METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法

摘要

本发明公开METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法。采用公共基因表达数据集数据库，分析肺腺癌及癌旁组织METTL5的表达，Westernblot检测正常肺上皮BEAS‑2B和肺腺癌A549、H1975细胞系中METTL5蛋白表达水平。应用LV3‑METTL5‑shRNA慢病毒感染肺腺癌A549和H1975细胞系以敲低两种细胞系中METTL5基因表达，并通过Transwell

说明书

技术领域

本发明涉及METTL5技术领域，尤其涉及METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法。

背景技术

2021年统计数据显示，肺癌位居全球癌症相关死亡之首，每年因肺癌死亡人数达180万。我国每年肺癌新发及死亡患者分别占全球37％及39.8％。肺癌主要分非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌两种类型，其中非小细胞肺癌占总数的85％左右，肺腺癌又是其中最常见类型。除常规的放疗、化疗以及手术治疗等手段外，近年来随着靶向及免疫治疗的长足发展，使肺腺癌患者生存有了明显改善，但患者五年总生存仍不足20％。因此探究肺癌发病机制，寻找新的治疗靶点，是目前研究的临床科学问题之一。据报道，近来作为研究热点的m6A转录后修饰在肿瘤发生发展中发挥重要作用。本研究探讨了m6A相关修饰酶METTL5在肺腺癌中的可能作用，揭示了METTL5可能通过调控上皮间质转化(EMT)相关分子促进肺腺癌细胞系A549、H1975细胞迁移、侵袭。

m6A RNA甲基化修饰属于表观转录组学范畴，指通过RNA修饰与编辑介导基因转录后水平调控，近年来受到广泛关注。研究发现，m6A修饰在各种RNA中均丰富而保守，表明其广泛调控基因表达。m6A修饰通过对癌基因表达的调节，调控肿瘤的发生与进展。Li等分析TCGA数据库及临床肿瘤组织，研究发现METTL3的高水平与结直肠癌患者较短的总生存期及无进展生存期显著相关。Liu等研究表明以m6A依赖的方式增强EIF3C的翻译，并同时促进整体翻译输出，从而促进卵巢癌的发生和转移。随着研究的深入，m6A修饰在肺腺癌进展中的机制也逐渐被揭示。Yin等发现RMRP(RNA component of mitochondrial RNA-processingendoribonuclease)在NSCLC中高表达，METTL3通过提高RMRP RNA的m6A水平增强其稳定性，通过调节TGFBR1/SMAD2/SMAD3途径使NSCLC进展。目前METTL5在NSCLC中的作用机制尚未见报道。因此，本研究拟通过体外细胞学实验探究METTL5对NSCLC细胞增殖和迁移的影响及作用机制，为NSCLC的治疗提供潜在的有效分子靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法，以解决上述技术问题。

为实现上述目的本发明采用以下技术方案：

METTL5基因对肺腺癌细胞迁移与侵袭影响的实验方法，包括以下步骤：

步骤1、细胞培养、转染及稳转株筛选；

A549细胞及H1975细胞使用RPMI-1640完全培养基培养，当细胞汇合度达到90％左右并处于对数生长期时，消化并重悬A549细胞及H1975细胞接种于6孔板中，分别使用NC及METTL5的干扰慢病毒按说明书进行转染，分为NC及shMETTL5组，72h后通过荧光显微镜观察荧光，重新铺板，加入5ug/ml嘌呤霉素，筛选METTL5敲低的稳转株；

步骤2、临床数据分析

首先在基因表达数据集(GEO)中搜索肺腺癌数据，下载数据集，分析METTL5表达情况，利用GEPIA根据METTL5的表达差异对肺腺癌患者进行生存分析，绘制Kaplan-Meier生存曲线；

步骤3、Western blot法检测；

取经嘌呤霉素筛选后、镜下可见荧光的两组细胞，使用蛋白裂解液2×loadingbuffer裂解细胞提取蛋白，并在95℃条件下金属浴10min使蛋白边变性，吸取8μl样品加入上样孔中，使用140V电泳60min，200mA转膜90min，5％脱脂牛奶进行封闭，1h后TBST清洗PVDF膜3次，将PVDF膜与一抗室温孵育2h，TBST将PVDF膜清洗3次后放于HRP标记的Anti-rabbit IgG二抗1:2000中孵育1h，TBST清洗后使用超敏发光液进行显影；

步骤4、Transwell

检测迁移能力时，将处于对数生长期的NC组、shMETTL5组A549和H1975细胞消化并离心重悬，计数并将细胞浓度调节至1×10

步骤5、统计分析；

采用Graph Pad Prism软件进行统计学分析，免疫印迹实验结果中的平均灰度值比值及Transwell

作为本发明进一步的方案，步骤1中RPMI-1640完全培养基培养，含10％FBS、1％青链霉素双抗，培养箱条件为37℃、5％CO2。

作为本发明进一步的方案，步骤3中一抗为Anti-human METTL5多克隆抗体1:1000、Anti-human GAPDH单克隆抗体1:2000。

作为本发明进一步的方案，步骤4中完全培养基为20％FBS。

作为本发明进一步的方案，步骤4中固定液为4％多聚甲醛溶液。

作为本发明进一步的方案，步骤4中并在下室中加入800ul的1640完全培养基，培养24h，培养条件为：37℃、5％浓度的CO2。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：通过该实验方法发现敲低METTL5能够显著抑制肺腺癌细胞的EMT，从而抑制肺腺癌细胞的迁移、侵袭能力，表明METTL5通过促进肺腺癌细胞EMT进程进而促进肺腺癌进展。METTL5在肺腺癌中高表达，其表达水平与患者预后呈明显负相关，并且METTL5通过促进肺腺癌细胞EMT进程促进肺腺癌迁移、侵袭。METTL5可能在肺腺癌进展中发挥重要作用。因此，靶向METTL5有望成为治疗肺腺癌的潜在靶点。

附图说明

图1生物信息学分析METTL5在肺腺癌组织中的表达及其与患者预后的关系图；

图2 METTL5在肺腺癌患者组织及肺腺癌A549、H1975细胞系中的表达水平图；

图3敲低METTL5对A549和H1975细胞迁移、侵袭能力的影响图；

图4敲低METTL5对各组A549及H1975细胞Vimentin和E-Cadherin表达的影响图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细阐述。

实验材料；

A549和H1975细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。无血清1640培养基(Roswell Park Memorial Institute,RPMI)购自Gibco公司，胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)购自Excell公司，PBS购自索莱宝公司；青链霉素混合液、0.25％胰蛋白酶溶液购自Hyclone公司；一步冻存液购自海星公司；电泳转移缓冲液(转膜液)、SDS-PAGE电泳缓冲液、TBST缓冲液(Tris Buffered Saline with Tween-20,TBST)购自Solarbio公司；4％多聚甲醛固定液、结晶紫染液购自碧云天公司；Matrigel基质胶购自美国Corning公司；Anti-human METTL5多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG购自武汉爱博泰克公司；兔抗人E-Cadherin、Vimentin、GAPDH抗体购自美国CST(Cell Signaling Technology)公司；METTL5的干扰慢病毒购自上海吉玛公司。

本发明实验方法：

1、细胞培养、转染及稳转株筛选；

A549及H1975细胞使用RPMI-1640完全培养基培养(含10％FBS、1％青链霉素双抗)，培养箱条件为37℃、5％CO2。当细胞汇合度达到90％左右并处于对数生长期时，消化并重悬A549及H1975细胞接种于6孔板中，分别使用NC及METTL5的干扰慢病毒按说明书进行转染，分为NC及shMETTL5组，72h后通过荧光显微镜观察荧光。重新铺板，加入5ug/ml嘌呤霉素，筛选METTL5敲低的稳转株。

2、临床数据分析；

首先在基因表达数据集(GEO)中搜索肺腺癌数据，下载数据集，分析METTL5表达情况。利用GEPIA根据METTL5的表达差异对肺腺癌患者进行生存分析，绘制Kaplan-Meier生存曲线。

3、Westernblot法检测；

取经嘌呤霉素筛选后、镜下可见荧光的两组细胞，使用蛋白裂解液2×loadingbuffer裂解细胞提取蛋白，并在95℃条件下金属浴10min使蛋白边变性。吸取8μl样品加入上样孔中，使用140V电泳60min，200mA转膜90min，5％脱脂牛奶进行封闭。1h后TBST清洗PVDF膜3次，将PVDF膜与一抗(Anti-human METTL5多克隆抗体1:1000、Anti-human GAPDH单克隆抗体1:2000)室温孵育2h。TBST将PVDF膜清洗3次后放于HRP标记的Anti-rabbit IgG二抗(1:2000)中孵育1h。TBST清洗后使用超敏发光液进行显影。

4、Transwell

检测迁移能力时，将处于对数生长期的NC组、shMETTL5组A549和H1975细胞消化并离心重悬，计数并将细胞浓度调节至1×10

5、统计分析；

采用Graph Pad Prism软件进行统计学分析。免疫印迹实验结果中的平均灰度值比值及Transwell

如图1所示，数据库显示METTL5在肺腺癌患者组织中高表达且表达高的患者预后差；

通过对提取的TCGA数据库进行表达谱分析，发现METTL5的表达在肺腺癌组织中显著高于正常肺组织，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1A)。通过使用GEPIA2绘制Kaplan-Meier曲线，结果表明，METTL5表达高的患者具有更短的生存期(P<0.05)(图1B)。A：METTL5在肺腺癌组织和正常组织中的表达；B：METTL5表达与肺腺癌患者生存之间的关系。P<0.05。

如图2所示，为研究METTL5在肺腺癌中的表达情况，通过Western blot实验进一步比较METTL5在正常肺上皮BEAS-2B细胞系和肺腺癌细胞系A549及H1975之间的表达差异。结果表明METTL5在肺腺癌细胞系中表达均显著上调，差异有统计学意义(F＝16.53，P<0.05)。(A.正常肺上皮BEAS-2B细胞与肺腺癌A549、H1975细胞中METTL5蛋白表达水平；B.三种细胞系METTL5蛋白相对表达量1.BEAS-2B组；2.A549组；3.H1975组)。

如图3所示，为研究METTL5在肺腺癌细胞中的作用，使用慢病毒敲低A549及H1975细胞METTL5基因(图3A)，并使用Western blot实验检验METTL5沉默效果，发现敲低组METTL5相比对照组表达水平显著下调(F＝28.41，P<0.05)(图3B、C)。为进一步探究METTL5对肺腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响，进行Transwell

如图4所示，研究表明，上皮间质转化与肿瘤的发生发展关系密切，当肿瘤细胞发生EMT时，细胞迁移、侵袭能力显著增强，导致肿瘤发生远处转移。为研究METTL5是否通过促进EMT进程促进肺腺癌细胞迁移、侵袭能力，使用Western blot实验检验METTL5敲低后EMT标记物Vimentin、E-Cadherin变化。我们发现，METTL5敲低后Vimentin明显下调(F＝155.4，P<0.05)，而E-Cadherin明显上调(F＝73.75，P<0.05)。A:各组A549及H1975细胞Vimentin和E-Cadherin蛋白的表达；B:各组细胞Vimentin和E-Cadherin蛋白相对表达量；1.A549组；2.shMETTL5(A549组)；3.H1975组；4.shMETTL5(H1975)组。

敲低METTL5能够显著抑制肺腺癌细胞的EMT，从而抑制肺腺癌细胞的迁移、侵袭能力，表明METTL5通过促进肺腺癌细胞EMT进程进而促进肺腺癌进展。METTL5在肺腺癌中高表达，其表达水平与患者预后呈明显负相关，并且METTL5通过促进肺腺癌细胞EMT进程促进肺腺癌迁移、侵袭。METTL5可能在肺腺癌进展中发挥重要作用。因此，靶向METTL5有望成为治疗肺腺癌的潜在靶点。

以上所述为本发明较佳实施例，对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的教导，在不脱离本发明的原理与精神的情况下，对实施方式所进行的改变、修改、替换和变型仍落入本发明的保护范围之内。