一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白CHO细胞系的构建

摘要

本发明属于生物医药工程技术领域，公开了一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白CHO细胞系的构建。所述构建方法为：在PEDV的S1基因序列起始密码子ATG之前添加Kozac序列，在序列N端设计小鼠IgGκ链信号肽序列，在肽链C端设计1个Strep标签，并以柔性Linker与目的蛋白相连接，得到改造后的序列，然后克隆至慢病毒包装载体，转染至293T细胞培养，收获慢病毒包装病毒液加入到CHO细胞中进行筛选培养，得到稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白CHO细胞系。本发明所得CHO单克隆细胞株连续传20代后仍能表达PEDVS1重组蛋白，且重组蛋白的回收率和纯度显著提高。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白CHO细胞系的构建。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)是单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科α冠状病毒属成员，基因组大小约28kb，是引起猪病毒性腹泻的重要病原。PEDV几乎可感染所有年龄段猪，以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要临床症状，7日龄以内的新生仔猪感染发病，死亡率可高达100％，给养猪业造成严重经济损失。PEDVS蛋白由大约1383个氨基酸组成，位于病毒囊膜外层。通过弗林蛋白酶酶切位点划分成S1和S2亚基，其中S1亚基含有大多数受体结合位点，是诱导机体产生中和抗体的重要免疫原性蛋白。

重组蛋白表达系统使用较多的有大肠杆菌原核表达系统、杆状病毒真核表达系统、酵母表达真核系统和哺乳动物表达系统等。其中大肠杆菌原核表达系统因表达系统成熟、成本低、产量大而应用最广，然而以该系统表达的真核蛋白缺乏翻译后修饰过程，并且极易以包涵体形式表达，蛋白变性复性过程常常导致重组蛋白活性失活。

专利CN107619819A公开了一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系，通过将S1蛋白核苷酸序列(GenBank:KM242131.1)的起始密码子前加Kozak序列与NheI酶切位点与保护性碱基，在S1蛋白基因编码末端加终止子与NheI酶切位点与保护性碱基，在5’端加入IgK信号肽，3’端加入组氨酸标签，得到所需编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基因序列，并采用慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP载体携带目的基因构建重组质粒后转染HEK-293T细胞，具有表达稳定，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平。但其重组蛋白的回收率及表达量仍有提升的空间。

中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)是常用的哺乳动物表达细胞系，常可用于重组蛋白的稳定表达细胞系的构建，并且表达的蛋白相比原核系统更近似于天然蛋白的三维构象。但传统哺乳动物表达系统筛选稳转细胞系的试验周期长、成功率低、表达成本高。目前较少有公开PEDV蛋白在CHO细胞系中的成功表达。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白CHO细胞系的构建。本发明通过慢病毒病毒粒子包装的方法，构建了一株可稳定表达PEDVS1蛋白的CHO细胞系。在没有嘌呤霉素筛选压力下，细胞系传至20代，仍可检测到外源重组蛋白；并在重组蛋白的C端设计Strep标签蛋白，经亲和层析纯化后，重组蛋白的回收率和纯度显著高于His标签。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白CHO细胞系的构建，包括如下步骤：

(1)分析PEDV流行株S1基因序列(SEQ ID NO：1)的信号肽和酶切位点信息，在起始密码子ATG之前添加Kozac序列(SEQ ID NO：2)，在序列N端设计小鼠IgGκ链信号肽序列(SEQID NO：3)，在肽链C端设计1个Strep标签(SEQ ID NO：4)，并以柔性Linker与目的蛋白相连接，得到改造后的序列(SEQ ID NO：5)；

(2)将完成改造后的序列克隆至慢病毒包装载体plvx-mCMV-ZsGreen1-puro；

(3)将克隆后的慢病毒包装载体和辅助质粒pMD2-G、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev以脂质体转染的方式共转染至293T细胞，然后放入二氧化碳培养箱中培养，冻融，离心收获慢病毒包装病毒液；

(4)向CHO细胞中滴加收获的第一代慢病毒包装病毒液，并添加聚凝胺，感染8～12h后弃去培养基，换成Ham'sF-12K培养基，加入嘌呤霉素进行筛选培养，得到稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白CHO细胞系。

进一步地，步骤(1)中所述柔性Linker为2～6个G4S，优选为3～6个G4S。

进一步地，步骤(3)中所述293T细胞通过如下方法得到：

使用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基复苏293T细胞，按1:2～1:3的比例进行传代，直到细胞量达到0.2～7×10

进一步地，步骤(3)中所述培养条件为：37℃培养48～96h，优选72～84h；所述冻融次数为1～4次，优选不低于2次；所述离心是指在200×g室温离心5min。

进一步地，步骤(4)中所述CHO细胞通过如下方法得到：

将新复苏的CHO细胞以0.5～2×10

进一步地，步骤(4)中所述聚凝胺添加的浓度为2～10μg/mL，优选为5μg/mL。

进一步地，步骤(4)中所述Ham'sF-12K培养基为新鲜的含10％FBS的Ham'sF-12K培养基。

进一步地，步骤(4)中所述嘌呤霉素加入的浓度为0.5～5μg/mL。

进一步地，步骤(4)中所述筛选培养的时间为14～21天，然后以有限稀释法筛选单克隆细胞株5～10个，经荧光显微镜观察及Westernblots鉴定后，扩大培养并冻存CHO细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明所得CHO单克隆细胞株连续传20代后仍能表达PEDVS1重组蛋白。

(2)本发明在重组蛋白的C端设计Strep标签蛋白，经亲和层析纯化后，重组蛋白的回收率和纯度显著高于His标签。

附图说明

图1为本发明实施例中所得CHO单克隆细胞株的荧光显微镜检测结果图。

图2为本发明实施例中所得CHO单克隆细胞株的Westernblots检测结果图。

图3为本发明实施例1中使用Strep标签所得CHO单克隆细胞株和对比例1中使用His标签所得CHO单克隆细胞株经层析镍柱纯化的S1重组蛋白的鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)利用本实验室分离获得的PEDV流行株S1基因序列，序列见SEQ ID NO：1所示。分析基因序列的信号肽和酶切位点信息。在起始密码子ATG之前添加Kozac序列，序列见SEQID NO：2所示；在序列N端设计小鼠IgGκ链信号肽序列，序列见SEQ ID NO：3所示；在肽链C端设计1个Strep标签(TGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAG，SEQ ID NO：4)，并以4个G4S作为柔性Linker与目的蛋白相连接，得到改造后的序列，序列见SEQ IDNO：5。完成序列改造后克隆至慢病毒包装载体plvx-mCMV-ZsGreen1-puro，经PCR和测序验证正确的命名为plvx-S1。

(2)使用含10％胎牛血清的DMEM培养基复苏293T细胞，按1:2的比例进行传代，直到细胞量达到5×10

(3)将慢病毒包装载体和辅助质粒pMD2-G、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev以脂质体转染的方式共转染至293T细胞，每个质粒的用量为500mg，每孔转染DNA量为2mg，转染后10h弃去培养基，换成含10％FBS的DMEM培养基，37℃连续培养72h。然后冻融293T细胞3次，200×g室温离心5min，取上清作为慢病毒包装的第一代病毒粒子。

(4)将新复苏的CHO细胞以1×10

(5)复苏冻存CHO细胞，连续培养20代，通过荧光显微镜和Westernblots检测S1蛋白表达是否丢失。结果如图1(A：单克隆细胞集落(绿光)；B：单克隆细胞集落(明场)；C：单克隆细胞扩大培养(绿光)；D：单克隆细胞扩大培养(明场))和图2(1：CHO-S1第5代细胞；2：CHO-S1第10代细胞；3：CHO-S1第20代细胞)所示。由图1和图2结果可见本发明所得CHO单克隆细胞株连续传20代后仍能表达PEDVS1重组蛋白。

对比例1

本对比例与实施例1相比，采用His标签替代Strep标签，其余相同。

对实施例1和对比例1中所得CHO单克隆细胞株经层析镍柱纯化的S1重组蛋白进行Westernblots鉴定，结果如图3所示(图中A：实施例1中使用Strep标签所得CHO单克隆细胞株；B：对比例1中使用His标签所得CHO单克隆细胞株；1：Sf9全细胞蛋白；2：使用Sterp标签层析镍株纯化的S1重组蛋白；3：Sf9全细胞蛋白；4：使用His标签层析镍株纯化S1重组蛋白)。由图3结果可见，本发明在重组蛋白的C端设计Strep标签蛋白，经亲和层析纯化后，重组蛋白的回收率和纯度显著高于His标签。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。