黄柏酮在制备具有预防或治疗缺血性脑中风功效的药物中的应用

摘要

本发明公开了黄柏酮的一种新用途——在制备具有预防或治疗缺血性脑中风功效的药物中的应用。本发明通过小鼠实验发现，黄柏酮可以明显降低小鼠缺血性中风后死亡率、血脑屏障渗漏和脑组织病理损伤，并促进体功能恢复。因此，黄柏酮具有预防或治疗缺血性脑中风的功效，可以以其为活性成分制备具有预防或治疗缺血性脑中风功效的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及黄柏酮在制备具有预防或治疗缺血性脑中风功效的药物中的应用，属于药物技术领域。

背景技术

中风是一种以脑局部突发缺血或出血而导致的神经损伤和功能缺失为主要临床表现的疾病，其中以缺血性中风为主，幸存者多数存在运动、认知和言语障碍等后遗症。

目前，西医用于治疗脑缺血的药物十分有限，血栓溶解类药物(如tPA)是主要选择，但因有效施用时间窗窄，使用上仍具有很大局限性。此外，亦有血管扩张药(如潘生丁等)、改善微循环、扩充血容量的药物(如低分子右旋糖酐等)和防止血小板凝聚的药(如阿司匹林等)等。而中医则以活血化瘀、通络止痛、补益气血类药物为主，辅以针灸、按摩等疗法。但是，上述药物发挥效力的主要原理是通过防止和溶解血栓来保持脑部血氧供应，鲜有缓解缺血性脑损伤和修复已受损脑区病变的功能。

黄柏酮(Obacunone)是一类柠檬苦素类三萜化合物，具有抗癌、杀虫和降脂等活性。其分子式为C

式Ⅰ：

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了黄柏酮的一种新用途——在预防或治疗缺血性脑中风中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

黄柏酮在制备具有预防或治疗缺血性脑中风功效的药物中的应用。

具体应用时，黄柏酮可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的黄柏酮及可药用载体。“可药用载体”不会破坏本发明的黄柏酮的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。

所述可药用载体选自：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。这些均为常规技术手段，不再赘述。

具体应用时，黄柏酮以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非肠道给药制剂包括注射液等；局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选口服制剂。给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。这些均为常规技术手段，不再赘述。

本发明通过小鼠实验发现，黄柏酮可以明显降低小鼠缺血性中风后死亡率、血脑屏障渗漏和脑组织病理损伤，并促进体功能恢复。因此，黄柏酮具有预防或治疗缺血性脑中风的功效，可以以其为活性成分制备具有预防或治疗缺血性脑中风功效的药物。

附图说明

图1：各组小鼠的生存期示意图，N＝11。

图2：除胶行为学实验的结果示意图，其中，N＝8，One-way ANOVA withsubsequent Bonferonni test，P<0.05。

图3：新事物认知行为学实验的结果示意图，其中，N＝8，One-way ANOVA withsubsequent Bonferonni test，P<0.05。

图4：小鼠脑伊文思蓝染色的结果示意图。

图5：分光光度法检测伊文思蓝的结果示意图，其中，N＝6，One-way ANOVA withsubsequent Bonferonni test，P<0.001。

图6：Lectin+IgG免疫荧光染色的结果示意图。

图7：IgG荧光强度检测结果示意图，其中，N＝6，One-way ANOVA with subsequentBonferonni test，P<0.01。

图8：小鼠脑片TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)染色的结果示意图。

图9：梗死灶体积的结果示意图，其中，N＝6，Unpaired T-test，P<0.01。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。

实验黄柏酮治疗缺血性的研究

1.实验材料

1.1药材

黄柏酮(CAS：751-03-1，分子量454.52，HPLC纯度≥98％，北京索莱宝科技有限公司)。

0.5％羟丙基甲基纤维素溶液(HPMC，高压灭菌，北京酷来搏科技有限公司)做药物溶剂。

1.2实验动物

8～10周龄C57BL/6雄性小鼠109只，由广东药康生物科技有限公司提供，动物合格证号：No.44824700012781。置于SPF级饲养环境，自由进食和饮水。

2.实验方法

2.1脑缺血动物模型的建立

利用线栓暂时性(1小时)堵塞小鼠脑中动脉，造缺血性脑中风模型。

具体来讲，异氟烷气体麻醉小鼠(5％诱导，1.2％～1.5％维持)并仰卧位固定于恒温板上，维持体温在36.5℃。手术前10分钟于颈腹部两侧皮内注射0.25％丁哌卡因镇痛。沿颈腹侧面中线切开皮肤，游离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，将颈外动脉部分开口，插入线栓(size 6～0,coating diameter 0.21±0.02mm,coating length 3～4mm)至颈内动脉，血管开口打结。梗塞60分钟后取出线栓。术后7天每日腹腔注射1mL生理盐水并喂软质食物。

2.2药物干预

实验期间，每天准备新鲜制剂，用0.5％HPMC溶解黄柏酮，并在制备1小时内使用。缺血性中风造模前2天每日灌胃给予200μL黄柏酮溶液(5，25或100mg/kg)，持续3日，每日一次。对照组给予相同体积药物溶剂0.5％HPMC。

2.3实验分组和动物使用

假手术(饲喂药物溶剂)组：

给予0.5％HPMC，不进行造缺血性脑中风的手术。

共29只，存活率统计11只(其中8只再用于行为学实验)，伊文思蓝染色6只，免疫荧光染色6只，TTC染色6只。

中风对照(饲喂药物溶剂)组：

给予0.5％HPMC，进行造缺血性脑中风的手术。

共29只，存活率统计11只(其中8只再用于行为学实验)，伊文思蓝染色6只，免疫荧光染色6只，TTC染色6只。

黄柏酮【低】剂量组：

饲喂黄柏酮5mg/kg，进行造缺血性脑中风的手术。

共11只，用于存活率统计，其中8只再用于行为学实验。

黄柏酮【中】剂量组：

饲喂黄柏酮25mg/kg，进行造缺血性脑中风的手术。

共29只，存活率统计11只(其中8只用于后续行为学)，伊文思蓝染色6只，免疫荧光6只，TTC染色6只。

黄柏酮【高】剂量组：

饲喂黄柏酮100mg/kg，进行造缺血性脑中风的手术。

共11只，用于存活率统计，其中8只再用于行为学实验。

2.4存活率统计

中风造模后0～14天每日统计动物死亡数量，绘制生存曲线。

2.5体功能恢复(行为学)评估

(a)除胶实验

中风脑对侧的前肢足底贴25mm

(b)新事物认知实验

在长方形透明盒(40×30cm)两侧各安放一个相同物体，小鼠放入后自由探索10分钟。之后取出休息5分钟，同时将盒内一个物体换为新事物。之后放入动物再次进行10分钟探索。记录动物每轮每个物体上花费的时间，并计算DI＝(TN trial2/TF trial2)/(TFtrial1/TF trial1)。TN＝time spending on the novel object，TF＝time spending onthe familiar objects。DI值反映动物的认知记忆能力。中风造模前和后14天测试。

2.6血脑屏障完整性评估

(a)伊文思蓝染色

中风造模后第1天尾静脉注射伊文思蓝(2mL/kg)，第二天动物安乐死急性取脑，拍照成像。此后剥离缺血侧脑半球，利用50％三氯乙酸制备脑组织匀浆，分光光度法定量检测组织中伊文思蓝。

(b)脑微血管免疫荧光染色

中风造模后第2天，动物尾静脉注射血管标记染料Lycopersicon EsculentumLectin(0.5mg/mL，200μL)，15分钟后动物深度麻醉，心脏灌流(4％PFA)并取脑。脑沿冠状面冰冻切片(30μm)后贴于载玻板，晾干。之后PBS浸泡冲洗，1％BSA(w/v)室温封闭1小时，加IgG抗体(Alexa Fluor Plus 594)4℃孵育过夜，PBS洗脱多余抗体(5分钟/次×3)，最后用含DAPI的抗荧光淬灭剂封片，用于后续荧光显微观察缺血半影区微血管渗漏。

2.7脑梗死体积评估

中风造模后第2天，小鼠5％异氟烷深度麻醉后断头法处死动物，迅速取脑并置于-80℃冰冻5分钟。利用模具沿大脑冠状面切片(2mm厚度/片×5)，将切片放入2％TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)中37℃避光水浴，每5分钟轻微晃动容器，使充分染色。20分钟后取出脑片用PBS洗涤3分钟，后10％中性甲醛固定过夜。光学显微镜拍照，PRISM测量每片的梗死面积和总面积，每层梗死体积为该层梗死面积和层厚的乘积，各层梗死体积之和为总梗死体积。

2.8统计分析

所有实验数据以平均值±标准误表示，采用SPSS 16.0统计软件对实验数据采用单因素方差分析(One-way ANOVA test)或非配对T检验(Unpaired T-test)，P<0.05为统计学上差异有显著性。

3.结果

3.1黄柏酮提高小鼠缺血性中风后存活率：

结果如图1所示，截止造模后第14天，缺血性中风引起3只小鼠死亡(对照组，N＝11)。每日饲喂5mg/kg黄柏酮不影响死亡率(低剂量组，N＝11)，而饲喂25mg/kg(中剂量组，N＝11)和100mg/kg(高剂量组，N＝11)黄柏酮的死亡只数分别为1和2，表明黄柏酮剂量依赖性提高中风后存活率。

3.2黄柏酮促进小鼠缺血性中风后体功能恢复：

此部分我们通过行为学实验评估饲喂黄柏酮对小鼠中风后体功能恢复的影响。结果如图2、3所示，与溶剂对照组相比，饲喂25mg/kg【中】或100mg/kg【高】黄柏酮可以同时缓解小鼠中风后运动感觉(除胶实验，中剂量

3.3黄柏酮缓解小鼠缺血性中风后血脑屏障损伤：

进一步地，我们选择饲喂【中】剂量黄柏酮，验证其对小鼠中风后血脑屏障损伤和脑梗死体积的影响。结果如图4～7所示，与假手术组相比，缺血性中风引起血脑屏障渗漏(伊文思蓝染色，

3.4黄柏酮减少小鼠缺血性中风后梗死灶体积：

结果如图8、9所示，与溶剂对照组相比，饲喂【中】剂量黄柏酮显著减少缺血灶体积(TTC染色，

4.结论

黄柏酮可以明显降低小鼠缺血性中风后死亡率、血脑屏障渗漏和脑组织病理损伤，并促进体功能恢复。综上得出结论：黄柏酮通过阻止缺血性中风引起的血脑屏障渗漏，缓解缺血性脑损伤，促进预后康复。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。