评估宫颈癌的化疗效果或术后疾病进展的系统及其方法

摘要

本发明公开了一种评估宫颈癌的化疗效果或术后疾病进展的系统及其方法，所述系统包括血浆无细胞DNA总浓度、纯度检测模块、分析模块和分类模块；本发明采用血浆无细胞DNA总浓度作为宫颈癌化疗敏感性或术后疾病进展的指标，总结得出一种化疗敏感性和术后疾病进展评估系统，方便临床评价待检宫颈癌患者对铂类新辅助化疗是否敏感、评估患者术后疾病进展情况，对于指导临床个体化用药，改善患者预后具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术和生物检测领域，具体涉及一种评估宫颈癌的化疗效果或术后疾病进展的系统及其方法。

背景技术

宫颈癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤，目前最佳的防控策略是早期筛查和疫苗接种。宫颈癌的治疗以手术和同步放化疗为主，由于放疗会损伤盆腔器官造成远期并发症，诸如损伤卵巢功能导致出现更年期症状影响患者生活质量等，因此近年来关于宫颈癌治疗的研究热点多集中在新辅助化疗、术后化疗等方面。新辅助化疗又称术前化疗，其优势一方面在于可以使局部肿瘤缩小或达到降低肿瘤分期的目的，以利于手术的进行，另一方面可以消除难以检测的微小转移灶，降低术后复发风险。

大量临床数据表明无论是新辅助化疗，还是术后化疗，仅部分患者对化疗药物有反应，然而目前仍然缺乏有效预测宫颈癌化疗效果的生物标志物，现有的影像学及肿瘤标志物作为化疗效果的评估方法也存在一些不可忽视的缺点，如影像学的延迟效应、肿瘤标志物的特异性低、部分患者无明显变化等。研究表明紫杉醇周疗相较于传统的三周疗法能够缩短肿瘤再生长的时间间隔，改善患者的预后，但由于患者间化疗效果的异质性，使得这一结果仍然存在争议性。因此急需开发新的标志物用于预测或者早期评估患者化疗敏感性，进而推动治疗方案的改进，这对患者实施个体化的治疗，改善患者的预后、同时节省医疗资源具有重要意义。

手术是早期宫颈癌患者最重要的治疗手段，但也同时为肿瘤在盆腔的播散种植带来了风险，这也是部分患者在术后出现早期复发死亡的主要原因，评估患者的术后疾病进展情况，对于指导术后辅助治疗至关重要。目前评估宫颈癌患者术后中高危的因素主要是基于术后病理结果，忽视了手术这一有创操作在导致疾病进展中的作用，也缺乏相应的评估指标，因此，挖掘患者术后疾病进展的生物标志物有助于完善术后辅助治疗。

液体活检领域的发展为持续监测肿瘤的特征性改变带来了希望，血浆游离DNA(cell-free DNA，无细胞DNA)是血浆中的游离在细胞外的DNA，在健康状态下，血浆无细胞DNA主要来源于造血系统正常细胞的凋亡，含量较低。在特定的病理或疾病发展过程中，无细胞DNA的组织来源构成会发生改变，反映患者的疾病状态，治疗过程中无细胞DNA浓度升高可能可以反应患者的治疗效果，这有望成为宫颈癌术后疾病进展的评估的新的生物标志物。

发明内容

本发明的目的是针对现有的评估宫颈癌术后疾病进展的标志物缺乏和化疗效果评估方法中的缺陷，提供了一种评估宫颈癌的化疗效果或术后疾病进展的系统及其方法。

为实现上述目的，本发明所设计以下技术方案：

本发明提供了一种评估宫颈癌的化疗效果或术后疾病进展的系统，所述系统包括血浆无细胞DNA的纯度检测模块、血浆无细胞DNA的浓度检测模块、分类模块；其中，

(1)血浆无细胞DNA的纯度检测模块：用于分析血浆的无细胞DNA纯度，提取血浆的无细胞DNA，通过Fragment Analyzer检测血浆中无细胞DNA的纯度；

(2)血浆无细胞DNA的浓度检测模块：用于统计血浆无细胞DNA浓度，对血浆无细胞DNA提取后进行定量分析，统计血浆中无细胞DNA浓度。

(3)分类模块：用于评估患者化疗效果或者是否处于术后疾病进展，分析化疗前后的无细胞DNA浓度比值，评估患者化疗效果；或者，分析手术后的无细胞DNA浓度大小，评估患者是否处于术后疾病进展。

进一步地，所述血浆无细胞DNA的纯度检测模块中，血浆中无细胞DNA质量标准为：

血浆中无细胞DNA在166bp处呈现明显起峰，显示无明显核基因组污染。

进一步地，血浆无细胞DNA的浓度检测模块中，浓度数据为血浆中无细胞DNA浓度，单位为ng/mL。

再进一步地，所述分类模块中，

a.基于治疗前后的无细胞DNA浓度变化评估患者化疗效果：

若化疗后1天血浆无细胞DNA浓度/化疗前血浆无细胞DNA浓度比值＞2时，则认为患者化疗效果差，反之患者化疗效果好；

b.基于术后的无细胞DNA浓度大小评估患者是否处于术后疾病进展：

若术后的血浆无细胞DNA浓度升高，超过30ng/mL，反之则不处于；

本发明还提供了一种利用上述的宫颈癌化疗效果或术后疾病进展的检测系统进行分析检测的方法，包括以下步骤：

1)样本分离及无细胞DNA提取：收集待检测者化疗前后的全血样本，进行血浆分离，然后提取血浆无细胞DNA(即为血浆无细胞DNA)(血浆无细胞DNA提取试剂盒The QIAampccfDNA/RNAKit，货号55184)；

2)样本质检：通过Fragment Analyzer检测血浆无细胞DNA的纯度；

3)血浆无细胞DNA定量：每个无细胞DNA样品取1ul通过Qubit定量检测血浆无细胞DNA的浓度，

4)评估化疗效果或术后疾病进展中的应用分析：

a.基于化疗前后的无细胞DNA浓度比值评估患者化疗效果：

若化疗后1天血浆无细胞DNA浓度/化疗前血浆无细胞DNA浓度比值＞2时，则认为患者化疗效果差，反之患者化疗效果好；

b.基于手术后的无细胞DNA浓度值大小评估患者是否处于术后疾病进展：

若治疗后的血浆无细胞DNA浓度升高，超过30ng/mL时，则认为患者属于复发高危人群，反之则不属于；

进一步地，所述步骤1)中，血浆分离步骤如下：4℃低温离心机内2000g离心10分钟，分离血浆和血细胞，然后将上层血浆进行二次离心处理，4℃低温离心机内3000g离心15分钟。

再进一步地，，所述步骤2)中，Fragment Analyzer检测血浆无细胞DNA在166bp呈现明显起峰，无明显核基因组污染认为样品质量符合要求

本发明还提供了一种上述的系统在评估宫颈癌的化疗效果或术后疾病进展中的应用。

本发明还提供了一种上述的方法在评估宫颈癌的化疗效果或术后疾病进展中的应用。

本发明的生物信息分析方法和系统可对多个样本进行批量分析。

本发明的有益效果：

本发明首次发现血浆无细胞DNA浓度变化与化疗反应密切相关，术后血浆无细胞DNA浓度升高提示术后疾病进展。因此，本发明采用血浆无细胞DNA浓度作为宫颈癌化疗敏感性的评估指标，总结得出一种化疗敏感性评估系统，方便临床评价待检宫颈癌患者对铂类新辅助化疗是否敏感，本发明还提供了一种可以用于评价宫颈癌患者是否处于术后疾病进展的系统和方法，对于指导临床个体化用药及改善术后辅助治疗具有重要意义。

附图说明

图1为宫颈癌患者化疗后一天与化疗前的血浆无细胞DNA浓度比值与化疗效果的关系图；

图中，A为16例宫颈癌患者新辅助化疗效果与血浆无细胞DNA浓度比值及其临床特征的对应关系图；

B为无细胞DNA浓度比值区分化疗效果好和化疗反应差的ROC曲线图；

图2为宫颈癌患者手术前后无细胞DNA浓度变化图；

图中，A为18例宫颈癌患者手术前后无细胞DNA浓度变化柱状图；

B为2例出现不良预后患者的手术前后血浆cfDNA浓度值变化情况与临床结局的关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1

基于血浆无细胞DNA的浓度比值评估宫颈癌的化疗效果或术后疾病进展的系统，它包括血浆无细胞DNA的纯度检测模块、血浆无细胞DNA的浓度检测模块、分类模块；其中，

(1)血浆无细胞DNA的纯度检测模块：用于分析血浆的无细胞DNA纯度，提取血浆的无细胞DNA，通过Fragment Analyzer检测血浆中无细胞DNA的纯度；

(2)血浆无细胞DNA的浓度检测模块：用于统计血浆无细胞DNA浓度，对血浆无细胞DNA提取后进行定量分析，统计血浆中无细胞DNA浓度。

(3)分类模块：用于评估患者化疗效果或者是否处于术后疾病进展，分析化疗前后的无细胞DNA浓度比值，评估患者化疗效果；或者，分析手术后的无细胞DNA浓度大小，评估患者是否处于术后疾病进展。

利用上述的宫颈癌化疗效果或术后疾病进展检测系统进行分析检测的方法，包括以下步骤：

1)样本分离及无细胞DNA提取：收集待检测者化疗前后的全血样本，进行血浆分离，然后提取血浆无细胞DNA(即为血浆无细胞DNA)(血浆无细胞DNA提取试剂盒The QIAampccfDNA/RNA Kit，货号55184)；

2)样本质检：通过Fragment Analyzer检测血浆无细胞DNA的纯度，FragmentAnalyzer检测血浆无细胞DNA在166bp呈现明显起峰，无明显核基因组污染认为样品质量符合要求；

3)血浆无细胞DNA定量：每个无细胞DNA样品取1ul通过Qubit定量检测血浆无细胞DNA的浓度，

4)评估化疗效果或术后疾病进展中的应用分析：

a.基于化疗前后的无细胞DNA浓度比值评估患者化疗效果：

若化疗后1天血浆无细胞DNA浓度/化疗前血浆无细胞DNA浓度比值＞2时，则认为患者化疗效果差，反之患者化疗效果好；

b.基于手术后的无细胞DNA浓度值大小评估患者是否处于术后疾病进展：

若治疗后的血浆无细胞DNA浓度升高，超过30ng/mL时，则认为患者属于复发高危人群，反之则不属于；

实施例2宫颈癌患者外周血血浆无细胞DNA片浓度变化与化疗效果的相关性分析

基于16例进行新辅助化疗的宫颈癌患者治疗前后的外周血血浆，采用本发明的系统和方法进行患者血浆游离DNA样品提取、纯度检测、定量分析，对无细胞DNA浓度变化进行监测。分析治疗过程中无细胞DNA浓度变化与治疗效果之间的关系，发现化疗效果差的人群在治疗后一天无细胞DNA浓度明显升高，而化疗效果好的人群，则大多无明显升高，治疗后一天较治疗前的无细胞DNA浓度比值在化疗效果好的人群和化疗效果差的人群中呈现明显差异(P<0.01)，ROC＝0.9167，提示该系统和方法可以用于早期评估患者化疗效果。具体步骤如下：

步骤1：样本收集和运输。在患者接受治疗前后采集患者的血液样本。使用EDTA的抗凝管采集全血5mL左右，室温下4小时内进行后续离心处理，首先把采集的全血在4℃低温离心机内2000g离心10分钟，分离血浆和血细胞；然后把上层血浆小心地转移到一个新的离心管内，注意不要碰到中间棕黄层(含有白细胞和血小板)，棕黄层和血细胞分别保存于1.5ml的离心管内冻存于-80℃冰箱备用；把上层的血浆进行二次离心，在低温离心机内3000g离心15分钟，离心后小心地把上清转移到另一离心管，储存到-80℃冰箱待用。

步骤2：血浆无细胞DNA提取及定量。利用血浆无细胞DNA提取试剂盒(The QIAampccfDNA/RNA Kit，货号55184)提取血浆无细胞DNA，每个无细胞DNA样品取1ul通过Qubit定量检测血浆无细胞DNA的浓度，计算每个样品的血浆无细胞DNA浓度(ng/mL)。

步骤3：无细胞DNA浓度与化疗效果的相关性分析。

初次化疗后3-5周的影像学肿瘤直径缩小比例大小与治疗过程中的血浆无细胞DNA浓度变化进行联合分析，发现在肿瘤直径缩小35％上下的患者在治疗后血浆无细胞DNA浓度变化上存在差异，将化疗后肿瘤直径缩小35％及以上的认定为化疗效果好，反之化疗效果差，化疗效果好的患者与化疗效果差的患者在治疗后一天的血浆无细胞DNA浓度(无细胞DNA2)较化疗前的血浆无细胞DNA浓度(无细胞DNA1)比值(无细胞DNA2/无细胞DNA1)上存在显著差异(P<0.01)，可以用于区分患者的化疗效果。

如图1所示：化疗后一天血浆cfDNA浓度与化疗前的比值在化疗效果好的患者与化疗效果差的患者中存在显著差异(图1A)；无细胞DNA浓度比值区分化疗效果好和化疗反应差的ROC曲线，AUC＝0.9167(图1B)；新辅助化疗后肿瘤直径缩小35％及以上的宫颈癌患者cfDNA2/cfDNA1分别为0.60、0.73、0.75、1.17、1.17、1.31、1.34、1.57、2.95，肿瘤直径缩小低于35％的宫颈癌患者cfDNA2/cfDNA1分别为1.30、2.93、4.69、8.16、3.80、3.33，两组患者在cfDNA2/cfDNA1比值分布上存在显著差异(P＝0.0044)，无细胞DNA浓度比值区分化疗效果好和化疗反应差的ROC曲线曲线下面积可达0.9167，可以用于区分化疗效果。

实施例3宫颈癌患者术后外周血血浆无细胞DNA片浓度变化与术后疾病进展的临床回顾性研究方案

基于18例宫颈癌手术患者手术前后的外周血血浆，采用本发明的系统和方法进行患者血浆游离DNA样品提取、纯度检测、定量分析，对手术前后的无细胞DNA浓度变化进行监测。分析治疗过程中无细胞DNA浓度变化与患者临床不良结局(复发、转移或死亡)之间的关系，在3例手术后无细胞DNA浓度升高，超过30ng/mL的患者中有2例出现了早期复发和死亡(2/3)，而剩余15例术后无细胞DNA浓度≤30ng/mL的患者均未出现不良结局(0/15)，提示该系统和方法可以用于评估术后疾病进展。具体步骤如下：

步骤1：样本收集和运输。在患者接受治疗前后采集患者的血液样本。使用EDTA的抗凝管采集全血5mL左右，室温下4小时内进行后续离心处理，首先把采集的全血在4℃低温离心机内2000g离心10分钟，分离血浆和血细胞；然后把上层血浆小心地转移到一个新的离心管内，注意不要碰到中间棕黄层(含有白细胞和血小板)，棕黄层和血细胞分别保存于1.5ml的离心管内冻存于-80℃冰箱备用；把上层的血浆进行二次离心，在低温离心机内3000g离心15分钟，离心后小心地把上清转移到另一离心管，储存到-80℃冰箱待用。

步骤2：血浆无细胞DNA提取、纯度检测、定量分析。利用血浆游离核酸提取试剂盒(The QIAamp ccfDNA/RNA Kit，货号55184)提取血浆无细胞DNA，每个无细胞DNA样品取1ul通过Qubit定量检测血浆无细胞DNA的浓度，计算每个样品的血浆无细胞DNA浓度(ng/mL)。

步骤3：术后血浆无细胞DNA浓度与宫颈癌临床结局的相关性分析。

追踪患者的临床结局，在3例手术后无细胞DNA浓度升高，超过30ng/mL的患者中有2例出现了不良预后(2/3)，而剩余15例手术后无细胞DNA浓度≤30ng/mL的患者均未出现复发和死亡(0/15)，提示该系统和方法可以用于评价术后疾病进展。

如图2所示：在3例手术后无细胞DNA浓度升高，超过30ng/mL的患者中有2例出现了不良预后(2/3)，而剩余15例手术后无细胞DNA浓度≤30ng/mL的患者均未出现复发和死亡(0/15)。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。