阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR及其应用

摘要

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种阿美替尼耐药细胞株，其特征在于，所述阿美替尼耐药细胞株为耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI‑H1975‑AR，保藏编号为CCTCC NO:C2022291。该耐药细胞株H1975‑AR可在作用浓度为1umol/L阿美替尼的培养体系中稳定生长、传代，对阿美替尼的耐药指数（RI）为522.8，而且，该H1975‑AR细胞株存在T790M突变，无C797S突变，并表现出上皮间质转化的表型；因此，本发明构建的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株H1975‑AR为研究阿美替尼耐药人非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、非小细胞肺癌对阿美替尼的耐药机制、非小细胞肺癌耐药相关信号通路的研究分析、抗肿瘤药物敏感性分析、制备抗肿瘤药物、筛选肿瘤耐药逆转药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等提供了耐药细胞模型，具有较高的科研和生产应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。具体涉及一种阿美替尼耐药细胞株H1975-AR及其应用。

背景技术

肺癌是世界范围内最常见且死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中80％的病例为非小细胞肺癌。由于肺癌本身的疾病特性，导致超过一半的肺癌患者在疾病确诊时已发生转移，失去了手术根治的机会，其生存率也大大减低。近十年来，随着分子诊断技术的发展和靶向药物的研发，肺癌的治疗模式已经不在局限于传统的化疗，其五年生存率也有明显的改善。其中，EGFR-TKI治疗在具有EGFR基因激活突变的肺癌人群中疗效显著。

EGFR激活突变导致EGFR酪氨酸激酶结构域构象不稳定而发生二聚体化，进而激活其下游信号通路，促进肿瘤细胞生长增殖，侵袭迁移及血管生成而导致肿瘤发生发展。EGFR-TKIs则可通过结合EGFR激酶结构域的ATP结合位点从而抑制其活动。目前EGFR-TKIs治疗为具有EGFR突变的肺腺癌患者的一线标准治疗，其中包括一代EGFR-TKIs(吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼)，二代EGFR-TKIs(阿法替尼、达克替尼)和三代EGFR-TKI(奥希替尼、伏美替尼、阿美替尼)。但所有患者仍然不可避免的产生耐药。

阿美替尼是一种新型、不可逆、高选择性的，对于EGFR敏感突变和T790M突变具有抑制作用的第三代EGFR-TKI。APOLLO临床研究结果显示阿美替尼用于晚期一代或二代EGFR-TKIs治疗后进展的T790M阳性的NSCLC患者的安全有效。目前，阿美替尼已应用于临床晚期EGFR突变患者的二线治疗，但阿美替尼用于二线治疗的耐药机制尚不完全清楚，而且，目前国内外尚未有阿美替尼耐药的肺腺癌细胞株的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种阿美替尼耐药细胞株H1975-AR及其应用。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种阿美替尼耐药细胞株H1975-AR，命名为耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2022年9月7日，保藏编号为CCTCC NO:C2022291，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR是采用体外浓度梯度递增法，即通过逐步增加阿美替尼药物浓度，持续作用于具有EGFR21外显子L858R突变及T790M突变的NCI-H1975细胞株，诱导建立人肺腺癌阿美替尼耐药细胞株。其具体构建方法为：

(1)将人源具有EGFR21外显子L858R突变及T790M突变的肺腺癌细胞株NCI-H1975(本实验室库存)置于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃、5％ CO

(2)以1×10

本发明构建得到的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR可在作用浓度为1umol/L阿美替尼的培养体系中稳定生长、传代，对阿美替尼的耐药指数(RI)为522.8，为研究阿美替尼耐药人非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、非小细胞肺癌对阿美替尼的耐药机制、非小细胞肺癌耐药相关信号通路的研究分析、抗肿瘤药物敏感性分析、制备抗肿瘤药物、筛选肿瘤耐药逆转药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等提供了耐药细胞模型，具有较高的科研和生产应用价值。

本发明第二方面提供了耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR在筛选逆转肿瘤耐药性的药物中的应用。

本发明第三方面提供了耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明第四方面提供了耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR在在构建体外肿瘤耐药细胞模型中的应用

根据上述的应用，优选地，所述肿瘤为肺癌。更加优选地，所述肺癌为非小细胞癌。最优选地，所述肺癌为肺腺癌。

与现有技术相比，本发明取得的有益技术效果如下：

本发明构建得到的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR可在作用浓度为1umol/L阿美替尼的培养体系中稳定生长、传代，对阿美替尼的耐药指数(RI)为522.8，而且，该H1975-AR细胞株存在T790M突变，无C797S突变，并表现出上皮间质转化的表型；因此，本发明构建的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR为研究阿美替尼耐药人非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、非小细胞肺癌对阿美替尼的耐药机制、非小细胞肺癌耐药相关信号通路的研究分析、抗肿瘤药物敏感性分析、制备抗肿瘤药物、筛选肿瘤耐药逆转药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等提供了耐药细胞模型，具有较高的科研和生产应用价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。

附图说明

图1为本发明阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR及其亲本细胞株NCI-H1975的细胞形态学观察结果图；其中，H1975表示亲本细胞株NCI-H1975，H1975-AR表示耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR；

图2为本发明阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR及NCI-H1975亲本细胞在不同浓度阿美替尼作用下的存活率检测结果；其中，其中，H1975表示亲本细胞株NCI-H1975，H1975-AR表示耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR；

图3为本发明阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR及NCI-H1975亲本细胞增殖能力检测结果；其中，A表示SRB细胞增殖实验检测亲本细胞NCI-H1975与阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR增殖能力差异；B表示平板克隆实验检测亲本细胞NCI-H1975与阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR增殖能力差异；H1975表示亲本细胞株NCI-H1975，H1975-AR表示耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR；

图4为本发明阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR及NCI-H1975亲本细胞Transwell侵袭及迁移能力检测结果；其中，H1975表示亲本细胞株NCI-H1975，H1975-AR表示耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR；

图5为本发明阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR及NCI-H1975亲本细胞中EGFR及其下游蛋白表达情况的蛋白免疫印迹实验结果；其中，H1975表示亲本细胞株NCI-H1975，H1975-AR表示耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR；

图6为本发明阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR及NCI-H1975亲本细胞EMT相关蛋白标记物的蛋白免疫印迹实验检测结果；其中，H1975表示亲本细胞株NCI-H1975，H1975-AR表示耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR；。

具体实施方式

以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1：耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR的构建

耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR是采用体外浓度梯度递增法，即通过逐步增加阿美替尼药物浓度，持续作用于具有EGFR21外显子L858R突变及T790M突变的NCI-H1975细胞株，诱导建立人肺腺癌阿美替尼耐药细胞株。其具体构建方法为：

(1)将人源具有EGFR21外显子L858R突变及T790M突变的肺腺癌细胞株NCI-H1975(本实验室库存)置于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃、5％ CO

(2)以1×10

nmol/L---400nmol/L---500nmol/L---600nmol/L---800nmol/L---1000nmol/L，进行培养。每一个药物浓度传代至少2次，至细胞在含有1000nmol/L阿美替尼的培养基中仍可以稳定生长、传代为止，即可得到本发明的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR，该细胞株于2022年9月7日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022291，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

实施例2：耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR的冻存与复苏

冻存：将实施例1中获得的耐药细胞置入冻存管的无血清冻存液中，再将冻存管置于液氮中保存。无血清冻存液购自苏州新赛美苏州新赛美生物科技有限公司。冻存由-80度过夜后最后放入液氮保存。

复苏：从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37℃水浴中轻轻摇动，使冻存物在1分钟内解冻。将解冻后的细胞悬液置于15ml无菌离心管中，加入5ml H1975培养基，1000rpm/分，离心5分钟，弃上清，加入8mL完全培养基，稍吹打混匀成混合液，吸混合液置入一个100mm的细胞培养皿中，放入二氧化碳培养箱中，在37℃、5％CO

实施例3：耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR的形态学观察

1、实验细胞株材料：实施例1构建的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR及其亲本人肺腺癌细胞株NCI-H1975。

2、实验方法：分别将阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR及其亲本人肺腺癌细胞株NCI-H1975接种于60mm培养皿，待细胞生长至对数生长期，置倒置相差显微镜下观察活细胞形态并拍照。

3、实验结果：

形态学观察的实验结果如图1所示。由图1可知，阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR及其亲本细胞株NCI-H1975均呈现梭形，形态无明显差异。

实施例4：耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR耐药指数测定

1、实验方法：

取处于对数生长期的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR和亲本细胞NCI-H1975，分别以3000个细胞/100μL/孔接种于96孔板中。96孔板边缘一圈每孔加入200μL PBS溶液以减少实验过程中培养基蒸发。铺板结束后轻轻拍打96孔板边缘，上下左右各三次，使细胞在孔内分布均匀，放入细胞培养箱继续孵育。细胞铺板后约24h，待细胞完全贴壁，每孔加入100μL配置好的不同浓度的含阿美替尼的完全培养基(完全培养基中阿美替尼的浓度梯度设置为：1nM、10nM、100nM、1000nM)，每个浓度设置3-6个复孔，以减少误差；同时设置空白对照组(空白对照组只加完全培养基，培养基中不含药物)。加药结束后放入细胞培养箱继续孵育72h。于检测前弃去细胞培养基，每孔加入100μLPBS溶液清洗2次。然后按照100μL/孔加入预冷的10％三氯乙酸溶液(10g三氯乙酸粉末溶于100mL ddH

2、实验结果：

阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR在不同浓度阿美替尼作用下的存活率检测结果如图2所示。由图2可知，在相同浓度的阿美替尼作用下，耐药细胞株NCI-H1975-AR存活率远远大于亲本细胞NCI-H1975。经计算，本发明耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR的耐药指数为522.8。

实施例5：耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR增殖能力检测

1、SRB细胞增殖实验检测耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR增殖能力：

(1)实验方法：分别取对数生长期亲本细胞株NCI-H1975及耐药细胞株NCI-H1975-AR，按照2000个细胞/100μl/孔接种于96孔板。待细胞过夜贴壁后分别于0h、24h、48h、72h、96h弃去培养基并使用10％三氯乙酸溶液固定细胞。待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4％(w/v)的SRB染液(1％的乙酸配制)100μL，染色30min后倒掉染液，用1％(v/v)乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干；用100μL非缓冲Tris-base碱液(10mM，pH＝10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20min，采用酶标仪540nm处测定光吸收值。使用Graphpad Prism 9.0软件绘制生长曲线图，观察对比细胞增殖情况。

(2)实验结果：

检测结果如图3中A所示。由图3中A可知，耐药细胞株NCI-H1975-AR增殖能力弱于亲本细胞株NCI-H1975。

2、平板克隆实验检测耐阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR的增殖能力：

(1)实验方法：

选取对数生长期的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR及其亲本细胞NCI-H1975，按照500-1000个细胞/孔的密度接种于6孔板中，轻轻摇晃混匀后放入细胞培养箱中，孵育7-14天。观察细胞生长情况，当孔板中出现肉眼可见的克隆株时弃去培养基终止培养。用PBS润洗2次后，使用多聚甲醛固定30分钟。弃去固定液，结晶紫染色，然后室温干燥，计数。

2、实验结果：

检测结果如图3中B所示。由图3中B可知，耐药细胞株NCI-H1975-AR增殖能力弱于亲本细胞株NCI-H1975。

实施例6：耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR侵袭及迁移能力的检测

1、实验方法：

(1)迁移实验：

a、准备实验所需的孔径为8μm的Transwell小室及24孔板。选取处于对数生长期的耐药细胞株NCI-H1975-AR及其亲本细胞株NCI-H1975，实验前使用无血清培养基饥饿处理12-24h。胰酶消化后重悬细胞，以1000rpm 5min离心收集细胞。弃去上清，使用无血清1640培养基重悬。

b、重悬并充分混匀细胞细胞后，调整细胞浓度为(1-10)×10

c、弃去上室中的培养基以及相应各孔中培养基，终止培养。用PBS轻轻洗涤两次，并使用湿润过的棉签轻轻除去上室面未穿透的细胞。多聚甲醛固定30min后结晶紫染色30min。最后置于倒置显微镜下观察，拍照，并计数。

(2)侵袭实验：

提前分装好的Matrigel基质胶置于4度冰箱融化，使用无血清1640培养基，并按照1:5的比例稀释基质胶。按照60μL/孔均匀铺于Transwell小室上室，后放入37度细胞培养箱孵育2-3h左右使基质胶呈凝胶状。余细胞准备及培养、固定、染色步骤同Transwell细胞迁移实验(即迁移实验的步骤a、b、c)。

2、实验结果：

检测结果如图4所示。由图4可知，阿美替尼耐药细胞株NCI-H1975-AR的侵袭及迁移能力均显著高于亲本细胞NCI-H1975。

实施例7：耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR中EGFR及其下游通路蛋白、上皮间质转化(EMT)相关蛋白检测

提取本发明耐阿美替尼人肺腺癌细胞株NCI-H1975-AR的蛋白裂解液；同时对提取的蛋白裂解液进行EGFR、p-EGFR、Akt,p-Akt,Erk,p-Erk蛋白免疫印迹实验及EMT相关蛋白检测。

1、实验方法：

将细胞根据具体实验要求处理，提取蛋白样本前制备细胞裂解液：取所需用量RIPA裂解液，使用之前按照100:1的比例加入蛋白酶抑制剂混合液以及磷酸酶抑制剂混合液，混合均匀。整个蛋白提取过程在冰上进行。

细胞按照实验要求处理之后，弃去培养基，PBS洗涤细胞两次，直接将细胞裂解液滴加于细胞表面(六孔板按照每孔150-250μL)加入裂解液。用枪吹打数下(注意不同样本间不要交叉污染)，使得裂解液均匀分布于细胞表面。置于冰上裂解10min，后使用刮刀收集蛋白样本于EP管中。4℃，12000g离心5分钟，取上清于新EP管中，进行后续蛋白浓度测定后加入去离子水以及5×蛋白上样缓冲液将蛋白样品配置成统一浓度。后按蛋白免疫印迹方法常规电泳、转膜、孵育抗体，机器曝光。

2、实验结果：

耐阿美替尼人肺腺癌细胞株H1975-AR中EGFR及其下游通路蛋白的蛋白免疫印迹结果如图5所示。

由图5可知，50nmol/L的阿美替尼即可显著抑制亲本细胞H1975中p-EGFR、p-Akt及p-Erk等蛋白的表达；但在阿美替尼耐药细胞株H1975-AR中未检测到p-EGFR蛋白的表达，并且50到500nmol/L阿美替尼均不可显著降低耐药细胞H1975-AR p-Akt及p-Erk蛋白的表达量，提示耐药细胞株中存在旁路激活。

EMT相关蛋白检测结果如图6所示。由图6可知，与亲本细胞株NCI-H1975相比，耐药细胞株H1975-AR的E-cadherin表达明显减低，Snail表达明显增高，Vimentin表达无明显差异；进一步结合Transwell迁移及侵袭实验结果，阿美替尼耐药细胞株H1975-AR的侵袭及迁移能力增强，提示耐药细胞株NCI-H1975-AR存在上皮间质转化表型。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。