一种阿齐沙坦和/或阿齐沙坦酯的检测方法及应用

摘要

本发明公开了一种阿齐沙坦和/或阿齐沙坦酯的检测方法及应用，该检测方法采用色谱‑串联质谱法测定中成药中阿齐沙坦和阿齐沙坦酯，对其进行定性定量分析，引入折算校正，若只检出阿齐沙坦，计算结果以阿齐沙坦计。若同时检出阿齐沙坦和阿齐沙坦酯，计算结果按照两者之和来表示，以阿齐沙坦酯计。该定量定性方法改善了阿齐沙坦酯测定结果的重现性。该检测方法快速、灵敏、准确，弥补了相关的技术空白。

说明书

技术领域

本发明涉及化合物检测技术领域，特别涉及一种阿齐沙坦和/或阿齐沙坦酯的检测方法及应用。

背景技术

市面上降压类产品存在化学药物非法添加问题，部分高血压治疗新药在国内认知程度较低，缺少检测方法，成为隐蔽性极强的新型非法添加药物。

阿齐沙坦的化学名为2-乙氧基-1-[[2'-(4,5-二氢-5-氧代-1,2,4-恶二唑-3-基)联苯-4-基]甲基]苯并咪唑-7-羧酸(CAS号为147403-03-0)。阿齐沙坦酯的化学名为(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧环戊烯-4-基)甲基2-乙氧基-1-{[2'-(5-氧代-4,5-二氢-1,2,4-噁二唑-3-基)联苯-4-基]甲基}-1H-苯并咪唑-7-羧酸酯(CAS号为863031-21-4)。阿齐沙坦酯是阿齐沙坦的前体药物。

然而，阿齐沙坦及阿齐沙坦酯在国内外无中成药、食品中的检测方法报道，也无法定检测标准，处于无法可测的困境。此外，阿齐沙坦酯在溶液中稳定性差，容易水解成阿齐沙坦，大批量分析时结果重现性差，表现为随检测时间增加，阿齐沙坦酯测得含量降低，阿齐沙坦含量从无到有。因此，亟需建立一种检测中成药中阿齐沙坦及阿齐沙坦酯的方法，并解决阿齐沙坦酯测定结果重现性差的问题。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种阿齐沙坦和/或阿齐沙坦酯的检测方法及应用。该检测方法采用色谱-串联质谱法测定中成药中阿齐沙坦和阿齐沙坦酯，对其进行定性定量分析，引入折算校正，改善了阿齐沙坦酯测定结果的重现性。该检测方法快速、灵敏、准确，弥补了相关的技术空白。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提出了一种阿齐沙坦和/或阿齐沙坦酯的检测方法，包括以下步骤：

(1)试样经有机溶剂提取，制得供试品溶液；

(2)制备标准溶液；

(3)分别采用高效液相色谱-串联质谱法对供试品溶液和标准溶液进行分析；

(4)定性定量分析；

当检出物为阿齐沙坦时，阿齐沙坦的定量结果记为阿齐沙坦的含量；

当检出物为阿齐沙坦和阿齐沙坦酯时，阿齐沙坦和阿齐沙坦酯的定量结果记为阿齐沙坦酯的含量；

所述有机溶剂包括甲醇、乙腈的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述试样的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、茶剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

在本发明的一些实施方式中，所述胶囊剂包括软胶囊剂、硬胶囊剂的任意一种。

在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂包括甲醇、甲醇和乙腈的混合溶液、乙腈的任意一种。

在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂包括甲醇、体积浓度为25％～75％的甲醇、甲醇和乙腈按照体积比为4:6～6:4混合的混合液、乙腈、体积浓度为25％～75％的乙腈。

在本发明的一些实施方式中，当所述试样的剂型为软胶囊剂时，所述有机溶剂包括甲醇。本发明软胶囊中一般含有明胶等物质，乙腈会使明胶变性，对油脂的渗透能力较差，选用甲醇作为提取溶剂更合适。

在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中，所述提取的方式包括超声、涡旋、振荡的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述超声的时间为5min～15min；优选为8min～12min。

在本发明的一些实施方式中，所述涡旋的时间为0.5min～3min。

在本发明的一些实施方式中，所述振荡的时间为5min～15min；优选为8min～12min。

在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱的色谱条件包括：

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：流动相A为体积浓度为0.05％～0.3％的甲酸；流动相B为乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱；

梯度洗脱程序：0～1.0min，流动相A 90％；1.0～6.0min，流动相A 90％～30％；6.0～9.0min，流动相A 30％；9.0～9.1min，流动相A 30％～90％；9.1～13.0min，流动相A90％。

在本发明的一些实施方式中，所述的流动相：流动相A为体积浓度为0.1％的甲酸；流动相B为乙腈。

在本发明的一些实施方式中，所述的C18色谱柱包括Waters XBridge BEH C18Column(

在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱的色谱条件包括：流速为0.2mL/min～0.5mL/min。

在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱的色谱条件包括：柱温30℃～40℃。

在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱的色谱条件包括：控制所述的供试品溶液或所述的标准溶液的温度为2℃～6℃。

在本发明的一些实施方式中，步骤(2)制得的标准溶液在冷冻下保存；优选的，所述冷冻保存的温度为-20℃～-5℃；优选的，所述冷冻保存的时间为0～14天。

在本发明的一些实施方式中，所述质谱条件包括：

离子源：电喷雾离子源(ESI)；

检测方式：多反应监测(MRM)；

扫描方式：正离子模式；

离子气、气帘气、碰撞气均为氮气；

离子气1压力为55psi，离子气2压力为55psi，气帘气压力为40psi，碰撞气压力为9psi。

在本发明的一些实施方式中，所述质谱条件包括：阿齐沙坦定量离子对和定性离子对为m/z 457.2/233.1和m/z 457.2/279.1，去簇电压为130V，碰撞电压为36V和20V；阿齐沙坦酯定量离子对和定性离子对为m/z 569.3/233.1和m/z 569.3/279.1，去簇电压为146V，碰撞电压为42V和26V。

在本发明的一些实施方式中，步骤(4)中，所述的定性的方法包括以下步骤：

按照高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法条件测定供试品溶液和标准溶液，供试品溶液与标准溶液比较，目标化合物的色谱峰保留时间偏差在±2.5％之内，目标化合物的质谱定量、定性离子对均出现，供试品溶液特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，并且供试品溶液色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过下表规定的范围，可以确定试样中检出目标化合物：

在本发明的一些实施方式中，步骤(4)中，所述的定量的方法包括以下步骤：

当检出物为阿齐沙坦时，阿齐沙坦的定量结果记为阿齐沙坦的含量；

当检出物为阿齐沙坦和阿齐沙坦酯时，阿齐沙坦和阿齐沙坦酯的定量结果记为阿齐沙坦酯的含量；

所述的阿齐沙坦酯的含量按公式(1)计算：X＝X

式(1)中，X—试样中阿齐沙坦酯的总含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；X

在本发明的一些实施方式中，供试品溶液中各目标化合物的含量按式(2)计算：

式中：X—供试品溶液中各目标化合物的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；ρ—从标准曲线得到的供试品溶液中各目标化合物的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；V—供试品溶液稀释体积，单位为毫升(mL)；f—供试品溶液制备过程中的稀释倍数；m—供试品溶液质量，单位为克(g)；1000—单位换算系数。

在本发明的一些实施方式中，步骤(4)中，所述的定量具体包括以下步骤：按照高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法条件测定供试品溶液和标准溶液，以标准溶液的浓度为横坐标，以目标化合物定量离子对的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，按外标法计算试样中目标化合物的含量。

在本发明的一些实施方式中，步骤(4)中，所述的定量中，以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。

本发明的第二个方面，提出了一种所述的阿齐沙坦和/或阿齐沙坦酯的检测方法在食品或药品质量管理中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述食品包括保健品、压片糖果、固体饮料、液体饮料、饼干、代用茶等。

在本发明的一些实施方式中，所述药品包括降压类药品、降糖类药品、利尿类药品的至少一种。

本发明的有益效果是：

本发明的检测方法适用范围覆盖降压类中成药和食品的常见剂型，适用范围广，检测速度快，结果准确，可作为降压产品中阿齐沙坦和阿齐沙坦酯的定性定量方法，填补其在非法添加检测领域的空白，为打击新型成分的非法添加行为提供有效手段。

附图说明

图1为本发明实施例2中不同溶剂的对片剂加标样品和片剂阳性样品的提取效果。

图2为本发明实施例3中不同超声时间的提取效果。

图3为本发明实施例5中阿齐沙坦的二级质谱图。

图4为本发明实施例5中阿齐沙坦酯的二级质谱图。

图5为本发明实施例7中温度对阿齐沙坦和阿齐沙坦酯的影响。

图6为本发明实施例8中标准溶液图谱。

图7为本发明实施例8中空白图谱。

图8为本发明实施例8中阴性样品图谱。

图9为本发明实施例8中加标样品图谱。

图10为本发明实施例9中阴性软胶囊图谱。

图11为本发明实施例10中阳性片剂图谱。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。

仪器与试剂

1、仪器：LC-20ADXR高效液相色谱仪(配控温进样器)；Triple Quad 5500三重四级杆串联质谱仪(配ESI离子源)；涡旋混合器；超声波发生器；往复振荡器；超纯水机。

2、试剂：阿齐沙坦标准品、阿齐沙坦酯标准品；甲醇、乙腈、甲酸，均为色谱纯。

3、试剂的配制

甲醇-乙腈混合溶液(1：1，体积比)：量取甲醇500mL和乙腈500mL，混匀。

0.1％甲酸溶液(体积分数)：吸取甲酸1mL，用水稀释至1000mL，混匀，经0.22μm水相微孔滤膜过滤后备用。

实施例1

一种阿齐沙坦和/或阿齐沙坦酯的检测方法，具体过程为：

(一)色谱-质谱条件

1、色谱条件

色谱柱：C18色谱柱，流速0.3mL/min，柱温35℃，以0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B，按以下程序梯度洗脱：0～1.0min，流动相A 90％；1.0～6.0min，流动相A 90％～30％；6.0～9.0min，流动相A 30％；9.0～9.1min，流动相A 30％～90％；9.1～13.0min，流动相A 90％。样品控温4℃。

2、质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；离子源温度550℃，喷雾电压5500V；离子气、气帘气、碰撞气均为氮气，离子气1压力为55psi，离子气2压力为55psi，气帘气压力为40psi，碰撞气压力为9psi；扫描方式为多反应监测(MRM)。阿齐沙坦定量离子对和定性离子对为m/z 457.2/233.1和m/z 457.2/279.1，去簇电压为130V，碰撞电压为36V和20V；阿齐沙坦酯定量离子对和定性离子对为m/z 569.3/233.1和m/z 569.3/279.1，去簇电压为146V，碰撞电压为42V和26V。

(二)标准溶液的配制

称取阿齐沙坦和阿齐沙坦酯标准品适量，用甲醇-乙腈混合溶液配制质量浓度1000mg/L的标准储备液，储备液需-18℃避光冷冻保存，阿齐沙坦有效期3个月，阿齐沙坦酯有效期14天。

取试样基质相同或相近的空白试样按“试样溶液的制备”制备空白基质溶液，分别取适量标准储备液，用空白基质溶液配制质量浓度为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的基质匹配系列标准溶液，其中2ng/mL为检出限溶液。现配现用，需24h内完成分析。

(三)试样溶液的制备

片剂、硬胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液、茶剂：称取试样1g，置于50mL容量瓶中，加入甲醇-乙腈混合溶液40mL，涡旋1min，超声提取10min。取出放冷后用甲醇-乙腈混合溶液定容至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜后待测。

软胶囊剂：称取试样1g，置于50mL具塞离心管中，加入甲醇35mL，涡旋1min，振荡提取10min，8000r/min离心5min，上清液转移至50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜后待测。

(四)样品测定和含量计算

将基质匹配系列标准溶液和试样溶液分别注入高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪中测定，比较试样溶液中目标物的保留时间、离子对丰度比和峰面积，进行定性分析。若有检出，采用基质曲线进行含量计算。

定性分析的判断标准：在相同实验条件下，试样溶液与标准溶液比较，目标化合物的色谱峰保留时间偏差在±2.5％之内，目标化合物的质谱定量、定性离子对均出现，试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致。

定量结果计算和结果表达：以基质曲线的浓度为横坐标，以目标化合物定量离子对的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，按外标法计算试样中目标化合物的含量。若只检出阿齐沙坦，计算结果以阿齐沙坦计。若同时检出阿齐沙坦和阿齐沙坦酯，计算结果按照两者之和来表示，以阿齐沙坦酯计。

试样中各目标化合物的含量按式(1)计算：

式中：X—试样中各目标化合物的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；ρ—从标准曲线得到的试样溶液中各目标化合物的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；V—试样溶液稀释体积，单位为毫升(mL)；f—试样制备过程中的稀释倍数；m—试样质量，单位为克(g)；1000—单位换算系数。

若只检出阿齐沙坦，计算结果以阿齐沙坦计。若同时检出阿齐沙坦和阿齐沙坦酯，计算结果按照两者之和来表示，以阿齐沙坦酯计。

试样中阿齐沙坦酯的含量按公式(1)计算：

X＝X

式中：X—试样中阿齐沙坦酯的总含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；X

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。

实施例2

本实施例对阿齐沙坦及其酯的检测方法进行优化，具体过程为：

阿齐沙坦、阿齐沙坦酯溶于甲醇、二甲基亚砜，微溶于四氢呋喃，几乎不溶于水。选择甲醇、乙腈或其混合物作为考察的提取溶剂。按照实施例1的检测方法，比较甲醇、体积浓度50％甲醇、乙腈、体积浓度50％乙腈、甲醇+乙腈混合溶液(1：1，体积比)的提取效果，结果表明，采用甲醇、甲醇+乙腈混合液的提取效果最优，体积浓度50％乙腈、乙腈次之，体积浓度50％甲醇提取效果最差，见图1。阿齐沙坦标准品在甲醇中溶解最优，阿齐沙坦酯标准品在乙腈中溶解最优，甲醇+乙腈混合溶液能良好兼顾两种化合物的溶解性。因此选择甲醇+乙腈混合溶液作为主要的提取溶剂。但软胶囊中，乙腈会使明胶变性，对油脂的渗透能力较差，选用甲醇作为提取溶剂更合适。

实施例3

本实施例对阿齐沙坦及其酯的检测方法进行优化，具体过程为：

按照实施例1的检测方法，比较超声、涡旋、振摇的提取效果。结果表明，各基质的提取率基本达到90％以上。短时间的涡旋可以分散样品，防止结块，利于提取；超声有利于溶剂对粉末颗粒的渗透；振摇能增大不互溶油脂的接触面。因此，片剂、丸剂、口服液等选择超声提取，软胶囊选择振荡提取。

进一步考察超声时间，比较超声5min、10min、15min、20min、30min、60min的提取效果，见图2。超声过程中产热，会加速阿齐沙坦酯的水解，表现为超声时间超过30min，阿齐沙坦酯测定值降低，阿齐沙坦测定值升高(由阿齐沙坦酯降解)。前20min内，测定值无明显峰值，超声时间为10min时效果最好。另外，超声过程中注意及时更换设备中水介质，避免过程温度过高。

进一步考察涡旋时间，比较涡旋0.5min、1min、2min、5min的分散效果，结果表明，1min的涡旋即可使试样在溶剂中有效分散，延长涡旋时间至2min或5min，提取效果未观察到明显提高，则涡旋时间为1min时效果较佳，已能满足检测要求。

进一步考察软胶囊振荡提取的时间，结果和超声提取相当，振荡提取时间为10min时效果最好。

进一步考察软胶囊振荡提取的次数，比较提取1次、2次和3次的提取效果。具体过程如下：设计提取总体积为40mL，1次提取采用40mL溶剂，2次提取采用20mL+20mL溶剂，3次提取采用20mL+10mL+10mL溶剂。每次振荡提取时间为10min，提取后离心收集上清液。结果表明，1次、2次、3次的提取率依次为96％、93％、91％，1次提取效果最佳，可能是转移步骤少，过程损失小。

实施例4

本实施例对阿齐沙坦及其酯的检测方法进行优化，具体过程为：

按照实施例1的检测方法，对目标化合物测定方法进行选择优化。

中成药和食品中非法添加药物的检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法、高效液相色谱-串联高分辨质谱法等，以串联三重四极杆质谱的液质联用法最为主流。采用该类型方法能同时进行定性定量分析，定性功能优于高效液相色谱法，灵敏度和定量功能优于高分辨质谱。因此，选择串联三重四极杆质谱的液质联用法作为检测方法。

实施例5

本实施例对阿齐沙坦及其酯的检测方法进行优化，具体过程为：

按照实施例1的检测方法，对质谱条件进行优化。

用针泵连续注射100ng/mL阿齐沙坦和阿齐沙坦酯标准溶液于ESI源中，在正、负离子模式下扫描一级质谱，得到准分子离子峰。阿齐沙坦和阿齐沙坦酯的正离子响应(响应值1.76E+07和1.42E+07)优于负离子(响应值7.52E+06和5.97E+06)，选择正离子模式采集。

在正离子模式下进行二级质谱扫描，阿齐沙坦得到[M+H]

实施例6

本实施例对阿齐沙坦及其酯的检测方法进行优化，具体过程为：

按照实施例1的检测方法，对色谱条件进行优化。

C18柱能良好分离目标物与样品中的干扰物，比较了6款C18色谱柱的出峰和分离情况，阿齐沙坦和阿齐沙坦酯均能有良好的保留，获得峰形良好的色谱峰。6款色谱柱分别为①Waters XBridge BEH C18 Column(

选择水、体积浓度0.05％甲酸、体积浓度0.1％甲酸、0.005mol/L甲酸铵、0.01mol/L甲酸铵、体积浓度0.1％甲酸-0.05mol/L甲酸铵、甲醇、乙腈、体积浓度0.1％甲酸乙腈两两组合，依次考察有机相种类、缓冲盐种类、铵盐浓度和酸浓度的影响，优化流动相。两种化合物在C18柱上保留良好，保留时间较大，乙腈比甲醇洗脱能力更强，有效缩短分析时间。含缓冲盐的水相有利于改善色谱峰拖尾，使峰形更对称和尖锐。但加入甲酸铵，响应降低明显；加入甲酸，响应小幅度降低，但波动不大，选择甲酸溶液作为缓冲液更合适。0.1％甲酸-乙腈作为流动相体系，梯度洗脱表现出更好的检测结果。

实施例7

本实施例对阿齐沙坦及其酯的检测方法进行稳定性考察，具体过程为：

1.标准溶液的稳定性

阿齐沙坦酯在溶液中会水解成阿齐沙坦。有文献对阿齐沙坦酯、阿齐沙坦在酸、碱、氧化、光照下进行稳定性加速实验，其结果显示除光照外，酸、碱、氧化均会加速降解速度，在实验过程中应该避免引入上述干扰因素，并采用必要的手段控制分析溶液的稳定性。

将标准液置于-18℃、4℃和20℃保存，考察7天内的响应变化，结果见图5。-18℃时，7天内阿齐沙坦和阿齐沙坦酯响应分别降解至94％和95％，相对稳定。4℃时，阿齐沙坦稳定，但阿齐沙坦酯在72h内降解至76％，7天内降解至28％。因此，本方法的标准储备液需冷冻保存，标准溶液需在有低温控温的进样器中分析。

进一步考察，-18℃保存下阿齐沙坦和阿齐沙坦酯的标准储备液的有效期为3个月和14天。4℃下，24h内阿齐沙坦和阿齐沙坦酯的响应偏差在10％以内，72h内阿齐沙坦酯响应偏差达到20％以上。用于含量测定的标准溶液应该现配现用，使用时间不超过24h，否则会带来较大的测定偏差。此外，阿齐沙坦酯的降解物为阿齐沙坦，为避免相互干扰，两种化合物的标准储备液应独立配制，使用前混合。

2.试样溶液的稳定性

阳性试样溶液中的阿齐沙坦酯也会降解，试样溶液配制后应尽快完成分析。阿齐沙坦酯的降解是一个持续的过程，含量结果随时间变化，在大批量分析时试样溶液的分析时间控制不如标准溶液精准，是结果重现性差的主要原因。阿齐沙坦酯的测定结果采用阿齐沙坦和阿齐沙坦酯之和表示，能明显改善阿齐沙坦酯的结果重现性。理由有以下几个：一是阿齐沙坦是阿齐沙坦酯最主要的降解物，为1:1降解；二是自然情况下阿齐沙坦酯完全降解的时间远超过样品检测时间；三是临床用药上不存在两种成分等量添加的情况；四是若阿齐沙坦不纯，含有阿齐沙坦酯，作为杂质的阿齐沙坦酯含量比例很小，非法添加到产品中其浓度通常低于检出限，表现为只检出阿齐沙坦；五是若只添加阿齐沙坦酯，由于阿齐沙坦酯的降解十分迅速，而本发明方法的检出限足够灵敏，仍暂未发现仅检出阿齐沙坦酯的情况。

因此，当只检出阿齐沙坦时，可以认为样品中非法添加物为阿齐沙坦，不需要折算，结果以阿齐沙坦计；当同时检出阿齐沙坦和阿齐沙坦酯时，可认为主要非法添加物为阿齐沙坦酯，计算结果以阿齐沙坦酯计，折算后以两者之和来表示。

实施例8

本实施例对阿齐沙坦及其酯的检测方法进行方法学考察，具体过程为：

1、特异性

阿齐沙坦和阿齐沙坦酯在空白溶剂、阴性样品溶液(以片剂为代表)中有本底干扰，其响应小于检出限溶液的1/10，在测定时应适当扣除空白。在加标样品溶液(以片剂为代表)中无其他干扰。代表性图谱见图6～图9。

2、线性

用甲醇-乙腈混合溶液和空白基质溶液(以片剂为代表)分别配制质量浓度为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的系列标准溶液，以峰面积(y)对质量浓度(x)进行线性回归。阿齐沙坦回归方程为y＝234523.63x+478739.59，相关系数r为0.9992；阿齐沙坦酯回归方程为y＝164347.05x+177261.18，相关系数r为0.9997。结果表明，阿齐沙坦和阿齐沙坦酯在2ng/mL～100ng/mL内线性关系良好。同法考察胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液(不做阿齐沙坦酯)、茶剂、软胶囊剂等基质，在2ng/mL～100ng/mL内，相关系数均大于0.99。

3、检出限和定量限

根据S/N＝3时的浓度作为检出限和S/N＝10时的浓度作为定量限的原则，向阴性样品中逐级添加标准溶液获得检出限和定量限。综合仪器状态考虑，阿齐沙坦和阿齐沙坦酯方法检出限为0.1mg/kg，定量限为0.25mg/kg，可满足非法添加检验的要求。

4、准确度和精密度

4.1基质效应

基质效应的存在一般会降低或增加目标离子的生成效率和强度，影响结果的精密度和准确度。通过绘制溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线的斜率比值的方法评价基质效应。本方法计算得到的基质效应系数为4.8％～-59.6％，具有较明显基质效应。本方法采用基质曲线校正后，回收率结果见“4.2”。需要注意，本方法应用于非法添加领域，阿齐沙坦和阿齐沙坦酯添加量较高，测定时需要进行大倍数的稀释。稀释法也是有效的基质校正手段之一，稀释前后基质效应程度会发生变化，测定时基质曲线也需要进行同等倍数的稀释。

4.2准确度和精密度

选取片剂代表性阴性样品，以1倍、2倍、10倍定量限浓度水平进行加标回收试验，每个浓度制备6份，结果见表1。结果表明，阿齐沙坦回收率为87.9％～115.3％，RSD(n＝6)为1.2％～4.2％，阿齐沙坦酯回收率为92.0％～115.1％，RSD(n＝6)为4.2％～5.6％，能满足非法添加检验的要求。同法考察胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液(不做阿齐沙坦酯)、茶剂、软胶囊剂等基质，阿齐沙坦回收率为95.1％～125.1％，RSD(n＝3)为7.6％～14.3％，阿齐沙坦酯回收率为83.4％～93.5％，RSD(n＝3)为9.0％～19.7％，均符合要求。

表1准确度和精密度结果(n＝6)

实施例9

本实施例对软胶囊中阿齐沙坦和阿齐沙坦酯进行筛查，具体过程为：

1、标准溶液配制

分别称取0.01004g阿齐沙坦(含量98％，源叶生物)和0.00969g阿齐沙坦酯标准品(含量98％，trc)，用甲醇-乙腈混合溶液配制质量浓度1mg/mL的标准储备液。同时取阴性软胶囊基质，按试样溶液制备空白基质溶液。取适量标准储备液，用空白基质溶液配制阿齐沙坦的基质曲线和阿齐沙坦酯的基质曲线(质量浓度2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL)，其中2ng/mL为检出限溶液。

2、试样溶液制备

取适量样品，剪开胶囊壳收集内容物，混匀。称取试样1g，置于50mL具塞离心管中，加入甲醇35mL，涡旋1min，振荡提取10min。8000r/min离心5min，收集上清液至50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜后待测。

3、测定和分析

分别取2μL标准溶液和试样溶液分别注入液质联用仪，按以下色谱-质谱条件测定。

色谱条件：Phenomenex Kinetex C18色谱柱(100A，100×4.6mm，2.6μm)，流速0.3mL/min，柱温35℃，以0.1甲酸为流动相A，乙腈为流动相B，按以下程序梯度洗脱。0～1.0min，流动相A 90％；1.0～6.0min，流动相A 90％～30％；6.0～9.0min，流动相A 30％；9.0～9.1min，流动相A 30％～90％；9.1～13.0min，流动相A 90％。样品控温4℃。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；离子源温度550℃，喷雾电压5500V；离子气、气帘气、碰撞气均为氮气，离子气1压力为55psi，离子气2压力为55psi，气帘气压力为40psi，碰撞气压力为9psi；扫描方式为多反应监测(MRM)。阿齐沙坦定量离子对和定性离子对为m/z 457.2/233.1和m/z 457.2/279.1，去簇电压为130V，碰撞电压为36V和20V；阿齐沙坦酯定量离子对和定性离子对为m/z 569.3/233.1和m/z 569.3/279.1，去簇电压为146V，碰撞电压为42V和26V。

结果：试样溶液中未出现与阿齐沙坦、阿齐沙坦酯检出限溶液中保留时间一致的色谱峰，定性判断未检出阿齐沙坦和阿齐沙坦酯。样品图谱见图10。

实施例10

本实施例对片剂中阿齐沙坦酯的含量进行测定，具体过程为：

1、标准溶液配制

分别称取0.01004g阿齐沙坦(含量98％，源叶生物)和0.00969g阿齐沙坦酯标准品(含量98％，trc)，用甲醇-乙腈混合溶液配制质量浓度1mg/mL的标准储备液。同时取阴性压片糖果基质，按试样溶液制备空白基质溶液。取适量标准储备液，用空白基质溶液配制阿齐沙坦的基质曲线和阿齐沙坦酯的基质曲线(质量浓度2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL)，其中2ng/mL为检出限溶液。

2、试样溶液制备

取适量样品，用研磨机打碎混匀。称取1g样品于50mL容量瓶中，加入40mL甲醇-乙腈混合溶液，涡旋1min，超声提取10min。取出放冷后用甲醇-乙腈混合溶液定容至50mL，过0.22μm滤膜待测。

3、试样测定

分别取2μL基质曲线和试样溶液分别注入液质联用仪，按“实施例9”的色谱、质谱条件测定。

结果：试样溶液中出现与阿齐沙坦、阿齐沙坦酯标准品溶液中保留时间一致的色谱峰，特征离子对相对丰度比一致，定性判断检出阿齐沙坦和阿齐沙坦酯。试样溶液中阿齐沙坦和阿齐沙坦酯浓度超出线性范围，需进行稀释。取试样溶液和空白基质溶液适量，分别用甲醇-乙腈混合溶液稀释200倍和1000倍。采用稀释后的空白基质溶液重新配制阿齐沙坦酯基质曲线，待测。稀释后的试样溶液待测，待测。

以定量离子对的峰面积对应基质曲线的浓度作线性回归方程，带入试样溶液中目标物的峰面积计算浓度，计算数据和结果见表2和表3，样品图谱见图11。本样同时检出阿齐沙坦和阿齐沙坦酯，结果以两者之和表示，以阿齐沙坦酯计。

第一天测定样品中阿齐沙坦含量140mg/kg，折算成阿齐沙坦酯为174mg/kg；测定阿齐沙坦酯含量为2917mg/kg；综合后样品中阿齐沙坦酯含量为3091mg/kg。

第三天测定样品中阿齐沙坦含量492mg/kg，折算成阿齐沙坦酯为613mg/kg；测定阿齐沙坦酯含量为2260mg/kg；综合后样品中阿齐沙坦酯含量为2873mg/kg。

两天的计算结果，未综合折算的阿齐沙坦酯含量测定值偏差为25.4％，综合折算后偏差为7.3％，表明通过折算的方式，能有效解决阿齐沙坦酯测定重现性差的问题。

表2基质曲线浓度和峰面积数据

表3试样溶液峰面积数据和计算结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。