基于非靶标代谢组学分析拜赖青霉产生的抑制芝麻病原菌活性成分的方法

摘要

本发明涉及一种基于非靶标代谢组学分析拜赖青霉产生的抑制芝麻病原菌活性成分的方法，具体包括：拜赖青霉菌株47M‑1代谢组样品收集和检测、代谢组数据预处理、主成分分析、正交偏最小二乘法‑判别分析、上调差异代谢物的筛选、上调差异代谢物在HMDB二级分类中的分布分析、上调差异代谢物的KEGG代谢通路富集分析以及目标差异代谢物的筛选和层次聚类分析等步骤。本发明通过LC‑MS/MS技术检测，分析了菌株47M‑1发酵产物中的活性代谢物，明确了菌株47M‑1产生的潜在的抑菌活性物质及抑菌活性物质相关的代谢途径，为菌株47M‑1的深入研发提供了理论依据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于非靶标代谢组学分析拜赖青霉产生的抑制芝麻病原菌活性成分的方法，属于代谢组学分析技术领域。

背景技术

芝麻是重要的油料作物之一，在我国河南、湖北、安徽和江西等省份大面积种植。由于芝麻生育期短，且整个生育期处于高温多雨的季节，导致芝麻易受多种病原菌的侵袭，严重影响芝麻产量和品质。开发利用广谱高效的生防菌株及其抑菌活性代谢物，是芝麻病害绿色防控的重要手段。拜赖青霉因其良好的促生能力受到科研人员的广泛关注，近年来，其在植物病害防治中的潜力也逐渐被挖掘，拜赖青霉对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、大丽轮枝菌、胶胞炭疽菌和禾谷镰刀菌等植物病原真菌具有良好的抑制作用，研究发现该菌可产生抑真菌活性化合物，如倍半烯萜penicibilaenes A和B，此外，该菌还可产生多种杀线虫活性化合物。

拜赖青霉Penicillium bilaiae 47M-1培养滤液的10倍稀释液对多种芝麻病原真菌具有显著的抑菌活性，产生抑菌活性物质是该菌发挥抑菌作用的重要方式，目前对拜赖青霉的抑菌活性代谢物的研究尚不充分。生防菌的抑菌作用通常是多种代谢物共同作用的结果，存在单个抑菌活性成分含量低微的情况，传统的分离手段工作量大，且存在追踪不到抑菌活性成分的风险，快速发展起来的代谢组学技术，为生物代谢成分的高通量、整体全面的分析提供了保障，目前在微生物代谢成分研究中逐渐得到广泛应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于非靶标代谢组学分析拜赖青霉产生的抑制芝麻病原菌活性成分的方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种基于非靶标代谢组学分析拜赖青霉产生的抑制芝麻病原菌活性成分的方法，包括以下步骤：

(1)拜赖青霉菌株47M-1代谢组样品收集和检测

利用拜赖青霉菌株47M-1的孢子悬浮液培养拜赖青霉菌株47M-1样品，收集样品，进行代谢物提取和检测，采集色谱和质谱数据；

(2)代谢组数据预处理

对采集的色谱和质谱数据进行预处理，将预处理过的数据与BiotreeDB(V2.1)自建二级质谱数据库进行匹配来注释物质；

(3)主成分分析

使用SIMCA软件进行主成分分析，对预处理过的数据进行对数转换及中心化格式化处理，然后进行自动建模分析；

(4)正交偏最小二乘法-判别分析

以SIMCA软件对预处理过的数据进行对数转换和UV格式化处理，然后对第一主成分进行OPLS-DA建模，并对模型有效性进行评判；

(5)上调差异代谢物的筛选

以学生t检验的P<0.05，以及OPLS-DA模型第一主成分变量投影重要度>1为卡值标准，筛选显著上调的差异代谢物；

(6)上调差异代谢物在HMDB二级分类中的分布分析

以上调差异代谢物为分析对象，分析上调差异代谢物在HMDB数据库二级分类中的分布情况；

(7)上调差异代谢物的KEGG代谢通路富集分析

(8)目标差异代谢物的筛选和层次聚类分析

对目标差异代谢物的定量值计算欧式距离矩阵，以完全连锁方法对这些差异代谢物进行聚类，对具有相同特征的代谢物进行归类，并明确代谢物的组间变化特性。

所述步骤(1)代谢物检测的方法为：使用超高效液相色谱仪和液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离；采用有正离子模式POS和负离子模式NEG两种电离方式的高分辨质谱仪，分别采集POS和NEG的二级质谱数据，并对POS和NEG两组数据分别进行分析。

所述步骤(2)预处理的方法为：使用ProteoWizard软件，将采集到的色谱和质谱数据转换为mzXML格式，然后以R程序包进行峰识别、提取、对齐和积分处理，对数据进行整理，包括对单峰的过滤去除噪音，基于变异系数去除偏离值；以最小值二分之一填补缺失值；利用内标进行归一化处理。

所述步骤(4)模型有效性的评判方法为：以SIMCA软件对预处理过的数据进行对数转换和UV格式化处理，然后对第一主成分进行OPLS-DA建模，并用7折交叉验证的R

所述R

所述方法得到的拜赖青霉产生的抑制芝麻病原菌活性成分包括：柚皮素、原儿茶酸、D-(-)-奎宁酸、橙皮素、3-(3-羟基苯基)丙酸、3,4-二羟苯基丙酸、4’,5,7-三羟黄烷酮、迷迭香酸、佛手苷内酯和圣草酚。

所述方法得到的拜赖青霉产生的抑制芝麻病原菌活性成分包括：D-(-)-奎宁酸、3(3-羟基苯基)丙酸、3,4-二羟苯基丙酸、4',5,7-三羟黄烷酮和圣草酚。

本发明基于代谢组学分析，从生防拜赖青霉47M-1(已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学保藏中心，保藏编号：CCTCC：M 2018899，保藏日期：2018年12月17日)的代谢物中筛选出105种上调差异代谢物，上调差异代谢物在苯丙素和聚酮类化合物超类中分布最多，且上调差异代谢物主要富集在代谢途径、辅因子生物合成、嘌呤代谢、氨基酸生物合成和ABC转运体等通路。其中代谢途径富集比例高达84.44％，其次为辅因子生物合成途径，富集比例为20％。辅因子在代谢网络中通过调控胞内关键酶，广泛参与物质合成和分解代谢反应，在微生物细胞中进行调控的辅因子主要包括NAD(P)H/NAD(P)+、乙酰辅酶A和ATP/ADP，其中乙酰辅酶A可以作为酰基载体和代谢物前体，可用于合成脂质、聚酮、类异戊二烯等化合物。同时，乙酰辅酶A还参与了三羧酸循环、糖酵解、脂肪酸生物合成及氨基酸生物合成等重要的中心代谢途径。由苯丙氨酸脱氨基开始的合成途径是苯丙素类化合物的主要合成途径，过氧化物酶体NAD+载体将辅酶A从胞质向过氧化物酶体转运，为其中所有辅酶A连接酶提供重要底物，而过氧化物酶体ATP结合转运子对肉桂酰辅酶A的转运和催化是β-氧化途径合成苯丙素类化合物的第一步。此外，ABC转运体作为转运蛋白主要从事胞内外的物质转运，它可以结合辅因子ATP，ABC转运体的转膜蛋白在跨膜区组成通道，胞浆内的ATP结合区在Mg

因此，菌株47M-1的上调差异代谢物在辅因子生物合成途径的富集比例仅次于代谢途径，辅因子不仅可以作为聚酮类化合物合成的前体，参与苯丙素类化合物的合成，为化合物的合成和分解提供必须的能量，调控化合物的合成和分解代谢，同时可与ABC转运体协作进行胞内外化合物运输，因此辅因子生物合成途径是菌株47M-1抑菌活性代谢物发挥作用的关键途径。

进一步通过含药平板法对部分上调差异代谢物的抑菌活性进行验证，结果发现其中10种化合物：柚皮素、原儿茶酸、D-(-)-奎宁酸、橙皮素、3-(3-羟基苯基)丙酸、3,4-二羟苯基丙酸、4’,5,7-三羟黄烷酮、迷迭香酸、佛手苷内酯和圣草酚对芝麻病原真菌具有良好的抑菌活性，其中D-(-)-奎宁酸、3(3-羟基苯基)丙酸、3,4-二羟苯基丙酸、4',5,7-三羟黄烷酮和圣草酚对植物病原菌的抑菌活性在本发明中首次发现。

本发明明确了菌株47M-1产生的潜在抑菌活性代谢物的主要类群和关键代谢途径，并筛选到5种未经报道的具备植物病原菌抑菌活性的化合物。

本发明有益效果：

青霉是植物病害防治中重要的生防资源之一，青霉代谢产物极其丰富，可产生多种抑制植物病原菌生长的抑菌活性物质。生防拜赖青霉菌株47M-1是具备促生、诱导抗病性和广谱抑菌活性的高效生防菌株，其培养滤液对芝麻多种病原菌具备强烈的抑制作用。本研究通过LC-MS/MS技术检测并分析了菌株47M-1发酵产物中的活性代谢物，明确了菌株47M-1产生的潜在的抑菌活性物质及抑菌活性物质相关的代谢途径，为菌株47M-1的深入研发提供了理论依据。

本发明通过对部分上调差异代谢物的活性验证，筛选到10种芝麻病原真菌抑菌活性化合物，首次发现D-(-)-奎宁酸、3(3-羟基苯基)丙酸、3,4-二羟苯基丙酸、4',5,7-三羟黄烷酮和圣草酚对植物病原菌有抑制作用，为生物源农药的研发积累了材料。代谢组高通量、整体全面的检测和分析方法在生防菌抑菌活性产物研究方面的应用，为揭示生防菌的抑菌机理、开发生物源农药提供了新的方向。

附图说明

图1菌株47M-1在IM-CYA中培养时的生长曲线。

图2菌株47M-1培养滤液对四种芝麻病原菌的抑制作用。

图3正离子(A)和负离子(B)模式下样本PCA模型的得分散点图。

图4正离子和负离子模式下三个对比组的OPLS-DA模型的置换检验。

图5正离子和负离子模式下三组中差异代谢物的筛选。

注：A：火山图；B：上调和下调差异代谢物的数量；C：二级质谱定性匹配到物质的上调和下调差异代谢物的数量。

图6上调差异代谢物在HMDB超类中的富集情况。

图7上调差异代谢物的KEGG富集分析。

图8 38种代谢物的聚类分析热力图。

图9 17种化合物对四种病原菌菌丝生长的抑制率。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

1.实验菌株：

本研究所用拜赖青霉菌株47M-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏编号：CCTCC：M 2018899，保藏日期：2018年12月17日)，供试芝麻枯萎病病原尖孢镰刀菌8F27，由河南省农业科学院芝麻研究中心提供，其他供试芝麻病原菌立枯丝核菌、球黑孢和索氏平脐蠕孢，由河南省农业科学院植物保护研究所生物防治研究室分离和保存。

2.实验材料：

IM-CYA培养基：蔗糖30g，蛋白胨5g，MgSO

PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。

3.数据统计与分析：

使用SPSS 17.0软件对抑菌活性相关试验数据进行描述性统计及方差齐性检测，并采用Duncan's新复极差法进行显著性分析，利用GraphPad Prism 9.0软件作图，图中不同小写字母代表同一系列不同处理间在P＝0.05水平上存在显著差异。

实施例1、菌株47M-1生长曲线的测定

将菌株47M-1接种到PDA培养基上，待培养4～7d大量产孢时，用0.05％(v/v)的吐温80溶液洗脱孢子，用血球计数板计数孢子浓度，并调整孢子浓度为3×10

取1mL孢子悬浮液接种到100mL IM-CYA培养基中，于25℃、160r/min培养，分别在培养16h、20h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、192h和240h取培养物，过滤收集菌丝球，用滤纸吸干水分后，置于80℃烘箱烘至恒重，称量菌丝干重。以培养时间为横坐标，菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。

由图1可知，在培养16～144h之间，菌丝生长较快，菌丝干重迅速增长，为菌丝快速生长期，在培养144h之后，菌丝干重开始下降，进入衰亡期，即菌株47M-1的最佳培养时间是144h，本发明中代谢组取样时间点将截止到144h(图1)。

实施例2、菌株47M-1的培养液对四种芝麻病原真菌的抑菌活性

将1mL孢子悬浮液(3×10

将PDA平板置于28℃的恒温培养箱中培养8d，测定菌落直径，计算培养滤液对靶标菌的抑制率。抑制率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼直径)×100％。

由图2可知，随着培养时间的延长，培养滤液的抑菌活性逐渐增强，培养48h时的滤液抑菌活性较低，尤其是对尖孢镰刀菌和立枯丝核菌的抑制率仅为32.5％和17.7％(图2A和2C)，培养96h时的滤液对四种病原菌的抑菌活性均显著增强，对尖孢镰刀菌、球黑孢、立枯丝核菌和索氏平脐蠕孢的抑制率分别为100％、99.0％、52.8％和72.0％，培养144h时的滤液对立枯丝核菌和索氏平脐蠕孢的抑菌活性相比96h时仍在增长，尤其对索氏平脐蠕孢的抑制率显著增加，达86.7％(图2D)。结合菌株47M-1的生长曲线及其对四种芝麻病原真菌抑菌活性测定结果，对其液体培养48、96和144h的代谢物进行对比分析，来挖掘潜在的抑菌活性物质。

实施例3、菌株47M-1代谢组样品收集和检测

取菌株47M-1的孢子悬浮液(3×10

取20mg样品，加入1mL含同位素内标的提取液(甲醇：乙腈：水＝2:2:1(V/V/V))，涡旋混匀30s；35Hz研磨4min，超声5min(冰水浴)，重复3次；-40℃静置1h；将样品4℃、12,000r/min离心15min；取上清上机检测。另取等量所有样品的上清混合(QC样品)上机检测。

使用Vanquish超高效液相色谱仪和Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1mm×100mm，1.7μm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱的A相为水相(含25mmol/L乙酸铵和25mmol/L氨水)，B相为乙腈。梯度洗脱设置为：0～0.5min，95％ B；0.5～7min，95％～65％ B；7～8min，65％～40％ B；8～9min，40％ B；9～9.1min，40％～95％ B；9.1～12min，95％ B。流动相流速：0.5mL/min，柱温：30℃，样品盘温度：4℃，进样体积：3μL。

高分辨质谱(Q Exactive Orbitrap,QE)的电离源为电喷雾电离，有正离子模式(positive ion mode,POS)和负离子模式(negative ion mode,NEG)两种电离方式，数据分析过程中对POS和NEG两组数据分别分析。Thermo Q Exactive HFX质谱仪可在软件(Xcalibur，Thermo)控制下采集二级质谱(MS2)的数据。

使用ProteoWizard软件，将原始数据(采集到的色谱数据和质谱数据)转换为mzXML格式，然后以R程序包(内核为XCMS)进行峰识别、提取、对齐和积分等处理，然后对数据进行整理，包括对单峰的过滤去除噪音，基于变异系数去除偏离值；对单个峰过滤时保留单组空值不多于50％，或所有组中空值不多于50％的峰面积数据；以最小值二分之一填补缺失值；利用内标进行归一化处理。将处理过的数据与上海百趣生物医学科技有限公司自建二级质谱数据库BiotreeDB(V2.1)进行匹配来注释物质，算法打分的Cutoff值设为0.3。

经过数据处理后，正离子模式23871个峰被保留，通过二级质谱(MS2)定性匹配到599种物质；负离子模式13480个峰被保留，通过二级质谱(MS2)定性匹配到225种物质(表1)。

表1代谢组预处理后数据

实施例4、主成分分析(PCA)模型

使用SIMCA软件(V16.0.2，Umea，Sweden)进行主成分分析，对实施例3所得数据进行对数转换加中心化(CTR)格式化处理，然后进行自动建模分析。

由图3A和3B可知，在正离子和负离子模式中，样本全部处于95％的置信区间内，正离子模式和负离子模式中第一主成分(PC1)的贡献值分别达到了76％和62.8％，两种模式中M2、M4和M6主要由PC1进行区分，三组样本间分离趋势明显，表明3个时间点的代谢物存在显著差异。

实施例5、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)

以SIMCA软件对实施例3所得数据进行对数转换加UV格式化处理，然后对第一主成分进行OPLS-DA建模，并用7折交叉验证的R

由图4可知，在正离子模式(POS)和负离子模式(NEG)的六组对比中，原模型的R

实施例6上调差异代谢物的筛选

分别进行M4和M2、M6和M4、M6和M2三组数据的对比分析。以学生t检验(Student’st-test)的P<0.05，以及OPLS-DA模型第一主成分变量投影重要度(VIP)>1为卡值标准，筛选显著上调的差异代谢物(图5A中竖虚线右侧横虚线上方的点)。

由图5可知，正离子模式中，在M4-M2、M6-M4和M6-M2三组对比中分别筛选到差异代谢物15710个、9807个和16426个，其中上调差异代谢物分别有487个、446个和420个(图5A的POS分图中竖虚线右侧横虚线上方的点，图5B)；在负离子模式中，在M4-M2、M6-M4和M6-M2三组对比中分别筛选到差异代谢物7677个、3663个和7742个，其中上调差异代谢物分别有2804、1546和2857个(图5A的NEG分图中竖虚线右侧横虚线上方的点，图5B)；合并正离子和负离子模式的差异代谢物，即在M4-M2、M6-M4和M6-M2三组对比中差异代谢物数量分别为23387、13470和24168个，其中上调差异代谢物分别是3291、1992和3277个，由结果可知，差异代谢物中上调差异代谢物占比仅为14.0％，48h至96h的上调差异代谢物数量远高于96h至144h。

对代谢物进行注释，在正离子模式中，M4-M2、M6-M4和M6-M2三组对比的差异代谢物分别有397、349和429种匹配到物质，其中上调差异代谢物分别有21、9和19种(图5C)；在负离子模式下，4-2、6-4和6-2三组对比的差异代谢物分别有141、84和151种匹配到物质，其中上调差异代谢物分别为61、29和65种(图5C)。

实施例7、上调差异代谢物在HMDB二级分类中的分布

由于培养液的抑菌活性随培养时间的延长逐渐增强，以上调差异代谢物为分析对象，分析三组对比中匹配到物质的上调差异代谢物在HMDB数据库二级分类(超类)中的分布情况。

由图6可知，上调差异代谢物分布在9个超类中，主要富集在脂质和类脂分子、有机酸及其衍生物、苯丙素和聚酮类化合物、有机杂环化合物、有机氧化合物、核苷和核苷酸及其类似物和苯环型化合物中。M4-M2组82个上调差异代谢物和M6-M2组83个上调差异代谢物，主要分布在苯丙素和聚酮类化合物、有机酸及其衍生物超类中；M6-M4组38个上调差异代谢物主要分布在苯丙素和聚酮类化合物、有机氧化合物以及有机杂环化合物超类中(图6A)。HMDB富集分析结果表明，M4-M2与M6-M2的上调差异代谢物在数量和分布上更相近，上调差异代谢物在苯丙素和聚酮类化合物中富集最多。

对3组对比中的上调差异代谢物进行汇总去重复后，共筛选到上调差异代谢物105个，分布在9个超类中，其中苯丙素和聚酮类化合物超类中富集上调差异代谢物最多，达29个(图6B)。

实施例8、上调差异代谢物的KEGG代谢通路富集分析

通过去冗余分析共筛选到105个上调差异代谢物，对其进行KEGG通路富集分析，由图7可知，富集的B级通路涉及氨基酸代谢、碳水化合物代谢、细胞生长和死亡、全局和概述图谱、膜转运和核苷酸代谢，包括代谢途径、辅因子生物合成、嘌呤代谢、氨基酸生物合成、ABC转运体、酪氨酸代谢、半乳糖代谢和戊糖、葡萄糖醛酸转换途径，其中代谢途径富集比例最高，达84.4％，其次为辅因子生物合成，富集比例为20％。

实施例9、目标差异代谢物的筛选和层次聚类分析

对涉及筛选得到的上调差异代谢物的相关文献进行检索，将上调差异代谢物分布最多的超类中的代谢物，及其它超类中有抑菌活性相关报道的上调差异代谢物作为目标差异代谢物，对目标差异代谢物的定量值计算欧式距离矩阵，以完全连锁方法对这些差异代谢物进行聚类，对具有相同特征的代谢物进行归类，并明确代谢物的组间变化特性。

对筛选出来的105种上调的差异代谢物进行文献检索，结果表明，苯丙素和聚酮类化合物中上调的差异代谢物共29种，其中文献报道有抑菌活性的有17种，其中12种有抑制真菌活性，分别为3-羟基根皮素、4-甲基表儿茶素、二氢芒柄花黄素、甘草素、橙皮素、表儿茶素、樱花素、茶碱、迷迭香酸、染料木苷、柚皮素和佛手苷内酯。其中11种具有抑制细菌活性，分别为4-甲基表儿茶素、3-羟基根皮素、燕麦生物碱1p、水飞蓟亭、山奈素、表儿茶素、迷迭香酸、圣草酚、染料木苷、(-)-表没食子儿茶素和柚皮素。其中甘草素同时具备抗真菌、抗病毒活性，表儿茶素、迷迭香酸、染料木苷和柚皮素同时具备抑制真菌和细菌活性，3-羟基根皮素和橙皮素对植物病原真菌有抑菌活性。除苯丙素和聚酮类化合物外，其他超类中有抑菌活性报道的上调差异代谢物有9种，分别为原卟啉、N-(2-糠酰)甘氨酸、异柠檬酸、原儿茶酸、苯线磷、奎宁酸、尿囊素、新绿原酸和隐绿原酸。

以苯丙素和聚酮类化合物超类中的29种上调差异代谢物，及其他超类中有抑菌活性报道的9种上调的差异代谢物为目标差异代谢物，进行聚类分析。由图8可知，38种代谢物被分为三类，从48h、96h至144h，第一类代谢物积累量先降低再升高，仅包含3种化合物；第二类代谢物积累量先升高之后为持平状态，包含13种化合物；第三类代谢物积累量持续升高，包含22种化合物。

实施例10、目标差异代谢物对四种病原菌的抑菌作用测定

明确目标代谢物的CAS号，并对其市售试剂或标准品进行检索，最终选择其中17种代谢物的标准品(表2)，使用含药平板法测定这17种标准品对芝麻病原尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、索氏平脐蠕孢和球黑孢的抑菌作用。

拟定目标化合物的初筛浓度为2mg/mL，由于规格限制，部分化合物初筛浓度为1mg/mL。每平板倒10mL PDA培养基，待凝固后，再倒5mL含药的PDA培养基制备平板，并以含等量相应溶剂的PDA平板作为对照，在平板中央接种病原菌的菌饼(直径6mm)，将平板置于28℃的恒温培养箱中培养3～8d，以十字交叉法测定菌落直径，计算抑制率。以2mg/mL的终浓度制备橙皮素、原卟啉、3,4-二羟基苯基丙酸、柚皮素、3(3-羟基苯基)丙酸、4',5,7-三羟黄烷酮、原儿茶酸、D-(-)-奎宁酸和尿囊素的含药平板。以1mg/mL的终浓度制备山奈素、迷迭香酸、表儿茶素、圣草酚、染料木苷、(-)-表没食子儿茶素、佛手苷内酯和隐绿原酸的含药平板。

测定17种目标差异代谢物的标准品的抑菌活性，由图9可知，供试标准品对病原真菌均有一定的抑菌活性。在以2mg/mL的浓度筛选的化合物中，对尖孢镰刀菌抑菌活性最强的为柚皮素，其次为原儿茶酸和D-(-)-奎宁酸，对球黑孢抑菌活性最强的为橙皮素，其次为3-(3-羟基苯基)丙酸，对立枯丝核菌抑菌活性最强的为3-(3-羟基苯基)丙酸，其次为3,4-二羟苯基丙酸、4’,5,7-三羟黄烷酮和D-(-)-奎宁酸，对索氏平脐蠕孢抑菌活性最强的为3,4-二羟苯基丙酸，其次为原儿茶酸和D-(-)-奎宁酸(图9A)。在以1mg/mL的浓度筛选的化合物中，对四种供试病原菌抑菌活性最强的均为迷迭香酸，除迷迭香酸外，对尖孢镰刀菌和立枯丝核菌抑菌活性最强的均为佛手苷内酯，对索氏平脐蠕孢抑菌活性最强的为圣草酚(图9B)。

即通过含药平板法，筛选到抑菌作用明显的化合物：柚皮素、原儿茶酸、D-(-)-奎宁酸、橙皮素、3-(3-羟基苯基)丙酸、3,4-二羟苯基丙酸、4’,5,7-三羟黄烷酮、迷迭香酸、佛手苷内酯和圣草酚，对4种病原真菌均有抑菌活性的抑菌化合物有3,4-二羟苯基丙酸、3(3-羟基苯基)丙酸、原儿茶酸、D-(-)-奎宁酸、尿囊素、迷迭香酸和佛手苷内酯。

表2标准品信息表