一种Turner型X连锁综合征性智力低下的致病基因、引物对及其应用

摘要

本发明涉及基因诊断技术领域，特别涉及一种Turner型X连锁综合征性智力低下的致病基因、引物对及其应用。本发明提供了一种Turner型X连锁综合征性智力低下的致病基因，该致病基因在登录号为NM_031407.7的基因的67号外显子的第9994位存在GT突变。该致病基因可以用于Turner型X连锁综合征性智力低下人群的筛查和诊断，可以特异性区分Turner型X连锁综合征性智力低下患者和正常人群；为Turner型X连锁综合征性智力低下的发病机制研究提供新的基础和途径，为Turner型X连锁综合征性智力低下的治疗提供新的理论依据，可以为治疗Turner型X连锁综合征性智力低下提供可能的药物靶点。

说明书

技术领域

本发明涉及基因诊断技术领域，特别是涉及一种Turner型X连锁综合征性智力低下的致病基因、引物对及其应用。

背景技术

X染色体连锁智力障碍(X-1inked intellectual disability，XLID)是一类位于X染色体上的基因发生突变引起的先天性智力障碍，所涉及的先天性智力障碍约占所有先天性智力障碍的15％。依据除了智力障碍外是否有其他生理方面的缺陷，XLID分为两类：S-XLID(syndromic forms)和NS-XLID(non-syndromic forms)，S-XLID表现在除了智力障碍外，还在新陈代谢方面，神经特征或者其他的体征，如骨骼，颅面部上有异常或者缺陷。

根据美国智力障碍协会(AmericanAssociation on Mental Retardation)对智力障碍(mental retardation，MR)的定义，先天性智力障碍主要是由中枢神经系统发育异常引起的并可能伴有代谢紊乱等症状的复杂性疾病，患者通常在18岁以前表现出智力和行为等方面的明显缺陷。据统计，智力障碍患者占总人口的1％～3％，男女比例为(1.4:1)～(1.6:1)。迄今为止，研究发现，102个基因的功能缺失可导致81种S-XLID综合征和50多个家系的NS-XLID，另有30种S-XLID综合征和48个携带有NS-XLID的家系与X染色体的特定区域相关。引起先天性智力障碍的因素包括基因拷贝数发生变化、核苷酸小片段的缺失或插入、调控元件功能异常、表观遗传改变等，10％～15％智力障碍与X染色体连锁有关。

Turner型X连锁综合征性智力低下是X连锁智力障碍的一种。Turner型X连锁综合征性智力低下(MIM 309590)，或称Turner型X连锁综合征性精神发育迟缓(Turner-type X-linked syndromic intellectual developmental disorder，MRXST)，又称Juberg-marsidi综合征，是一种小头综合征和X连锁智障Turner型，该病是一种临床表型高度可变的神经发育障碍，一些患者呈现X连锁隐性遗传，女性携带者不受影响，在另一些家系中，男性受到严重影响，女性突变携带者表现较温和的认知异常或畸形特征。此外，尽管存在X染色体选择性失活，仍有由于具有新发突变的女性患者表现出完全的表型。受累个体从婴儿期开始就表现出整体发育迟缓，智力发育各不相同，言语能力差或缺失，常伴有行走迟缓。畸形特征很常见，可包括头大、小头、眼深、斜视、小睑裂、发育不良、大耳或低耳、长脸、双颞部变窄、高弓腰、上唇薄、脊柱侧凸或轻度远端骨骼异常，如短肢或锥形手指。其他特征，如张力减退、癫痫发作和骨龄延迟，则更加因人而异。基因定位和克隆表明该病相关的一个重要基因是HUWE1。

HUWE1基因(MIM 300697)长154.6kb，定位于染色体Xp11.22，包括84个外显子和83个内含子，其能够编码获得4374个氨基酸的HUWE1蛋白。HUWE1蛋白是E3泛素化连接酶，具有HECT、UBA和WWE三种功能域，其功能异常可引起抑癌因子P53泛素化异常，进而引起神经细胞命运调控的失调和神经系统发育异常，并影响眼睛、骨骼和前列腺等器官，造成严重智力残疾并延迟骨骼成熟。

因此，基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊Turner型X连锁综合征性智力低下的重要遗传学标准。但目前并没有能特异性区分Turner型X连锁综合征性智力低下的突变患者、携带者和正常人群的诊断试剂的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种Turner型X连锁综合征性智力低下的致病基因、引物对及其应用。本发明所述的致病基因可以用于Turner型X连锁综合征性智力低下人群的筛查和诊断，可以特异性区分Turner型X连锁综合征性智力低下患者和正常人群。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种Turner型X连锁综合征性智力低下的致病基因，所述致病基因在登录号为NM_031407.7的基因的67号外显子的第9994位存在G>T突变。

本发明提供了用于上述的致病基因的引物对，所述引物对包括HUWE1-F和HUWE1-R；

所述HUWE1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述HUWE1-R的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明提供了上述的致病基因作为靶标基因在制备诊断Turner型X连锁综合征性智力低下的试剂中的应用。

本发明提供了一种诊断Turner型X连锁综合征性智力低下的试剂，所述试剂包括上述的引物对。

优选的，所述试剂还包括测序引物对；所述测序引物对包括HUWE1-SeqF和HUWE1-SeqR；

所述HUWE1-SeqF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述HUWE1-SeqR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了上述的致病基因作为靶标基因或上述的试剂在制备诊断Turner型X连锁综合征性智力低下的试剂盒中的应用。

本发明提供了一种诊断Turner型X连锁综合征性智力低下的试剂盒，所述试剂盒包括上述的试剂。

优选的，所述试剂盒还包括阳性突变参考品DNA；所述阳性突变参考品DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供了一种鉴定HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994位点的基因型的方法，包括以下步骤：

以待测样品DNA为模板，利用上述的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；

将扩增产物进行测序，确定HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994位点的基因型。

优选的，所述待测样本包括血液。

有益效果：

本发明提供了一种Turner型X连锁综合征性智力低下的致病基因，在登录号为NM_031407.7的基因的67号外显子的第9994位存在G>T突变形成致病基因。本发明首先利用外显子测序本发明通过外显子组测序技术筛选与Turner型X连锁综合征性智力低下高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，之后通过Sanger测序进行验证，最终获得Turner型X连锁综合征性智力低下的致病基因突变位点具体为：HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F，并发现了HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点突变可以导致Turner型X连锁综合征性智力低下发病。因此，通过检测受试者是否携带有上述致病基因，用于筛查或诊断Turner型X连锁综合征性智力低下的遗传学诊断，以指导治疗。本发明为Turner型X连锁综合征性智力低下的发病机制研究奠定了重要基础，为Turner型X连锁综合征性智力低下患者的治疗提供全新的理论依据；本发明可以为治疗Turner型X连锁综合征性智力低下提供可能的药物靶点。同时本发明提供的致病基因能够用于Turner型X连锁综合征性智力低下的遗传学诊断和优生优育指导。

而且，本发明所提供的试剂和诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断患者是否为Turner型X连锁综合征性智力低下。

附图说明

图1显示Turner型X连锁综合征性智力低下1号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者；

图2显示利用Sanger测序检测HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点基因型的结果图，1号家系中先证者为患者(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图3显示Turner型X连锁综合征性智力低下2号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者；

图4显示利用试剂盒检测HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点基因型的结果图，2号家系中先证者及先证者哥哥为患者(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

具体实施方式

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。

文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。

在本发明中，术语“半合子突变”是指突变存在性染色体中，由于男性只有一条X染色体，基因为单价，没有相应的等位基因，这种突变则称为“半合子突变”。

在本发明中，术语“杂合突变”是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中。在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增HUWE1基因是指，在PCR反应中引物只扩增HUWE1基因，而不扩增其他基因。

本发明提供了一种Turner型X连锁综合征性智力低下的致病基因，在登录号为NM_031407.7的基因的67号外显子的第9994位存在G>T突变形成致病基因。本发明当在登录号为HUWE1:NM_031407.7的基因的67号外显子的第9994位碱基由G突变为T，则会导致第3332为氨基酸由缬氨酸变为苯丙氨酸。

本发明所述c.9994G>T突变指野生型HUWE1基因的第9994位碱基G突变为T，形成HUWE1基因突变体，所述HUWE1基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.34(具体为：CTGTTTTCTGC)所示。本发明所述HUWE1突变体蛋白与野生型HUWE1基因编码的蛋白相比，第3332位氨基酸由缬氨酸(V)突变为苯丙氨酸(F)，即所述HUWE1突变体蛋白含有p.V3332F的突变，所述突变是由于c.9994G>T的错义突变引起的；所述HUWE1突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.35(具体为：APVFCRH)所示。

通过检测受试者是否携带有上述致病基因，可以诊断试受者是否为患者，因此，可以用于筛查或诊断Turner型X连锁综合征性智力低下的遗传学诊断。

本发明还提供了用于扩增上述的致病基因的引物对，所述引物对包括HUWE1-F和HUWE1-R；所述HUWE1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述HUWE1-R的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。本发明提供的引物对特异性好，PCR扩增时不会产生非特异性产物；引物内部及引物之间没有出现3个及以上的连续互补碱基，避免引物二聚体的形成；引物G+C含量适中，不妨碍PCR的扩增效果，并使得扩增效果最佳；引物长度合适，能满足PCR引物的特异“抓取”DNA模板，同时使得退火温度(Tm)适中，引物长度一般与Tm成正比，过长过短的引物都会造成Tm值过大或过小。

本发明提供的致病基因可以特异性区分Turner型X连锁综合征性智力低下患者和正常人群。因此本发明所述的致病基因能够用于制备诊断Turner型X连锁综合征性智力低下的试剂或试剂盒。

本发明还提供了上述致病基因作为靶标基因在制备诊断Turner型X连锁综合征性智力低下的试剂中的应用。利用本发明所述试剂能够准确诊断出患者是否为Turner型X连锁综合征性智力低下患者。

本发明还提供了一种诊断Turner型X连锁综合征性智力低下的试剂，所述试剂包括用于扩增上述的致病基因的引物对。本发明在上述已经对该引物对已经进行了详细的描述，因此在此处不做任何赘述。

本发明还提供了一种诊断Turner型X连锁综合征性智力低下的试剂盒，所述试剂盒包括上述的试剂和测序引物对。本发明所述试剂在前文已经进行了详细的描述，因此在此处不做任何赘述。在本发明中，所述试剂盒优选还包括阳性突变参考品DNA；所述阳性突变参考品DNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了一种鉴定HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994位点的基因型的方法，包括以下步骤：

以待测样品DNA为模板，利用上述的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；

将扩增产物进行测序，确定所述致病基因的基因型。

在本发明中，所述PCR扩增的反应程序优选包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃反应7min。

在本发明中，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括10×PCR缓冲液2μL、10mmol/LdNTPs 0.4μL、100ng/μL HUWE1-F0.5μL、100ng/μL HUWE1-R0.5μL、模板1μL、5u/μLTaq酶0.2μL和余量的ddH

在本发明中，所述样本优选包括血液。本发明对所述血液没有特别要求，优选包括新鲜血液、陈旧血液、血斑或血痕迹等，即只要含有DNA的血液都可以。

在本发明中，当所述样品来源于男性时，HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994位点的基因型具体为“c.9994G>T半合子”和“c.9994G半合子”两种；当HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994位点的基因型为“c.9994G>T半合子”，则判断HUWE1基因存在突变，男性个体为患者；当HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994位点的基因型为“c.9994G半合子”，则判断HUWE1基因不存在突变，男性个体为正常人；

当所述样品来源于女性时，HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994位点的基因型有“c.9994T/T纯合子”、“c.9994G>T杂合子”和“c.9994G/G纯合子”三种情况；当HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994位点的基因型为“c.9994T/T纯合子”，则判断HUWE1基因存在纯合突变，女性个体为患者；当HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994位点的基因型为“c.9994G>T杂合子”，则判断HUWE1基因存在杂合突变，女性个体为携带者；当HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994位点的基因型为“c.9994G/G纯合子”，则判断HUWE1基因不存在突变，女性个体为正常。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种Turner型X连锁综合征性智力低下的致病基因、引物对及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

样本获取

发明人发现了一个Turner型X连锁综合征性智力低下家系(简称1号家系)，该1号家系部分成员的临床信息见表1。图1显示了HUWE1家系图谱，其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者。

1.诊断标准：

可参照《人类单基因遗传疾病》2010版和《儿童智力障碍或全面发育迟缓病因诊断策略专家共识》2018版：

临床特征：发育迟缓，智力发育各不相同，言语能力差或缺失，常伴有行走迟缓；畸形特征可包括头大、小头、眼深、斜视、小睑裂、发育不良、大耳或低耳、长脸、双颞部变窄、高弓腰、上唇薄、脊柱侧凸或轻度远端骨骼异常，如短肢或锥形手指；男性往往有隐睾症；其他特征，如张力减退、癫痫发作和骨龄延迟等。

表1 Turner型X连锁综合征性智力低下1号家系成员的临床信息

1号家系谱图如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

1号家系人员Ⅰ:1(父亲)、Ⅰ:2(母亲)、Ⅱ:2(先证者)外周血DNA用于测序分析。

外显子测序

2.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备一览表

3.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)和EB染液(Amresco)。

4.试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

用ddH

0.5×TBE电泳液工作液，用ddH

10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

5.实验步骤

签署知情同意书后，采集家系中Ⅰ:1(父亲)、Ⅰ:2(母亲)、Ⅱ:2(先证者)等成员的外周血3～5mL。

5.1样本DNA提取

1)对于肝素抗凝外周血样本，则将外周血3～5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。

2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，添加与离心管中上清液等体积的酚和氯仿的混合液(酚：氯仿＝1:1(v/v))混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

5.2外显子测序

参考人类全外显子测序试剂盒(Agilent)说明书和分子克隆实验室手册(第三版；Molecular CloningALABORATORYMANUAL 1SECOND EDITION；NewYork：Cold Spring HarborLaboratoryPress，2014)操作指南。

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150～250bp片段；2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

5.3结果

最终得到1个具有致病意义的基因突变HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F；第9994位碱基由G突变为T，导致第3332为氨基酸由缬氨酸变为苯丙氨酸。在1号家系2名男性患者(先证者及先证者哥哥)HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点的基因型是“c.9994G>T半合子”突变；在1号家系1名女性携带者个体中HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点的基因型是“c.9994G>T杂合子”突变；在1号家系中1名男性正常个体中基因型是无突变的野生型。

实施例2

Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点进行验证。分别对实施例1中的1号中Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ2等4名家系人员和100名家系外正常人进行HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1的方法提基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。

2.2针对c.9994G>T位点分别设计15对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况

表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

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注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：

①引物长度为15～30nt，常用为20nt左右；

②G+C含量以40～60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；

③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；

④引物内部不应出现互补序列；

⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；

⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。

表7引物检测PCR反应体系

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反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5min；

第二步：30个循环(95℃，30sec→Tm，30sec→72℃，60sec)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。

第三步：72℃，7min；

第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的EB水溶液中染色10～15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中1号)作为突变家系检测用引物。

针对HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点的引物序列如下所示：

5’-TGAAACACCCAAACTCACTAC-3’(SEQ ID NO.1)；

5’-CAATACAGGGCTCAACACTT-3’(SEQ ID NO.2)。

3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8突变位点PCR反应体系

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5分钟；

第二步：30个循环(95℃，30秒→53℃，30秒→72℃，60秒)；

第三步：72℃，7分钟；

第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

测序PCR循环条件：

第一步：96℃，1分钟；

第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；

第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(pH5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；

3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；

4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物，引物序列如下所示：

5’-GGGCGTAAACATACCGAGAA-3’(SEQ ID NO.3)；

5’-GCTGCCACCCTTCTTCCA-3’(SEQ ID NO.4)。

9、结果分析

图2的Sanger测序结果显示，1号家系1名男性患者HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点基因型是“c.9994G>T半合子”。图2测序图中箭头所指位置显示A层和D层Turner型X连锁综合征性智力低下患者HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点基因型是“c.9994G>T半合子”突变；图2测序图中箭头所指位置显示B层女性携带者HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点基因型是“c.9994G>T杂合子”突变，C层个体基因型为野生型。

实施例3

HUWE1基因c.9994G>T突变(也称为HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F)诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

1)扩增引物(每条引物1.2μg)：如实施例2所示；

2)缓冲液(500μL的10×PCR缓冲液，500mmol/LKCl，100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)，15mmol/LMgCl

3)Taq酶(20U)；

4)dNTPs(四种dNTP各4mM)；

5)HUWE1:c.9994G>T阳性突变参考品DNA该参考品为一段双链DNA，具体序列如下所示：

其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为点突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置。

6)测序引物：如实施例2所示；

2、使用方法：

应用于2号家系患者检测，详见表10。

表10 Turner型X连锁综合征性智力低下2号家系成员的临床信息

2号家系谱图如图3所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

2号家系人员Ⅰ:1(父亲)、Ⅰ:2(母亲)、Ⅱ:2(患者)外周血DNA用于测序分析。

1)基因组DNA提取：同实施例1提取样本基因组DNA；

2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应，同实施例2；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

检测结果如图4显示的可知，2号家系1名男性患者HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点基因型是“c.9994G>T半合子”。图4测序图中箭头所指位置显示C层Turner型X连锁综合征性智力低下患者HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点基因型是“c.9994G>T半合子”突变；图4测序图中箭头所指位置显示B层女性携带者HUWE1:NM_031407.7:exon67:c.9994G>T:p.V3332F位点基因型是“c.9994G>T杂合子”突变，A层个体基因型为野生型。

综上所述，本发明发现了新的HUWE1基因突变体，且确认了新突变体与Turner型X连锁综合征性智力低下的发病密切相关，通过检测受试者是否携带有本发明所述致病基因，用于筛查或诊断Turner型X连锁综合征性智力低下的遗传学诊断，同时本发明所提供的试剂和诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断患者是否为Turner型X连锁综合征性智力低下。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。