一种大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系的构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一种大鼠原代足细胞系和原代壁层上皮细胞系的构建方法及其应用，属于细胞技术领域。该构建方法包括将经PBS溶液肾脏局部灌注获得的肾皮质经酶混合溶液孵育消化，而后分别过筛获得肾小球，将其移至37℃下恒温培养的步骤。本发明还提供一种根据上述的构建方法构建得到的大鼠原代足细胞系和原代壁层上皮细胞系，及肾小球固有细胞的分离培养、分子调控机制及足细胞和壁层上皮细胞相互作用模型中的应用。本发明的构建方法重复性强，操作步骤简单，原代足细胞和壁层上皮细胞生长状态良好，生理状态稳定。本发明所提供的大鼠原代足细胞和壁层上皮细胞细胞系为后续肾小球固有细胞特定功能及细胞间相互作用的科学研究奠定理论基础和科技支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞技术领域，特别是涉及一种大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系的构建方法及其应用。

背景技术

足细胞(podocyte)是一种终末分化的肾脏脏层内皮细胞，具有初级足突与次级足突，相邻足细胞足突由裂孔隔膜相连，与带窗孔的内皮细胞和肾小球基底膜共同构成肾小球滤过屏障。在基于营养代谢敏感的哺乳动物中，足细胞常用做体外研究肾小球滤过屏障功能的体外研究模型。然而，目前对足细胞的研究愈发深入，但在营养代谢敏感的大鼠研究中未见有对应足细胞的体外培养模型。

壁层上皮细胞(parietal epithelial cells)为保有干细胞标志蛋白的肾脏壁层上皮细胞，与足细胞一同起源于后肾间充质干细胞，解剖位置在肾小球鲍曼囊壁上，与足细胞毗邻，且从尿极至血管极壁层上皮细胞逐渐丧失干细胞特征而表达足细胞标识蛋白，壁层上皮细胞可能为足细胞增殖的来源之一。在哺乳动物模型中，壁层上皮细胞常用做体外研究鲍曼囊在肾小球中功能及和损伤足细胞相互作用的体外研究模型。但目前对壁层上皮细胞的研究相对较少，并且缺乏壁层上皮细胞的体外培养模型。

本发明将以肾脏发育临近成熟的雄性大鼠(Sprague-Dawley)肾脏组织为研究对象，建立大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系培养体系并对分离的细胞进行鉴定，为今后大鼠足细胞和壁层上皮细胞分子调控机制及同一组织内相邻细胞间相互作用的细胞模型提供参考资料。

发明目的

本发明的目的是提供一种大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系的构建方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明所提供的大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系为后续大鼠肾小球固有细胞特定功能及细胞间相互作用的科学研究奠定理论基础和科技支撑，且所提供的细胞系能够用于研究疾病模型下相邻细胞损伤启动另一干细胞增殖分化分子机制。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞细胞系的构建方法，包括以下步骤：

(1)超净工作台内固定麻醉大鼠四肢，肾脏局部灌注

(2)摘取双侧肾脏，剥去肾包膜后尽量修剪肾门区域，肾皮质在酶混合溶液中恒温培养箱孵育，过筛获得去囊肾小球悬液

(3)肾皮质过筛获得具囊肾小球悬液，将所有获得的肾小球悬液洗涤3-4次

(4)肾小球悬液接种于胶原包被的细胞板中37℃培养箱培养分别得到原代足细胞和原代壁层上皮细胞

(5)胰酶收集培养获得的原代足细胞和原代壁层上皮细胞，过筛去除肾小球，重新接种两种原代细胞，待细胞贴壁率达80％时，每4-5天传代一次

(6)采用免疫荧光染色法鉴定。

进一步地，在步骤(1)中，所述肾脏灌注的溶液为D-PBS缓冲液。

进一步地，在步骤(2)中，所述酶混合溶液为提前热孵的胶原酶A+脱氧核糖核酸酶I混合溶液。进一步地，在步骤(2)中，所述过筛网目为150目及200目

进一步地，在步骤(3)中，所述过筛网目为80目及100目

进一步地，在步骤(4)中，所述两种原代细胞需培养7-9天

进一步地，在步骤(5)中，所述胰酶为1/2EDTA胰酶溶液

进一步地，在步骤(5)中，所述过筛去除肾小球为40μm孔径网筛

进一步地，在步骤(6)中，所述的免疫荧光染色为足细胞特异性足突骨架蛋白标记基因Synaptopodin作为标记物在原代足细胞中进行免疫荧光检测；所述的免疫荧光染色还包括壁层上皮细胞特异性核转录因子标记基因PAX2和特异性胞间连接蛋白标记基因Claudin-1作为标记物在原代壁层上皮细胞中进行免疫荧光检测。

本发明还提供一种根据上述的构建方法构建得到的大鼠原代足细胞系和原代壁层上皮细胞系。

本发明还提供上述原代足细胞系和原代壁层上皮细胞系在两种肾小球固有细胞的分离培养、足细胞和壁层上皮细胞分子调控机制，建立足细胞和壁层上皮细胞相互作用模型中的应用。本发明公开了以下技术效果：

本发明在无菌条件下获取大鼠肾皮质组织，并将其立即置于胶原酶A+脱氧核糖核酸酶I混合溶液中恒温孵育；研磨过不同网目网筛后用D-HBSS溶液洗涤肾小球，进一步离心提纯；使用含胎牛血清、双抗(青霉素-链霉素)的DMEM/F-12完全培养基重悬沉淀，可获得去囊肾小球和具囊肾小球，经上述完全培养基培养7天后获得原代足细胞和原代壁层上皮细胞。本发明提供的大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞的分离和原代培养方法，所获得的大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞生长状态稳定，可连续传代，且通过传代能够批量获得大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞。

本发明的大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞构建方法操作简便，可重复性强，可为其他哺乳动物足细胞和壁层上皮细胞的分离培养提供参考。

本发明获得的原代足细胞系和原代壁层上皮细胞系可为两种肾小球固有细胞的分离培养、足细胞和壁层上皮细胞分子调控机制及足细胞和壁层上皮细胞相互作用模型中的应用提供参考材料。

为了更清楚说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要实用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

附图说明

图1为原代足细胞和原代壁层上皮细胞不同贴壁时长的生长状态，其中，a,c,e为足细胞形态图，b,d,f为壁层上皮细胞形态图

图2为原代足细胞Synaptopodin免疫荧光鉴定结果，其中，红色荧光为荧光成像细胞图，蓝色荧光为DAPI染色后的细胞核；综合为叠加图；

图3为原代壁层上皮细胞PAX2和Claudin-1免疫荧光鉴定结果，其中，红色为荧光成像细胞图，蓝色荧光为DAPI染色后的细胞核；综合为叠加图；

图4为原代足细胞和原代壁层上皮细胞光镜下的形态图，a为去囊肾小球所得原代足细胞的传代细胞形态图；b为具囊肾小球所得原代壁层上皮细胞的传代细胞形态图；

图5为原代足细胞光镜下的形态图，a为提前预热的胶原酶A+脱氧核糖核酸酶I混合溶液中恒温孵育分离的去囊肾小球所得原代足细胞的细胞形态图；b为未提前热孵的胶原酶A+脱氧核糖核酸酶I混合溶液中室温孵育分钟分离的去囊肾小球所得原代足细胞的细胞形态图；

具体实施方案

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本申请实施例中所用的试剂，若无特殊说明，均可通过普通市售获得。

实施例1

1.大鼠原代足细胞和原代壁层上皮细胞的分离和原代培养

6周龄SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠购于北京维通利华动物技术有限公司。

腹腔注射1.5-2mL 2％戊巴比妥钠(40mg/kg)，麻醉后75％乙醇溶液消毒全身，在超净工作台内固定大鼠四肢，暴露腹部。

在无菌超净工作台内剖开大鼠腹腔，使用无菌缝合线与一次性静脉注射针进行肾脏的D-PBS缓冲液局部灌注。

冰上摘取双侧肾脏后切取肾皮质，用D-HBSS平衡溶液清洗维持肾小球活性，收集肾小球分别用提前预热的胶原酶A+脱氧核糖核酸酶I混合溶液中恒温孵育，立即倒出酶溶液并用D-HBSS洗涤。

随后用酶溶液处理的肾皮质组织在150目网筛上用注射器内芯研磨至匀浆状，再次过筛200目，收集去囊肾小球悬液，同时将未经酶溶液处理的肾皮质在80目网筛上用注射器内芯研磨至匀浆状，再次过筛100目，收集具囊肾小球悬液。

将肾小球悬液反复用D-HBSS平衡溶液清洗，1000rpm离心3min弃上清的方法洗涤3-4次，最后用含10％ FBS及1％双抗(青霉素+链霉素)的DMEM/F-12完全培养基重悬肾小球组织，并接种于用0.012mg/mLI型鼠尾胶原溶液包被2h后的25cm

2.原代足细胞和原代壁层上皮细胞的传代培养

当原代足细胞和原代壁层上皮细胞贴壁且单层细胞面积达到80％时，将原培养瓶中的培养基吸出，加入PBS溶液轻轻漂洗后吸出溶液，加入2ml 0.5％的含EDTA胰蛋白酶消化液(Gibco)消化90s后吸出胰蛋白酶，即可加入2ml含血清和双抗的DMEM/F-12完全培养基终止消化，并使用移液枪将细胞反复吹打10次制成单细胞悬液，吸出1ml至新的25cm

3.细胞的冻存与复苏

本实施例中的原代足细胞和原代壁层上皮细胞从第2代开始，每隔2代放入液氮中进行长期保存。每隔20天进行一次复苏，显微镜下观察细胞复苏后的生长情况，细胞表现出60％的成活率。结果显示细胞已传代10余次，生长状态无明显差异。

4.原代足细胞和原代壁层上皮细胞的鉴定

免疫荧光法鉴定原代足细胞和原代壁层上皮细胞

根据足突骨架蛋白(Synaptopodin)在足细胞中特异性表达及基因配对盒子2(Paired Box 2,PAX2)和紧密连接跨膜蛋白(Claudin-1)在壁层上皮细胞中特异性表达的特点，采用细胞免疫荧光法对体外培养的原代足细胞和原代壁层上皮细胞进行鉴定。具体操作步骤如下：a收板清洗：收集培养好的细胞，将12孔板中的培养基吸弃，各加入500μL1×PBS，清洗3次，5min/次。

b固定：吸弃PBS，4％多聚甲醛溶液固定15-20minc清洗：吸弃12孔板中的多聚甲醛，加入500μL1×PBS，清洗3次，5min/次d封闭：吸弃PBS，各孔加入500μL封闭液，常温封闭1he清洗：去除封闭液，各加入500μL1×PBS，清洗3次，5min/次

f一抗孵育：抗体充裕时直接在孔内加入250μL一抗溶液(1:250)，抗体较少时，取12孔板，将封口膜剪至适宜大小，绷直覆盖于孔板上(孔板内每孔添加PBS避免干片)，对应每孔封口膜上滴加25μL一抗溶液，勾取爬片将细胞面覆盖于抗体液面上，孔板四角用小团封口膜垫住，避免板盖挤压爬片，4℃冰箱孵育过夜

g清洗：各加入500μL1×PBS后勾回爬片，PBS清洗3次，5min/次

h二抗孵育：吸弃PBS，250-500μL二抗溶液(1:500)常温摇床孵育1h(本步骤应避光)i清洗：PBS清洗3次，5min/次(本步骤应避光)

J DAPI/Hoechst染色：常温孵育30min(本步骤应避光)

k清洗：去除Hoechst染料，PBS清洗3次，5min/次(本步骤应避光)

l封片：第三次PBS洗涤时不吸弃，准备载玻片，并提前滴加30μL抗荧光淬灭封片剂，略摇晃孔板使爬片松动，注射器针头尖端处理成卷曲状，勾取爬片使其斜立，带齿弯镊轻轻夹取爬片边缘，使细胞面中央与封片剂接触而后快速放下爬片，自然封片。

m检测：一周内用双光子激光共聚焦荧光正置显微镜Leica TCS SP8的单光子激光通道检测细胞荧光强度。

n分析：结果显示，原代足细胞Synaptopodin免疫荧光鉴定中，红色荧光为荧光成像细胞图，蓝色荧光为DAPI染色后的细胞核；综合为叠加图；原代壁层上皮细胞PAX2和Claudin-1免疫荧光鉴定结果中，红色为荧光成像细胞图，蓝色荧光为DAPI染色后的细胞核；综合为叠加图；

本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在原代足细胞所在去囊肾小球的分离部分，用未提前预热的胶原酶A+脱氧核糖核酸酶I混合溶液中室温孵育。剩余步骤与实施例1相同。分离结果显示，实施例1分离得到的去囊肾小球生长爬出的足细胞分布密集，围绕原始肾小球集群生长，详见图5中的A，而本对比例使用未提前预热的酶混合溶液室温孵育所得到的贴壁肾小球数目大大降低，原代足细胞数目很少，难以形成细胞集群，且细胞形态紊乱，详见图5中的B。

本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在原代足细胞和原代壁层上皮细胞的分离部分，用铁粉溶液进行肾脏局部灌注并使用免疫磁柱吸附洗涤。剩余步骤与实施例1相同。分离结果显示，实施例1分离得到的去囊肾小球大量贴壁且生长活性良好，而本对比例使用铁粉溶液磁珠免疫吸附法洗涤获得的去囊肾小球数目过低，同时肾小球难以贴壁维持原代细胞的进一步爬出生长。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。