钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用

摘要

本发明提供了钠‑葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。根据本发明研究结果，钠‑葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂可以调控发生肿瘤的肝组织内免疫微环境，能够减少肝脏组织内未成熟树突状细胞的数量，降低其对局部免疫系统的抑制作用，恢复T淋巴细胞对肿瘤的杀伤功能，从而达到抑制肿瘤生长的目的，对肝脏肿瘤具有显著的治疗效果，因此可以用于制备肿瘤免疫治疗药物，或联合肿瘤免疫治疗实现协同增效作用。而且，SGLT2抑制剂安全性佳、给药方便，SGLT2抑制剂的肝组织特异性抗癌价值，在制备肿瘤治疗药物，尤其是制备肿瘤免疫治疗药物上具有极好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

背景技术

正常情况下，人体免疫系统可以识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞，但为了生存和生长，肿瘤细胞能够采用不同策略，使人体的免疫系统受到抑制、不能正常杀伤肿瘤细胞，从而在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸存。肿瘤免疫治疗就是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。肿瘤免疫治疗包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。近几年，肿瘤免疫治疗的好消息不断，已在多种肿瘤如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌和前列腺癌等实体瘤的治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性，多个肿瘤免疫治疗药物已经获批临床应用。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破；相关肿瘤免疫机理的发现者被授予2018年度诺贝尔医学奖。

免疫治疗与其他抗肿瘤药物一样，难以避免耐药的发生。在免疫治疗的临床实践中，只有约20％的患者对免疫治疗产生应答，这其中还有一部分患者会在治疗一段时间后复发，丢失应答。免疫治疗耐药模式依据耐药机制的不同可分为原发性耐药(primaryresistance)、适应性耐药(adaptive immune resistance)及获得性耐药(acquiredresistance)。比如肝脏，作为参与机体代谢的关键器官，也是最常见的癌转移靶器官之一(在肝脏中发生的肿瘤包括原发/转移性肝肿瘤)。带着“免疫特惠器官”的生理属性，肝脏微环境中浸润存在着多种类型的免疫抑制性细胞，而后者可能削弱T细胞的杀伤功能，从而造成免疫检查点抑制剂等新型免疫治疗药物的失效。近期一项研究回顾了转移性黑色素瘤和肺癌患者的免疫检查点抑制剂治疗响应情况，发现相较于发生其他器官转移的患者，肝转移瘤患者对免疫治疗的应答率更低、生存期更短——肝转移瘤可导致系统性免疫耐受，即使在免疫检查点抑制剂治疗压力下也会并发全身多部位的肿瘤超进展。原发/转移性肝肿瘤对化疗、放疗及免疫治疗的应答欠佳，以免疫检查点单抗为代表的新一代免疫治疗药物亦会发生肝脏特异性免疫治疗耐药。

肿瘤免疫治疗临床实践的受挫，让探索新型免疫治疗药物打破肝肿瘤免疫治疗的困局成为一件紧迫的事情。

发明内容

本发明针对现有技术中肿瘤免疫治疗效果不佳的问题，旨在提供钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用，为肿瘤免疫治疗提供新的选择。

本发明的首要目的是提供钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂在制备肿瘤免疫治疗药物或在制备肿瘤免疫疗法增效剂中的应用。

本发明的又一目的是提供钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂联合肿瘤免疫治疗药物制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明的又一目的是提供一种肝肿瘤治疗药物。

本发明通过以下技术方案实现上述发明目的：

本发明发现钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂的肿瘤免疫学作用和机理，首次显示其对肝脏免疫微环境的重塑及在原发/转移性肝肿瘤免疫治疗中的重要价值。SGLT2抑制剂对原发/转移性肝肿瘤的治疗机理不同于其他的降糖药物，其治疗效果比某些免疫治疗药物更优，有望打破原发/转移性肝肿瘤免疫治疗的临床困局。

具体地，本发明发现(1)SGLT2抑制剂对小鼠皮下肿瘤不能产生明显疗效，但可有效抑制原发/转移性肝肿瘤的生长，SGLT2抑制剂的肿瘤治疗效果具有器官特异性，而非泛癌种抑制作用。(2)SGLT2抑制剂对多种原发/转移性肝肿瘤均显示出明显的疗效。(3)SGLT2抑制剂可治疗免疫系统完整的荷瘤小鼠，而对联合免疫缺陷鼠的肝肿瘤无明显疗效；由此，可以确定SGLT2抑制剂通过调控肝脏免疫微环境发挥治疗作用，而不是直接作用于肿瘤细胞。(4)SGLT2抑制剂治疗可有效减少发挥肝内免疫抑制作用的未成熟树突状细胞，从而恢复T淋巴细胞对肿瘤的杀伤功能。

基于SGLT2抑制剂可以调控肝脏免疫微环境，因此，SGLT2抑制剂可以提升肿瘤免疫治疗的效果，可以作为新型肿瘤免疫治疗药物或免疫疗法增效剂使用；同时，SGLT2抑制剂联合肿瘤免疫疗法药物可以显著提升对肝肿瘤的治疗效果，为肿瘤的治疗提供更多的选择。

因此，以下技术方案均应在本发明的保护范围之内：

本发明提供了钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂在制备肿瘤免疫治疗药物或在制备肿瘤免疫疗法增效剂中的应用。

优选地，所述药物是能够重塑组织免疫微环境的药物。

优选地，所述肿瘤免疫疗法包括免疫检查点抑制剂疗法。

本发明还提供了钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂联合肿瘤免疫治疗药物制备治疗肿瘤的药物中的应用。

优选地，所述肿瘤免疫治疗药物包括免疫检查点抑制剂疗法药物。

更优选地，所述免疫检查点抑制剂疗法药物为PD-1抗体。

优选地，所述肿瘤为对免疫治疗会发生免疫治疗耐药的肿瘤。

优选地，所述肿瘤为肝肿瘤，所述肝肿瘤包括原发性肝肿瘤、转移性肝肿瘤。

优选地，所述转移性肝肿瘤包括结肠癌肝转移瘤、乳腺癌肝转移瘤或黑色素瘤肝转移瘤。

本发明还提供了一种肿瘤免疫治疗药物，包含钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂，优选地，还包括肿瘤免疫疗法药物。

更优选地，所述肿瘤免疫疗法药物包括免疫检查点抑制剂疗法药物。

优选地，还包含药学上可接受的辅料。

本发明所述钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂包括但不限于伊格列净、卡格列净。

小鼠模型实验证实，每日口服SGLT2抑制剂可有效治疗原发性/转移性肝肿瘤，而对其他部位的相同肿瘤细胞无治疗效果，表明钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂对原发/转移性肝肿瘤的特异性疗效。

实验数据表明SGLT2抑制剂的免疫生物学基础是通过调控肝脏免疫微环境发挥疗效，而非直接作用于肿瘤细胞。

本发明的技术方案具有以下有益效果：

本发明发现钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂可以调控肝肿瘤的免疫微环境，减少肝内未成熟树突状细胞的数量，降低其对肝内免疫系统的抑制作用，恢复T淋巴细胞对肿瘤的杀伤功能，从而达到抑制肝肿瘤生长的目的，对肝肿瘤具有显著的治疗效果。SGLT2抑制剂安全性佳、给药方便，用于治疗肝肿瘤具有极好的转化前景。

附图说明

图1为实施例1SGLT2抑制剂ASP1941对MC38皮下瘤的治疗效果。

图2为实施例2SGLT2抑制剂ASP1941对原发/转移性肝肿瘤的治疗效果；其中，图2A为SGLT2抑制剂ASP1941对结肠癌MC38肝转移瘤的治疗效果；图2B为SGLT2抑制剂ASP1941对乳腺癌细胞E0771肝转移瘤的治疗效果；图2C为SGLT2抑制剂ASP1941对黑色素瘤细胞B16F10肝转移瘤的治疗效果；图2D为SGLT2抑制剂ASP1941对肝癌细胞Hepa1-6肝脏原位瘤的治疗效果。

图3为实施例3SGLT2抑制剂ASP1941在免疫缺陷小鼠对肝转移瘤的治疗效果。

图4为实施例4光谱流式技术分析结果；其中，图4A为肝脏的分析结果；图4B为外周血分析结果。

图5为实施例5未成熟树突状细胞在体外与活化的CD8T细胞共培养的实验结果。

图6为实施例6SGLT2抑制剂ASP1941与anti-PD-1联合给药后结肠癌MC38肝转移瘤的重量变化情况。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1SGLT2抑制剂对结肠癌细胞(MC38)皮下肿瘤无治疗作用

一、实验方法

野生型C57BL/6小鼠(饲养在中山大学北校区实验动物中心SPF级动物房)每天按1mg/kg剂量灌胃SGLT2抑制剂ASP1941(伊格列净，selleck，货号S8637)或对照溶剂(生理盐水)处理。

给药7天后，向野生型C57BL/6小鼠注射结肠癌MC38细胞(来自于本单位细胞库)，构建野生型小鼠结肠癌MC38细胞皮下注射荷瘤模型，具体过程为：

取对数生长期结肠癌MC38细胞，经0.25％胰蛋白酶消化，离心去上清液，然后用无血清培养液离心洗涤2次，计算细胞数，调整细胞浓度，将细胞悬液于PBS中，细胞浓度为1.0×10

接种肿瘤后继续每天给药SGLT2抑制剂ASP1941或生理盐水，具体给药剂量同肿瘤接种前。从肿瘤接种后第5天开始每2-3天测量肿瘤体积，测肿瘤长径和短径2次，按公式V＝1/2ab

二、实验结果

SGLT2抑制剂ASP1941对结肠癌MC38细胞皮下瘤的治疗作用实验结果如图1所示，可见，随着时间的增长，SGLT2抑制剂ASP1941组小鼠的肿瘤体积与对照组小鼠肿瘤体积无显著性差异。结果表明，SGLT2抑制剂ASP1941对MC38皮下瘤无治疗作用，MC38皮下瘤对SGLT2抑制剂无治疗应答。

实施例2SGLT2抑制剂特异性治疗原发/转移性肝肿瘤

一、SGLT2抑制剂ASP1941对结肠癌MC38肝转移瘤的治疗作用实验

1、实验方法

6～8周龄C57BL/6雌性野生型小鼠每天按1mg/kg剂量灌胃SGLT2抑制剂ASP1941或对照溶剂(生理盐水)处理。

给药7天后，建立野生型小鼠结肠癌MC38细胞脾脏内注射肝转移瘤模型。具体过程为：

在SPF条件下，取上述C57BL/6雌性野生型小鼠，经1％戊巴比妥腹腔注射麻醉后，备皮，取右侧卧位，消毒皮肤。取左侧肋下切口，行一平行于肋弓，长约1cm的切口，轻柔提拉出脾脏。分离脾脏周围组织，暴露整个脾脏和脾门血管。用5-0丝线在脾下极留置一活结，暂不打紧。用带27G针头的1mL注射器吸取结肠癌MC38细胞悬液(1×10

模型建立后继续每天给药SGLT2抑制剂ASP1941或生理盐水，具体给药剂量同模型建立前。每日观察小鼠状态，注意观察小鼠生命体征，荷瘤2周后处死小鼠，开腹取肝称重，比较组间肿瘤生长差异，同时收集外周血及肿瘤组织标本(用于实施例4进行免疫细胞的检测)。

2、实验结果

给药SGLT2抑制剂ASP1941后结肠癌MC38肝转移瘤的重量变化如图2A所示，可见，SGLT2抑制剂ASP1941组与对照组相比，肿瘤质量显著下降。结果表明，SGLT2抑制剂ASP1941对MC38肝转移瘤具有显著的治疗作用，MC38肝转移瘤对SGLT2抑制剂可产生明显的治疗响应。

二、SGLT2抑制剂ASP1941对乳腺癌细胞E0771肝转移瘤的治疗作用实验

1、实验方法

具体实验过程同SGLT2抑制剂ASP1941对结肠癌MC38肝转移瘤的治疗作用实验，区别在于，本实验使用乳腺癌细胞E0771替换结肠癌MC38细胞构建野生型小鼠乳腺癌细胞E0771脾脏内注射肝转移瘤模型。

2、实验结果

给药SGLT2抑制剂ASP1941后乳腺癌细胞E0771肝转移瘤的重量变化如图2B所示，可见，SGLT2抑制剂ASP1941组与对照组相比，肿瘤质量显著下降。结果表明，SGLT2抑制剂ASP1941对乳腺癌细胞E0771肝转移瘤具有显著的治疗作用，乳腺癌细胞E0771肝转移瘤对SGLT2抑制剂可产生明显的治疗响应。

三、SGLT2抑制剂ASP1941对黑色素瘤细胞B16F10肝转移瘤的治疗作用实验

1、实验方法

具体实验过程同SGLT2抑制剂ASP1941对结肠癌MC38肝转移瘤的治疗作用实验，区别在于，本实验使用黑色素瘤细胞B16F10替换结肠癌MC38细胞构建野生型小鼠黑色素瘤细胞B16F10脾脏内注射肝转移瘤模型。

2、实验结果

给药SGLT2抑制剂ASP1941后黑色素瘤细胞B16F10肝转移瘤的重量变化如图2C所示，可见，SGLT2抑制剂ASP1941组与对照组相比，肿瘤质量显著下降。结果表明，SGLT2抑制剂ASP1941对黑色素瘤细胞B16F10肝转移瘤具有显著的治疗作用，黑色素瘤细胞B16F10肝转移瘤对SGLT2抑制剂可产生明显的治疗响应。

四、SGLT2抑制剂ASP1941对肝癌细胞Hepa1-6肝脏原位瘤的治疗作用实验

1、实验方法

6～8周龄C57BL/6雄性野生型小鼠每天按1mg/kg剂量灌胃SGLT2抑制剂ASP1941或对照溶剂(生理盐水)处理。

给药7天后，建立野生型小鼠肝癌细胞Hepa1-6肝脏原位瘤模型。具体过程如下：

在SPF条件下，取上述小鼠，经1％戊巴比妥腹腔注射麻醉后，备皮，取右侧卧位，消毒皮肤。做中线切口以暴露肝脏。使用胰岛素注射器将重悬于基质胶(1：1混合)中的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞缓慢注入肝脏包膜下(1×10

2、实验结果

给药SGLT2抑制剂ASP1941后肝癌细胞Hepa1-6肝脏原位瘤的重量变化如图2D所示，可见，SGLT2抑制剂ASP1941组与对照组相比，肿瘤质量显著下降。结果表明，SGLT2抑制剂ASP1941对肝癌细胞Hepa1-6肝脏原位瘤具有显著的治疗作用，肝癌细胞Hepa1-6肝脏原位瘤对SGLT2抑制剂可产生明显的治疗响应。

实施例3肝内免疫细胞是介导SGLT2抑制剂肿瘤治疗作用的重要因素

一、实验方法

重度免疫缺陷(NOG)小鼠每天按1mg/kg剂量灌胃SGLT2抑制剂ASP1941或对照溶剂(生理盐水)处理。

给药7天后，建立结肠癌MC38细胞脾脏内注射肝转移瘤免疫缺陷模型，具体过程同实施例2。

肿瘤模型建立后继续每天给药SGLT2抑制剂ASP1941或生理盐水，具体给药剂量同肿瘤接种前。荷瘤2周后处死小鼠，取肝脏称重，比较组间肿瘤生长差异。

二、实验结果

给药SGLT2抑制剂ASP1941后在免疫缺陷小鼠中肝转移瘤的重量变化如图3所示，可见，SGLT2抑制剂ASP1941组与对照组肿瘤质量无显著差异，NOG鼠肝转移瘤对SGLT2抑制剂治疗无有效响应。结果表明，SGLT2抑制剂对肝转移瘤的抑制作用依赖于体内免疫细胞。

实施例4SGLT2抑制剂重塑肝内肿瘤免疫微环境

一、实验方法

(1)肝脏免疫细胞的检测

使用光谱流式技术分析实施例2SGLT2抑制剂治疗后结肠癌MC38肝转移瘤模型小鼠肝内免疫细胞的变化。实施例2处死小鼠后取模型小鼠肝脏，用gentleMACS Dissociator(Miltenyi)匀浆为单细胞悬液。消化后细胞过70μm滤网，经35％/55％/75％Percoll密度梯度离心，收集交界面淋巴细胞，PBS洗涤后，用FACS溶液重悬，加入流式抗体(CD45、TCRβ、TCRγδ、F4/80、CD11b、Ly-6C、Ly-6G、NK1.1、CD4、CD8、CD19、CD11c、CD103、CD69、CD44、MHC II)进行标记，最后加入流式细胞计数微球。利用全光谱流式细胞仪(Cytek Aurora)检测肝脏浸润免疫细胞的比例和数量，统计组间的差异。

(2)外周血免疫细胞的检测

使用光谱流式技术分析实施例2SGLT2抑制剂治疗后结肠癌MC38肝转移瘤模型小鼠外周血免疫细胞的变化。实施例2处死小鼠后收集模型小鼠外周血，使用红细胞裂解液裂解红细胞，离心外周血免疫细胞，PBS洗涤后，用FACS溶液重悬，加入流式抗体(CD45、TCRβ、TCRγδ、F4/80、CD11b、Ly-6C、Ly-6G、NK1.1、CD4、CD8、CD19、CD11c、CD103、CD69、CD44、MHCII)进行标记，最后加入流式细胞计数微球。利用全光谱流式细胞仪(Cytek Aurora)检测肝脏浸润免疫细胞的比例和数量，统计组间的差异。

二、实验结果

实验结果如图4所示，可见，SGLT2抑制剂组肝内CD11C

实施例5肝内未成熟树突状细胞发挥免疫抑制功能

一、实验方法

流式分选纯化实施例2构建的结肠癌MC38肝转移瘤模型小鼠肝内未成熟树突状细胞，在体外与活化的CD8 T细胞共培养后检测CD8 T细胞的增殖情况。

具体如下：取结肠癌MC38肝转移瘤模型小鼠，提取肝脏浸润免疫细胞，使用流式细胞仪分选纯化CD11C

二、实验结果

实验结果如图5所示，可见，未成熟树突状细胞可有效抑制CD8T细胞的增殖，显示出免疫抑制功能。

实施例6SGLT2抑制剂增强转移性肝肿瘤对免疫检查点阻断剂的治疗应答

一、SGLT2抑制剂ASP1941联合免疫检查点阻断剂anti-PD-1对MC38肝转移瘤的治疗作用实验

1、实验方法

6～8周龄C57BL/6雌性野生型小鼠每天按1mg/kg剂量灌胃SGLT2抑制剂ASP1941或对照溶剂(生理盐水)处理,连续给药21天。

给药7天后，建立野生型小鼠结肠癌MC38细胞脾脏内注射肝转移瘤模型。具体过程同实施例2。模型建立后继续给药SGLT2抑制剂ASP1941或生理盐水，具体剂量同模型建立前。荷瘤6天后皮下注射250μg anti-PD-1阻断性抗体(BioXCell，BP0146)，每3天注射一针，连续注射3针。荷瘤2周后处死小鼠，比较组间肿瘤生长差异。

2、实验结果

联合给药(SGLT2抑制剂ASP1941+anti-PD-1)后结肠癌MC38肝转移瘤的重量变化如图6所示，可见，anti-PD-1单药治疗组与对照组相比，肿瘤质量无明显改变。肝转移瘤小鼠出现免疫治疗抵抗。值得注意的是，联合给药(SGLT2抑制剂ASP1941+anti-PD-1)组与对照组相比，肿瘤质量明显降低。结果表明，SGLT2抑制剂ASP1941联合免疫检查点阻断剂anti-PD-1对MC38肝转移瘤具有显著的治疗作用，并且SGLT2抑制剂可有效增强转移性肝肿瘤对免疫检查点阻断剂的治疗应答。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。