具有多重功效的血红蛋白类氧载体的制备及其在肿瘤治疗中的应用

摘要

肿瘤组织的快速生长和增殖导致其微环境显著区别于正常组织。研究表明，肿瘤细胞通过分泌大量的生长因子和蛋白水解酶等，作用于周围的正常细胞及其细胞外基质，使其发生各种生理、生化及形态上的变化，最终导致其微环境呈现乏氧、微酸等状态，为肿瘤的发生、发展、侵袭以及转移提供了必要的物质基础。其中，肿瘤的缺氧微环境不仅是造成肿瘤恶化和转移的主要原因，而且还会显著降低化疗、放疗、光动力疗法(PDT)等多种抗肿瘤治疗的效果。因此，研究者们设计开发了多种人工氧载体来改善肿瘤的缺氧微环境。然而，目前报道的这些人工氧载体只是作为化疗、放疔等的辅助手段用于肿瘤治疗，单独使用时并不能发挥明显的抗肿瘤效果，这极大的限制了其在肿瘤治疗中的应用。
　　近年来，随着纳米技术的蓬勃发展，研究者们针对肿瘤徼环境发展出了多种具有靶向性和响应性的智能纳米药物传输系统。这为开发具有抗肿瘤效果的新型人工氧载体提供了思路。
　　基于上述分析，本课题利用纳米技术设计了一系列具有多重功效的血红蛋白类人工氧载体:
　　一、温敏型血红蛋白类氧载体
　　血红蛋白(Hb)是高等生物体内负责运载O2的一类蛋白质，其衍生物被认为是较理想的人工氧载体。然而，游离的血红蛋白极易引发严重的毒副作用，且在无抗氧化剂时容易被氧化而失去载氧能力。因此，近年来研究者们利用各种纳米载体来封装或偶联血红蛋白，以提高其生物活性，减小毒副作用。在本章中，我们将血红蛋白共价偶联到温敏型的葡聚糖基接枝共聚物（Dex-g-PNIPAAm）上，利用PNIPAAm独特的热力学行为，研究了不同状态下血红蛋白的载氧行为。
　　首先通过单电子转移活性自由基聚合(SET-LRP)法制备了三种不同接枝度的Dex-g-PNIPAAm，并在其主链上利用共价键成功引入血红蛋白，制备了一系列血红蛋白类人工氧载体（Hb-Dex-g-PNIPAAm）。动态光散射(DLS)结果证实Hb-Dex-g-PNIPAAm具有显著的温敏性，其低临界溶解温度(LCST)介于33～34℃。而临界胶束浓度(CMC)以及透射电镜(TEM)测试则证明:37℃时，该温敏型血红蛋白氧载体在较低的浓度下就能形成独立的、尺寸均一的球形纳米颗粒。通过紫外-可见分光光谱研究了不同接枝度的Hb-Dex-g-PNIPAAm在25和37℃下的氧结合能力和抗氧化行为，结果显示:相同温度下，Hb-Dex-g-PNIPAAm的氧结合速率和抗氧化能力随PNIPAAm接枝度的增加而增大。特别是在37℃时，接枝度较高的两种Hb-Dex-g-PNIPAAm比纯Hb具有更长的半衰期和更小的自动氧化速率，表明胶束化的Dex-g-PNIPAAm为Hb提供了较好的保护作用，增强了其在空气中的稳定性。
　　二、具有肿瘤靶向性的血红蛋白类氧载体
　　肿瘤细胞表面会异常高表达葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)，以满足其对能量的大量需求。因此，以GLUT-1为靶向受体，设计经糖基化修饰的纳米药物载体，有助于提高药物的利用率，降低其对正常组织的毒副作用。本章制备了一种含糖的具有肿瘤靶向性的血红蛋白氧载体，既能更有效地识别肿瘤细胞，又具有良好的载氧能力;在此基础上，若同时负载抗肿瘤药物，则有望实现集靶向、抑制肿瘤乏氧状态、药物治疗为一体的新型抗肿瘤策略。
　　具体地，首先通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合法合成了含糖聚合物PMAG-b-PMAA，然后利用“巯-烯”点击反应在PMAG-b-PMAA的侧链上成功接枝乙烯基封端的聚己内酯(PCL)，制备了两亲性接枝共聚物PMAG-b-PMAA-g-PCL，并在此基础上共价偶联了血红蛋白，得到了具有肿瘤靶向性的血红蛋白类氧载体Hb-GlycoMs。利用核磁共振氢谱(1H NMR)和红外光谱(FTIR)对各级产物进行了表征，并通过DLS和TEM考察了Hb-GlycoMs的胶束化行为。紫外-可见分光光谱显示Hb-GlycoMs保持了良好的氧结合能力和抗氧化性能。在此基础上，利用浊度法和荧光标记法研究了Hb-GlycoMs对外源凝集素及肿瘤细胞的亲和性，结果显示:Hb-GlycoMs对表面过表达GLUT-1的Hela细胞具有更强的亲和力，能够克服静电排斥作用，内化进入Hela细胞核和细胞质中。
　　三、共负载光敏剂的血红蛋白类氧载体
　　近年来，光动力疗法(PDT)迅速发展，目前已被广泛应用于癌症或其他非恶性增生的治疗。然而，研究表明PDT的光敏作用无法在缺氧的肿瘤组织区域发生;而且随着PDT的进行，O2的消耗量不断增加，将会加重治疗区域的缺氧状态，降低治疗效果。这些都极大的限制了PDT在肿瘤治疗中的应用。本章制备了一种共负载光敏剂的血红蛋白氧载体，既能改善肿瘤部位的乏氧状态，又可补偿PDT过程中消耗的O2，二者协同作用，提高了PDT的治疗效果。
　　通过原子转移自由基聚合(ATRP)法和EDC偶联法制备了血红蛋白偶联的PEG-b-PAA-b-PS胶柬(HbMs)，并利用其疏水内核包载光敏剂ZnPc，得到了共负载光敏剂的血红蛋白类氧载体(ZnPc-loaded HbMs)。利用1H NMR、FTIR凝胶渗透色谱(GPC)等测试方法对各级产物进行了详细表征，并考察了其胶束化行为和载氧能力。在此基础上，本章还研究了ZnPc-loaded HbMs的单线态氧（1O2）产率及其对Hela细胞的光毒性，结果显示:与对照组ZnPc-loadedPEG-b-PAA-b-PS相比，ZnPc-loaded HbMs具有更高的1O2产率，并对Hela细胞表现出更强的细胞光毒性，有利于提高PDT的抗肿瘤效果。

目录

声明

致谢

摘要

第1章 绪论

1．1 肿瘤微环境

1．1．1 恶性肿瘤治疗现状

1．1．2 肿瘤微环境及其基本特征

1．2 基于肿瘤微环境的抗肿瘤策略

1．2．1 肿瘤微环境靶向型纳米药物载体

1．2．2 肿瘤微环境响应型纳米药物载体

1．2．3 改善肿瘤微环境的抗肿瘤策略

1．3 人工氧载体及其在肿瘤治疗中的应用

1．3．1 人工氧载体

1．3．2 人工氧载体在肿瘤治疗中的应用

1．4 课题提出

第2章 温敏型葡聚糖基血红蛋白类氧载体的制备及其载氧能力的研究

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 实验材料与仪器

2．2．2 葡聚糖基血红蛋白氧载体的制备

2．2．3 合成产物的表征

2．2．4 温度响应性胶束化行为的研究

2．2．5 载氧行为的研究

2．3 结果与讨论

2．3．1 Hb-Dex-g-PNIPAAm的合成

2．3．2 合成产物的表征

2．3．3 温度响应性胶束化行为的研究

2．3．4 载氧行为的研究

2．4 本章小结

第3章 具有肿瘤靶向性的血红蛋白类氧载体的制备与表征

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 实验材料与仪器

3．2．2 可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合法制备PMAG-b-PMAA嵌段共聚物

3．2．3 两亲性含糖接枝共聚物PMAG-b-PMAA-g-PCL的合成

3．2．4 两亲性含糖接枝聚合物PMAG-b-PMAA-g-PCL的荧光标记

3．2．5 血红蛋白偶联的PMAG-b-PMAA-g-PCL胶束(Hb-GlycoMs)的制备

3．2．6 两亲性含糖接枝聚合物PMAG-b-PMAA-g-PCL的表征

3．2．7 胶束化行为的研究

3．2．8 载氧行为的研究

3．2．9 胶束Hb-GlycoMs与外源凝集素亲和行为的研究

3．2．10 细胞毒性和亲和性测试

3．3 结果与讨论

3．3．1 两亲性含糖接枝聚合物PMAG-b-PMAA-g-PCL的合成

3．3．2 合成产物的表征

3．3．3 胶束化行为的表征

3．3．5 载氧行为的研究

3．3．6 胶束Hb-GlycoMs与外源凝集素亲和行为的研究

3．3．7 细胞毒性和亲和性测试

3．4 本章小结

第4章 共负载光敏剂的血红蛋白人工氧载体的制备及其在光动力疗法中的应用

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 实验材料与仪器

4．2．2 三嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚丙烯酸-b-聚苯乙烯(PEG-b-PAA-b-PS)的合成

4．2．3 三嵌段共聚物PEG-b-PAA-b-PS的表征

4．2．4 血红蛋白偶联的PEG-b-PAA-b-PS胶束(HbMS)的制备与表征

4．2．5 负载酞菁锌的HbMs胶束(ZnPc-loaded HbMs)的制备及其载药量的测定

4．2．6 胶束化行为的研究

4．2．7 载氧行为的研究

4．2．8 单线态氧(1O2)产率的表征

4．2．9 细胞光毒性的表征

4．3 结果与讨论

4．3．1 三嵌段共聚物PEG-b-PAA-b-PS的合成

4．3．2 合成产物的表征

4．3．3 胶束(PEG-b-PAA-b-PS、HbMs及ZnPc-loaded HbMs)的制备

4．3．4 胶束化行为的研究

4．3．5 载氧行为的研究

4．3．6 单线态氧产率的表征

4．3．7 细胞光毒性的表征

4．4 本章小结

第5章 总结与展望

5．1 全文总结

5．2 展望

参考文献

攻读博士学位期间科研成果