铁死亡促进剂RSL3联合伊马替尼在制备治疗胃肠间质瘤的药物中的应用

摘要

本发明公开了铁死亡促进剂RSL3联合伊马替尼在制备治疗胃肠间质瘤的药物中的应用，该药物可为靶向抑制剂，以铁死亡促进剂RSL3和伊马替尼作为活性成分抑制胃肠间质瘤细胞的增殖和诱导胃肠间质瘤细胞的死亡，胃肠间质瘤细胞为GIST‑T1和GIST‑882细胞。本发明通过体外细胞实验发现RSL3与伊马替尼联合处理能显著降低细胞增殖活性，诱导细胞凋亡，并且二者联用发挥协同抑制作用；通过裸鼠GIST荷瘤动物发现，RSL3联合伊马替尼在体内可显著抑制GIST荷瘤裸鼠的生长，获得较佳的治疗效果，为治疗胃肠间质瘤提供更为有效的方法，具有重要的临床价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及铁死亡促进剂RSL3联合伊马替尼在制备治疗胃肠间质瘤的药物中的应用。

背景技术

胃肠间质瘤(GIST)是胃肠道最常见的间质来源肿瘤，年发病率为1/10万人～2/10万人，GIST中有75％～80％的患者可以检测到酪氨酸激酶受体(c-kit)基因突变，而血小板源性生长因子受体α(PDGFRA)基因的突变只占5％～10％，早期难以诊断，且对放化疗均不敏感，外科手术切除是GIST最主要和最有效的治疗手段，但术后常常发生复发和转移。酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的出现显著改善了GIST患者的预后。然而，对TKI的敏感性取决于突变类型，第18外显子D842V突变是PDGFRA中最常见的突变，该突变对TKI原发耐药，治疗效果有限。复发、转移和不可切除GIST的一线治疗药物是甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate，IM)，超过80％的患者可以从IM治疗中获益，但是一半患者在治疗后2年内会发生进展。虽然针对致病基因KIT/PDGFRA突变的TKI已经研发至第四线，但均存在继发性耐药的问题，故目前GIST的总体治疗效果仍难令人满意，最新的临床与基础研究聚焦于广谱TKI的开发、免疫治疗以及寻找新的治疗靶标。

细胞死亡对于发育、免疫和组织稳态等基本生理过程至关重要，其分为凋亡、坏死、自噬等。2003年首次发现大鼠肉瘤病毒(RAS)基因选择性致死小分子Erastin诱导一种新的非凋亡性细胞死亡，而RAS选择性致死性小分子3(RSL3)也可诱导这种细胞死亡方式，并且Ferrostatin-1(Fer-1)和铁螯合剂去铁胺(DFO)可以抑制这一过程。2012年Dixom等将这种新的细胞死亡形式命名为铁死亡(Ferroptosis)。近年来，铁死亡受到了极大关注，主要原因是因为其独特的细胞死亡方式，在机制及细胞形态特征上不同于传统意义上的细胞死亡方式，铁死亡是一种由致死性脂质过氧化引起的调节性细胞死亡，铁积累和脂质过氧化是铁死亡过程中启动膜氧化损伤的关键因素。细胞在发生铁死亡时，有明显的形态学改变，发生铁死亡的细胞在电镜下可被观测到线粒体明显缩小变形，线粒体嵴减少消失，线粒体膜褶皱消失凝聚继而破裂，相较与细胞凋亡是发生的核固缩、核碎裂、核溶解，细胞铁死亡时细胞核大小正常，但是缺乏染色质凝聚。

目前已有许多肿瘤被报道与铁死亡有关，靶向铁死亡以消除肿瘤正成为肿瘤治疗的一种有前途的新方法。几种FDA批准的药物已经被确定在不同的肿瘤中通过铁死亡诱导发挥作用。主要包括System xc-抑制剂(Erastin、柳氮磺胺吡啶、索拉非尼)、谷胱甘肽耗竭因子(FIN56)和GPX4抑制剂(RSL3)。然而，GIST中铁死亡相关研究较少，GIST中是否存在铁死亡以及铁死亡促进剂是否有效目前尚不清楚。

发明内容

针对现有技术中的上述问题，本发明的主要目的是提供铁死亡促进剂RSL3联合伊马替尼在制备治疗胃肠间质瘤的药物中的应用，为治疗胃肠间质瘤提供强有力的手段。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明提供铁死亡促进剂RSL3联合伊马替尼在制备治疗胃肠间质瘤的药物中的应用。

作为优选，所述药物为靶向抑制剂，以铁死亡促进剂RSL3和伊马替尼作为活性成分抑制胃肠间质瘤细胞的增殖和诱导胃肠间质瘤细胞的死亡。

作为更优选，所述胃肠间质瘤细胞为GIST-T1和GIST-882细胞。

作为优选，所述铁死亡促进剂RSL3的体外剂量为0.5-2uM。

作为优选，所述药物中，铁死亡促进剂RSL3的给药剂量为10mg/kg，伊马替尼的给药剂量为100mg/kg。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明通过体外细胞实验，发现铁死亡促进剂RSL3能特异性地抑制胃肠间质瘤细胞的增殖，同时RSL3与伊马替尼联合处理能显著降低细胞增殖活性，诱导细胞凋亡，并且二者联用发挥协同抑制作用，治疗效果大于单一用药。另外，通过裸鼠GIST荷瘤动物，发现RSL3在体内可显著抑制GIST荷瘤裸鼠的生长，其联合伊马替尼治疗组的肿瘤缩小最明显，且裸鼠安全性良好，再次证明RSL3与伊马替尼联合治疗胃肠间质瘤可获得较佳的治疗效果，为治疗胃肠间质瘤提供更为有效的方法，具有重要的临床价值。

附图说明

图1是实施例中不同浓度梯度的RSL3和伊马替尼联合处理GIST-T1细胞和GIST-882细胞的细胞活性曲线。

图2是实施例中不同浓度梯度的RSL3和伊马替尼联合处理GIST-T1细胞和GIST-882细胞后的联合指数曲线(CI)。

图3是实施例中RSL3、伊马替尼以及二者联合用药处理的裸鼠GIST荷瘤模型抑制肿瘤增殖效果。

图4是实施例中RSL3、伊马替尼以及二者联合用药处理的裸鼠GIST荷瘤模型体重变化。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1验证RSL3和伊马替尼联合抑制GIST细胞增殖活性

利用不同浓度梯度的RSL3和伊马替尼联合处理胃肠间质瘤细胞T1和882，同时采用CCK8技术检测药物处理后的细胞活性，并绘制增殖曲线，具体步骤如下：

将处于对数生长期的GIST-T1和GIST-882细胞消化离心重悬后，使用细胞计数仪计数，按每孔5000个细胞加入96孔板中，补充培养基至100uL，放置于恒温培养箱中过夜。对照组为含0.01％浓度DMSO的培养基。RSL3用DMSO溶解，将伊马替尼用PBS溶解，按50、100、200、400的伊马替尼和0、0.5、1、2umol/L的RSL3不同浓度组合配置成工作液，吸去旧培养基，按浓度梯度，每孔加入150uL等量工作液或对照培养基，置于恒温培养箱中培养72h，吸去旧培养基，每孔中分别加入培养基及CCK-8试剂100uL和10uL，在恒温培养箱中避光孵育2小时，于450nm波长下检测吸光度，按细胞活性＝(n浓度下吸光度-空白孔吸光度)/(对照DMSO吸光-空白孔吸光度)公式计算药物浓度梯度作用后的细胞活性。

结果发现，RSL3和伊马替尼均可显著抑制细胞增殖活性，两药联用治疗组的GIST细胞抑制最为显著，抑制效果显著大于单药治疗，并且随着RSL3和伊马替尼组合浓度越高，GIST-T1和GIST-882细胞增殖活性显著受到抑制(图1)。

实施例2联合指数(CI)验证RSL3与伊马替尼发挥协同作用

RSL3和伊马替尼作用于GIST-T1和GIST-882细胞后，通过CompuSyn软件计算联合指数(CI)，具体步骤如下：Chou-Talalay法检验，并应用CompuSyn软件定量计算药物组合指数，评估RSL3和伊马替尼对胃肠间质瘤细胞的作用效应，其中CI>1为拮抗效应，CI＝1为无相互作用关系，CI<1为协同效应。

通过CompuSyn软件计算CI值表明，RSL3和伊马替尼作用于GIST-T1和GIST-882细胞的CI值均小于1，提示RSL3和伊马替尼发挥协同抑制作用(图2)。

实施例3验证RSL3与伊马替尼联合用药显著抑制裸鼠GIST肿瘤的生长

利用裸鼠GIST荷瘤模型，分别给予RSL3、伊马替尼以及二者联合用药处理，分别观察抑制肿瘤的效果，具体步骤如下：取处于对数生长期的GIST-T1细胞，细胞密度为80-90％左右，胰酶消化细胞后用预冷的PBS洗两遍，用PBS重悬至密度为(3×10

结果发现RSL3处理组小鼠最终体积及重量显著小于对照组小鼠，伊马替尼联合RSL3处理可使GIST肿瘤抑制更为显著(图3)。

实施例4裸鼠体内各治疗组之间体重水平相当，提示裸鼠对RSL3和伊马替尼耐受，具体如下：

通过裸鼠GIST荷瘤实验，造模两周后连续18天每3天予10mg/kg的RSL3和100mg/kg伊马替尼联合处理可使GIST肿瘤生长受到显著抑制，各治疗组间小鼠体重变化无显著性差异(P>0.05，图4)，提示裸鼠对RSL3联合伊马替尼治疗的耐受度可，10mg/kg的量对于裸鼠属于安全剂量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。