

(1)蛋白酶Mpr的最适pH

将实施例2制备得到的蛋白酶Mpr纯酶在不同的pH下测酶以获得其最适pH。具体为：将酶活检测方法中的pH利用缓冲液进行调整至不同的梯度。调整反应pH所用缓冲液为pH2.5-8.0柠檬酸盐-磷酸氢二钠缓冲液，pH 6.0-9.0Tris-HCl缓冲液，pH 8.5-10.5甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。如图5中的a所示，蛋白酶Mpr的最适pH为8.0。

(2)蛋白酶Mpr的pH稳定性

将酶液在不同pH值的缓冲液(所用缓冲液为pH 2.5-8.0柠檬酸盐-磷酸氢二钠缓冲液，pH 6.0-9.0Tris-HCl缓冲液，pH 8.5-10.5甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)中于40℃下处理60min，测定酶活性以研究酶的pH稳定性。如图5中的b所示，pH 7.0-8.5之间能够维持90％以上的酶活力，说明该蛋白酶在pH 7.0-8.5之间具有优良的pH稳定性。

(3)蛋白酶Mpr最适温度

纯化的蛋白酶在pH 8.0条件下，测定不同温度(10～80℃)下的酶活性，即将酶活检测的温度条件分别调整为10-80℃，结果如图5中的c所示，该蛋白酶的最适温度为50℃。

(4)蛋白酶Mpr温度稳定性：

蛋白酶在不同温度下(10-80℃)条件下保温60min后，再在50℃下进行酶活性测定，结果如图5中的d所示，该蛋白酶在40℃下处理60min，剩余酶活在85％以上，在50℃条件下处理60min，依旧保持最高酶活。

实施例4：灰盖鬼伞蛋白酶Mpr的应用

具体步骤如下：

称取质量为2g的大豆渣粗蛋白(安徽人人福豆业有限公司制备)，加入10mL纯水，95℃沸水浴使蛋白完全溶解变性，冷却至室温，加入100μL实施例2中得到Mpr酶液，于40℃水浴。每0.5h取样进行SDS-PAGE检测，以0h为对照。

结果如图6所示，加入蛋白酶的大豆渣蛋白发生了不同层度的酶解，0.5h时大豆渣蛋白就已经发生了大量的酶解，最终大分子的大豆渣蛋白基本上都降解为小分子肽。

综上，本发明从丝状真菌灰盖鬼伞中获得了一种全新的蛋白酶基因，该基因编码的蛋白酶具有偏pH中性及较高的反应温度。上述优点意味着该蛋白酶在饲料、食品、医药等行业中具有重要应用。同时，该蛋白酶对大豆渣蛋白具有高效的降解效果，能将大豆渣中含大量高分子蛋白基本上都降解至10-17kDa之间的小分子肽。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。