一种治疗Dravet综合征或其他难治性癫痫的U7-snRNA及其用途

摘要

本发明提供了一种治疗Dravet综合征或其他难治性癫痫的U7‑snRNA、U7‑snRNA表达框、表达载体及其用途，表达所述U7‑snRNA的碱基序列如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：8中的至少一种碱基序列所示。本发明是采用U7‑snRNA技术来调控SCN1A基因选择性剪接,设计的U7‑snRNA能够提升细胞内SCN1A基因的表达水平，可作为一种潜在的基因治疗手段，用于治疗Dravet综合征或其他难治性癫痫。

说明书

技术领域

本发明涉及一种治疗Dravet综合征或其他难治性癫痫的U7-snRNA、U7-snRNA表达框、表达载体及其用途。

背景技术

Dravet综合征，也被称作婴儿严重肌阵挛性癫痫。这是一种会进行发展的疾病，但几乎没有有效的疗法。通常首先出现在婴儿和幼儿身上，患者有频繁、长时间的癫痫发作；行为问题；发育迟缓；运动和平衡问题；以及其他问题。患有这种疾病的人通常需要持续的护理，并面临着更高的猝死风险。据认为，大约每15,700人中就有一人受到影响。目前普遍认为编码Na

目前在Dravet综合征中发现SCN1A基因突变，现有的治疗Dravet综合征的治疗方法包括抗癫痫药物、迷走神经刺激和采用极低碳水化合物生酮饮食。但没有一种治疗方法直接解决了这种疾病的根本原因，即改变中间神经细胞中Na

Dravet综合征的癫痫发作通常难以控制，抗癫痫药物虽然可以减少发作，但不能控制发作，且抗癫痫药物和生酮饮食能否改善预后仍待商榷。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种治疗Dravet综合征或其他难治性癫痫的U7-snRNA、U7-snRNA表达框、表达载体及其用途。通常患者体内的一对SCN1A等位基因中有一个是正常的，另一个是突变的。而正常SCN1A等位基因在外显子20′处发生选择性剪接，一种是正常剪接模式，这种剪接模式生成的mRNA可以翻译编码蛋白Na

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种治疗Dravet综合征或其他难治性癫痫的U7-snRNA，表达所述U7-snRNA的碱基序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8中的至少一种碱基序列所示。U7-snRNA的碱基序列是将SEQ ID NO：1～8中的至少一种碱基序列中的T替换为U得到的。

本发明提供了一种治疗Dravet综合征或其他难治性癫痫的U7-snRNA表达框，所述U7-snRNA表达框依次包括U7启动子、上述所述的U7-snRNA以及U7终止子。

本发明提供了一种治疗Dravet综合征或其他难治性癫痫的表达载体，所述表达载体含有能表达上述所述的U7-snRNA的碱基序列或者含有上述所述的U7-snRNA表达框。

优选地，所述表达载体的基础载体为pcDNA3.1(-)载体。

优选地，所述表达载体含有U7启动子和U7终止子。

优选地，所述表达载体是将表达所述U7-snRNA的碱基序列插入到pcDNA3.1(-)载体制得。

本发明提供了上述所述的U7-snRNA、上述所述的U7-snRNA表达框或上述所述的表达载体在制备用于治疗Dravet综合征或其他难治性癫痫的药物中的用途。

本发明提供了一种用于治疗Dravet综合征或其他难治性癫痫的药物，所述药物含有上述所述的U7-snRNA、上述所述的U7-snRNA表达框或上述所述的表达载体。

优选地，所述药物的剂型为冻干粉。

有益效果：

本发明提供了一种调控SCN1A基因Pre-mRNA选择性剪接的U7-snRNA、U7-snRNA表达框、表达载体及其用途。本发明是采用U7-snRNA技术来调控SCN1A基因选择性剪接,设计的U7-snRNA能够提升细胞内SCN1A基因的表达水平，可作为一种潜在的基因治疗手段，用于治疗Dravet综合征或其他难治性癫痫。

附图说明

图1：本发明设计的U7-snRNA对SCN1A基因毒性外显子20′的靶向修复结果。其中(A)描述特异性U7-snRNA在Exon20上结合的位置，剪接供体位点和上下游的序列已经列出来了，上游是外显子，下游是内含子；每一条线对应于特异性U7-snRNA结合于前体mRNA上的位置。(B)U7-snRNA对minigene载体的剪接分析通过RT-PCR对剪接产物进行分析，用2％的琼脂糖凝胶电泳。小的黑色框代表Exon20。(C)柱状图代表每组正常剪接产物的定量结果，数据是由三次独立重复实验的结果

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

随着RNA技术的迅猛发展，为异常剪切导致的疾病尤其是癫痫开辟了新的治疗途径，为科研工作者提供了一个全新的基因治疗方法。该技术通过用U7小核snRNA(U7-smallnuclear RNA，U7-snRNA)修复或者阻抑特定靶基因的表达,来达到治疗疾病的目的,是基因治疗的重要组成部分.U7 snRNA参与组蛋白mRNA 3'末端的形成。经过改造的U7-snRNA与特定外显子的5'ss、3'ss、BP(branch point)或ESE位点结合，用来抑制该外显子的剪接，作为基因治疗的新方案。本发明的U7-snRNA来源于针对SCN1A基因毒性外显子20′3'ss附近的保守序列而制备的分子。

本发明的U7-snRNA来源于针对SCN1A基因剪切供体位点附近的保守序列而制备的分子。U7-snRNA的制备采用载体表达的方法，体外转录，化学合成法，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好的获得剪切修复的效率。

本发明设计的U7-snRNA单链靶向分子，靶向作用于SCN1A基因第20′号毒性外显子的剪接受体位点附近位置，具有如下序列结构：

U7-snRNA-OPT(E20’-BP)：

U7-snRNA-OPT(E20’-3’ss)：

U7-snRNA-OPT(E20’-5’ss)：

U7-snRNA-OPT(E20’-BP+3’ss)：

U7-snRNA-OPT(E20’-BP+5’ss):

U7-snRNA-OPT(E20’-3’ss+5’ss):

U7 ESE1：

CATCCAAGTTGGAGCAAGATTAGAATTTTTGGAGTAGGCTTTCTGGCTTTTTACCGGAAAGCCCCT(SEQ ID NO:7)

U7 ESE2：

1、U7-snRNA载体表达的方法:

以人基因组DNA为模板扩增U7-snRNA片段，用NEB的Q5高保真酶PCR扩增572bp的人源U7-snRNA。U7-snRNA片段扩增序列为:F:5'TTTGGATCCTGGCATCCTTAACCACCT3'(SEQ IDNO:9)，R:5'TTTAAGCTTTCAAGACCACCAAAACTACC3'(SEQ ID NO:10)。将PCR片段插入到pcDNA3.1(-)载体的BamHI和HindIII酶切位点之间，使用BglII和XbalI双酶切去除上游的CMV启动子和T7启动子，以免影响U7-snRNA启动子活性。

2.U7-snRNA载体表达的方法:

使用北京百奥莱博科技有限公司T7 RNA聚合酶的U7-snRNA体外转录试剂盒进行体外转录制备.

a、制备DNA模板。将572bp的U7-snRNA片段插入到pcDNA3.1(-)载体载体的BamHI和HindIII酶切位点之间，用作体外转录的模板，用BglII内切酶将载体切成线性。载pcDNA3.1(-)载体U7-snRNA片段上游存在T7启动子。

b、体外转录反应。

在一个RNase-free的塑料离心管中，在室温下按次序加入下列成分：DNA模板，转录预配液(2×T7)，T7 RNA聚合酶，Rnase-free的水。37℃保温1-2小时。70℃加热10分钟灭活T7 RNA聚合酶。取1-3uL电泳检测转录效果。得到的RNA可以放-80℃保存。

c、去除DNA模板。在体外转录体系中加入1uL自备的RNase-free DNase。37℃保温15-30分钟。用自备的等体积(100uL)的Tris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。加200uL微量核酸沉淀剂(用前需要摇晃混匀)，振荡后15000rpm离心3-5分钟，弃上清。加入1mL 75％乙醇，震荡10秒后15000rpm离心3-5分钟，弃上清。短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。晾干，所得沉淀即体外转录所得的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。

3.在上海生工生物工程公司合成U7-snRNA目标片段，并进行甲氧基修饰。

应用U7-snRNA技术，用靶向目标基因的U7-snRNA作为靶向药物，在基因的剪切过程进行修复，从而有效抑制选择性剪接的异常mRNA表达，具有特异性强，高效，副作用小，且能弥补目前治疗基因突变所致疾病的治疗手段不足，在不久的将来可能成为一种新的治疗特定类型疾病的方法。

本发明的U7-snRNA分子可以作为抗Dravet综合征的有效成分。作为该U7-snRNA的另一种表达形式，可以将其制备成DNA表达框形式，比如U7启动子—U7-snRNA—U7终止子。

为了实现本发明的设计思想并且验证得到的U7-snRNA的抗疾病效果，设计了如下实验方案：

作为该U7-snRNA的另一种表达形式，可以将其制备成DNA表达框形式，比如U7启动子—U7-snRNA—U7终止子。

处于应用的目的，可以将U7-snRNA分子，表达U7-snRNA的DNA表达框，或者包含U7-snRNA分子表达框的质粒作为药物直接给药于受药者身上。

本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适应相应疾病的给药，并且保持U7-snRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉

比如：

(1)构建针对SCN1A基因的U7-snRNA分子库，该分子库包含了靶向至SCN1A基因剪切受体位点附近的U7-snRNA效应分子。

(2)制备具有相应效应的U7-snRNA表达框，其结构为U7启动子—U7-snRNA—U7终止子，使其更易于体外筛选。

(3)运用RT-PCR技术和测序，检测上述U7-snRNA表达框在细胞转录的效应U7-snRNA分子对SCNA基因异常剪切的抑制作用。

实施例1

1、PcDNA3.1-SCN1A(E20-E20′-E21)剪接报告载体构建:

以人基因组DNA为模板扩增依次SCN1A基因第20、20′、21号外显子和部分内含子，依次命名为E20、E20′、E21，大小分别为373bp，665bp，584bp。

设计两端带有同源臂的扩增引物，E20的扩增引物为F:cgtttaaacgggccctctagaGTTTCATTGGTCAGTTTAACAGCAA(SEQ ID NO:11)，R:taaaagctgtcagccagCTCCCAAGATGGATTAGGAAATAAA(SEQ ID NO:12)。E20′的扩增引物为F:gagCTGGCTGACAGCTTTTAAACATTT(SEQ IDNO:13)，R:aacttgctgccagCACCAATCCAGTAATCTCCCCA(SEQ ID NO:14)。E21的扩增引物为F:attggtgCTGGCAGCAAGTTCCTCTGATT(SEQ ID NO:15)，R:cttggtaccgagctcggatccAACTTGAAGCAAAGAGAGATACCCA(SEQ ID NO:16)。将E20、E20′、E21的PCR片段用同源重组的方法插入到pcDNA3.1(-)载体的XbaI与BamHI酶切位点之间之间，构建PcDNA3.1-SCN1A(E20-E20′-E21)剪接报告载体。

2、U7-snRNA载体表达的方法

以人基因组DNA为模板扩增U7-snRNA片段，用NEB的Q5高保真酶PCR扩增572bp的人源U7-snRNA。U7-snRNA片段扩增序列为:F:5'TTTGGATCCTGGCATCCTTAACCACCT3'(SEQ IDNO:9)R:5'TTTAAGCTTTCAAGACCACCAAAACTACC3'(SEQ ID NO:10)。将PCR片段插入到pcDNA3.1(-)载体的BamHI和HindIII酶切位点之间，使用BglII和XbalI双酶切去除上游的CMV启动子，以免影响U7-snRNA启动子活性。

U7-snRNA片段序列：

tggcatccttaaccacctacagtttgagaagggagtgggtgataaaagcctggaagggaagggaaatcgggccgggcattaggctccatcgctcatcaatagacaaggcctttaggaaactgcgacaacggcttttgctctgggcctttactgccgaatccaggtctccgggcttaacaacaacgaaggggctgtgactggctgctttctcaaccaatcagcaccgaactcatttgcatgggctgagaacaaatgttcgcgaactctagaaatgaatgacttaagtaagttccttagaatattatttttcctactgaaagttaccacatgcgtcgttgtttatacagtaataggaacaagaaaaaagtcacctaagctcaccctcatcaattgtggagttcctttatatcccatcttctctccaaacacatacgcagcagtgttacagctcttttagaatttgtctagtaggctttctggctttttaccggaaagcccctcttatgatgtttgttgccaatgatagattgttttcactgtgcaaaaattatgggtagttttggtggtcttga。(SEQ ID NO:17)

以pcDNA3.1-U7-snRNA载体为模板，用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的MutExpress II Fast Mutagenesis Kit V2进行定点突变，构建pcDNA3.1-U7 sm OPT-snRNA，设计pcDNA3.1-U7 sm OPT-snRNA点突变引物，用点突变试剂盒的高保真酶PCR扩增pcDNA3.1-U7-snRNA，将扩增的PCR产物重组连接获得pcDNA3.1-U7 sm OPT-snRNA，再以U7sm OPT-snRNA为模板，用点突变试剂盒的高保真酶PCR扩增pcDNA3.1-U7 sm OPT-snRNA，将扩增的PCR产物重组连接构建SCN1A毒性外显子E20′靶向性U7-snRNA表达载体pcDNA3.1-U7OPT E20′-BP、pcDNA3.1-U7 OPT E20′-3′SS、pcDNA3.1-U7 OPT E20-5′SS、pcDNA3.1-U7OPT E20′-BP+3′SS、pcDNA3.1-U7 OPT E20′-BP+5′SS、pcDNA3.1-U7 OPT E20′-3′SS+5′SS、pcDNA3.1-U7 ESE1,pcDNA3.1-U7 ESE2。点突变引物序列如下(小写序列为5'端添加的重组序列)：

U7 sm OPT-snRNA：

F:GaatttttggagTAGGCTTTCTGGCTTTTTACCG(SEQ ID NO:18)

R:GCCTActccaaaaattCTAAAAGAGCTGTAACACTGCTGCG(SEQ ID NO:19)

U7 OPT E20′-BP：

F:gtttgttattagttagaaatcAGAATTTTTGGAGTAGGCTTTCTGG(SEQ ID NO:20)

R:tctaactaataacaaacGCTGCGTATGTGTTTGGAGAGA(SEQ ID NO:21)

U7 OPT E20′-3′SS：

F:cctatacaaaatagaaatataAGAATTTTTGGAGTAGGCTTTCTGG(SEQ ID NO:22)

R:tttctattttgtataggatGCTGCGTATGTGTTTGGAGAGA(SEQ ID NO:23)

U7 OPT E20′-5′SS：

F:gtaatacagtacccataatAGAATTTTTGGAGTAGGCTTTCTGG(SEQ ID NO:24)

R:tatgggtactgtattacGCTGCGTATGTGTTTGGAGAGA(SEQ ID NO:25)

U7 OPT E20′-BP+3′SS：

F:tagaaatcatcctatacaaaatagaaatataAGAATTTTTGGAGTAGGCTTTCTGG(SEQ ID NO:26)

R:tgtataggatgatttctaactaataacaaacGCTGCGTATGTGTTTGGAGAGA(SEQ ID NO:27)

U7 OPT E20′-BP+5′SS：

F:aatcgtaatacagtacccataatAGAATTTTTGGAGTAGGCTTTCTGG(SEQ ID NO:28)

R:gggtactgtattacgatttctaactaataacaaacGCTGCGTATGTGTTTGGAGAGA(SEQ IDNO:29)

U7 OPT E20′-3′SS+5′SS：

F:tatagtaatacagtacccataatAGAATTTTTGGAGTAGGCTTTCTGG(SEQ ID NO:30)

R:gggtactgtattactatatttctattttgtataggatGCTGCGTATGTGTTTGGAGAGA(SEQ IDNO:31)

U7 ESE1：

F:tccaagttggagcaagattAGAATTTTTGGAGTAGGCTTTCTGG(SEQ ID NO:32)

R:atcttgctccaacttggatGCTGCGTATGTGTTTGGAGAGA(SEQ ID NO:33)

U7 ESE2：

F:tcaggggaggaaccagcgctcAGAATTTTTGGAGTAGGCTTTCTGG(SEQ ID NO:34)

R:cgctggttcctcccctgagGCTGCGTATGTGTTTGGAGAGA(SEQ ID NO:35)

将PcDNA3.1-SCN1A(E20-E20′-E21)剪接报告载体(WT)和不同pcDNA3.1-U7-snRNA载体用lip2000转染试剂转染到HEK293细胞中，载体转染浓度1μg/ml，转然后培养48小时，检测mRNA的表达情况。

U7-snRNA对SCN1A基因毒性外显子20′的靶向修复。特异性U7snRNA的修复实验结果示：野生型minigene正常转录本的比例为(11.52±1.27)％，特异性U7snRNA的修复实验结果显示：U7 OPT E20′-BP、U7 OPT E20′-3′SS、U7 OPT E20′-5′SS、U7 OPT E20′-BP+3′SS、U7 OPT E20′-BP+5′SS、U7 OPT E20′-3′SS+5′SS、U7 ESE1、U7 ESE2修复后正常转录本的比例分别为(68.39±1.38)％、(76.17±1.70)％、(72.69±1.91)％、(81.87±0.91)％、(94.55±1.12)％、(91.40±0.92)％、(96.15±0.47)％、(78.19±5.19)％。统计后发现WT分别和U7 OPT E20′-BP、U7 OPT E20′-3SS、U7 OPT E20′-5′SS、U7 OPT E20′-BP+3′SS、U7OPT E20′-BP+5′SS、U7 OPT E20′-3′SS+5′SS、U7ESE1、U7 ESE2共转后正常转录本的比例与WT单独转染相比，P值别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000(P<0.05)均有统计学差异，说明均有修复效果。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。