一种大柴胡汤联合索拉非尼在制备抗肝癌药物中的应用

摘要

本发明公开了一种大柴胡汤联合索拉非尼在制备抗肝癌药物中的应用，请求保护大柴胡汤联合索拉非尼在制备抗肝癌药物中的应用以及一种由大柴胡汤和索拉非尼组成的治疗肝癌的药物组合物。本发明发现，大柴胡汤与索拉非尼二者联合可发挥协同抗肝癌的作用，因而大柴胡汤联合索拉非尼具备开发成抗肝癌药物的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及联合用药，具体涉及一种大柴胡汤联合索拉非尼在制备抗肝癌药物中的应用。

背景技术

肝癌是目前世界上发病率及致死率均较高的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织/国际癌症研究机构统计报告，2020年全球肝癌新发病人数为91万人，位居第6位；因肝癌死亡病人数为83万人，位居第3位。另据统计，1990年至2015年间，全球肝癌的发病率提高了75％。目前，肝癌有效治疗药物十分匮乏。

索拉非尼是美国FDA推荐的用于肝癌的分子靶向一线治疗药物，主要用于中晚期肝癌患者的治疗。但是索拉非尼也只能延长患者3个月左右的总生存期，ORR只有2％-3％，仍有较大提升空间。随后上市的靶向药物如仑伐替尼、瑞戈非尼等也并没有带来显著的生存期改善获益。更有效、更可及的新型高效的抗肝癌药物和组合治疗方案开发显得迫在眉睫。

大柴胡汤出自张仲景《伤寒杂病论》，由柴胡、黄芩、芍药、半夏、枳实、大黄、大枣、生姜组成，为表里双解剂，有和解少阳、内泻热结之功效。现代药理学表明，大柴胡汤具有利胆保肝、调脂、降压、增强胃肠动力、调节免疫、抗炎、抗过敏、抗内毒素、抑菌等作用。临床常用于治疗胰腺炎、胆囊炎、糖尿病、高脂血症、非酒精性脂肪肝等疾病。中医理论认为，肝癌主要因肝郁气滞，久而化火生毒致淤，气淤毒互结而成。大柴胡汤为仲景群方中开郁泻火第一方，可使肝胆舒、表里和、淤滞散、腑气通、邪气去，谨守肝热血淤之病机。

目前国内外尚无研究表明大柴胡汤和索拉非尼具有协同抗肝癌活性，亦无将大柴胡汤与索拉非尼联合用药的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种大柴胡汤联合索拉非尼在制备抗肝癌药物中的应用。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

一种大柴胡汤联合索拉非尼在制备抗肝癌药物中的应用。

一种治疗肝癌的药物组合物，由大柴胡汤和索拉非尼组成。

上述药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用，所述药物以所述药物组合物为抗肝癌的活性成分，还含有药学上可以接受的载体或辅料，制成药学上可以接受的剂型。

进一步地，所述载体或辅料为固体、液体或半固体。

进一步地，所述剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、丸剂、透皮微针制剂、口服液和注射剂。

有益效果：

本发明发现，大柴胡汤与索拉非尼二者联合可发挥协同抗肝癌的作用，因而大柴胡汤联合索拉非尼具备开发成抗肝癌药物的应用前景。

附图说明

图1为肿瘤体积统计图(Control代表对照组；DCHD代表大柴胡汤给药组；Sor代表索拉非尼给药组；DCHD+Sor代表大柴胡汤和索拉非尼联合给药组)；

图2为肿瘤组织免疫组化Ki67图(Control代表对照组；DCHD代表大柴胡汤给药组；Sor代表索拉非尼给药组；DCHD+Sor代表大柴胡汤和索拉非尼联合给药组)。

具体实施方式

下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、实验材料

1、细胞株与实验动物

肝癌HepG2细胞株购自北京中国医学科学院基础医学研究所。

20只SPF级雄性BALB/c裸鼠，5周龄，体重18～22g，购自杭州子源实验动物科技有限公司(许可证号：SCXK(浙)2019-0004)。

2、试剂与耗材

试剂：青霉素-链霉素(Hyclone，美国)；0.5％胰酶-EDTA溶液(博士德，武汉博士德生物工程有限公司)；PBS溶液(Hyclone，美国)；FBS(Gibco，美国)；DMEM培养基(Gibco，美国)；Cremophor EL(蓖麻油聚氧乙烯，MCE，美国)；95％乙醇(安特，安徽安特食品股份有限公司)。

药物：索拉非尼(CAS：284461-73-0)购买于美国LC Laboratories，纯度≧99％。

饮片：柴胡(Bupleurum abchasicum Manden.)、黄芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)、大黄(Rheum officinale Baill.)、枳实(Citrus aurantium L.)、半夏(Pinelliaternata(Thunb.)Breit.)、白芍(Paeonia lactiflora Pall.)、大枣(ZiziphusjujubaMill.)购于北京同仁堂药房，七味药材饮片均经中国药科大学中药学院封亮教授鉴定。生姜(Zingiber officinale Rosc.)另购(市购生姜新鲜干燥根茎)。

耗材：细胞培养皿(SORFA，中国)；离心管(JETBIOFIL，中国)；细胞计数板(Countstar，中国)。

3、药物配制

3.1索拉非尼样品及空白溶媒制备

索拉非尼储备液(4X)：索拉非尼溶解在Cremophor EL-95％乙醇(50:50,v/v)中，于4℃避光保存。该索拉非尼储备液每3天新鲜配制一次。

索拉非尼稀释液(1X)：用双蒸水将上述索拉非尼储备液(4X)稀释4倍，制得索拉非尼稀释液(1X)，该稀释液溶剂比例为Cremophor EL-95％乙醇-水(12.5:12.5:75,v/v/v)。该索拉非尼稀释液(1X)现用现配。

空白溶媒：配制Cremophor EL/95％乙醇(50:50,v/v)，于4℃避光保存。用双蒸水将上述溶剂稀释至Cremophor EL-95％乙醇-水(12.5:12.5:75,v/v/v)作为空白溶媒。该空白溶媒现用现配。

3.2大柴胡汤样品制备

柴胡24g，黄芩9g，白芍9g，清半夏12g，枳实9g，大黄6g(后下)，生姜15g，大枣4枚；煎药前先将除大黄外的其余生药在6倍水中浸泡2h，然后煎2次，头煎90min，次煎60min，纱布趁热过滤，将两次所得的中药液混合，-80℃真空冻干成粉末。粉末用双蒸水复溶至1g/mL(按药材质量记)。

二、实验方法

1、HepG2细胞培养

HepG2细胞培养于含10％FBS和1％青霉素-链霉素和89％DMEM高糖培养基中。

细胞复苏：取冻存于液氮中的HepG2细胞至37℃恒温水浴锅，摇晃使其快速升温融化，迅速转移至含有10mL培养基的离心管中，1000rpm离心5min。弃上清，加入2mL培养基重悬细胞，转移至含有8mL培养基的100mm培养皿中，摇匀后置于37℃、5％CO

细胞传代：当细胞融合率为80％-90％时，弃培养基，PBS洗涤两次，加入1mL0.25％胰蛋白酶溶液(含EDTA)，37℃条件下消化1min。当细胞呈现沙粒状滑落时迅速加入2mL完全培养基终止消化，并轻柔吹打，收集细胞悬液至15mL离心管，1000rpm离心5min，弃上清，加入2mL培养基重悬细胞，转移至含有8mL培养基的100mm培养皿中，摇匀后置于37℃、5％CO

2、动物实验

2.1动物检疫与常规饲养：动物实验按照中国药科大学实验动物管理委员会标准操作规程进行设计和实施(动物使用许可证号：SYXK(苏)2021-0011)。BALB/c裸鼠饲养在屏障环境IVC系统，换气次数17次/小时。动物房环境温度24±2℃，相对湿度50～60％，12h/12h昼夜循环。动物自由饮水与进食，饮水为灭菌自来水，饲料为钴60辐照灭菌饲料，垫料为灭菌玉米芯垫料。

2.2造模：选取状态良好、处于对数生长期的HepG2细胞，消化、离心，用4℃预冷DMEM基础培养基调整细胞浓度为1×10

2.3分组及给药

待荷瘤鼠平均肿瘤体积约100mm

第22天处死荷瘤鼠，剥离瘤块，4％多聚甲醛固定后进行免疫组化检测。

根据肿瘤体积(TV)计算相对肿瘤体积(RTV)，并计算肿瘤生长抑制率(TGI)来评价药物的抗肿瘤活性，计算公式如下所示：

RTV＝V

TGI＝1-(RTV

2.4免疫组化实验

肿瘤组织样本固定后，依次进行石蜡包埋，脱蜡，再水化，清洗并浸入pH＝6.0浓度为10mM的柠檬酸钠缓沖液中。在含有3％过氧化氢的甲醇处理后，进行一抗(Ki67)和二抗孵育，于荧光倒置显微镜下拍照统计。

Ki67阳性率(％)计算方法：依据全国免疫组织化学技术与诊断标准化专题研讨会研讨结果，高倍镜下观察肿瘤边缘区域连续10个视野(细胞数＞1000)，分别以25％、50％和75％三个梯度进行打分，计算Ki67阳性染色的肿瘤细胞所占比例。

2.5药物协同作用评价指标

药物协同作用评价方法采用本领域公认的金正均Q值法(金正均.合并用药中的相加[J].中国药理学报,1980)。即Q＝M

3、统计学分析

利用GraphPad Prism(GraphPad Software，USA)进行统计学分析，数据表示为Mean±SEM,采用One-wayANOVA统计显著性差异，P＜0.05，认为差异具有统计学意义。

三、实验结果

各实验组肿瘤体积统计结果见图1，肿瘤生长抑制率统计结果见表1，肿瘤组织Ki67免疫组化结果见图2。

表1肿瘤生长抑制率

从图1-2和表1可见：在裸鼠成瘤实验中，与单独使用索拉非尼组或单独使用大柴胡汤组比较，联合使用索拉非尼和大柴胡汤能显著的降低肿瘤体积，二者具有协同抑制肿瘤增殖的作用。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。