一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株及其构建方法和应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株及其构建方法和应用。本发明的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2022113。本发明的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株可在作用浓度为4μM盐酸安罗替尼的培养体系中稳定生长、传代，对盐酸安罗替尼的耐药倍数(RI)为7.46倍，为研究食管癌细胞对靶向药耐药机制、寻找克服食管癌耐药的有效治疗方法及指导临床用药提供了耐药细胞模型，具有重要的作用和良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株及其构建方法和应用。

背景技术

食管癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，每年新发人数约60余万，一般在我国食管癌每年新发人数约39.6万，位居第6，其中食管鳞癌占食管癌的87％；而食管癌的每年死亡人数约19.4万，位居第5。在确诊时，近50％的患者癌症超出原发灶的局部区域范围，70％-80％的切除标本在区域淋巴结中存在转移；根治性放疗、放化疗和手术后的复发率超过70％；食管癌患者总体5年生存率仅15-25％。而复发转移性食管癌在系统治疗方面，目前主要的治疗方案为氟尿嘧啶为基础的双药化疗方案，同时免疫治疗的出现为食管癌的治疗带来了曙光。

然而，由于信号通路的复杂性以及尚未发现治疗相关的特异性靶点，对食管鳞癌有效的单靶点药物仍缺乏依据。多靶点药物如盐酸安罗替尼(AL3818)在食管鳞癌中表现出更好的疗效。盐酸安罗替尼(Anlotinib hydrochloride)是一种口服小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，靶向血管内皮生长因子(VEGF)受体1-3，成纤维细胞生长因子(FGF)受体1-4，血小板衍生生长因子(PDGF)受体ɑ和β、ret和c-Kit，CSCO指南推荐安罗替尼可用于晚期食管鳞癌一线(安罗替尼联合化疗)或二线及以上(安罗替尼单药)治疗。尽管在临床研究中表明安罗替尼对食管患者有较好的疗效，但同样会面临耐药这一棘手问题，目前在对安罗替尼耐药机制的研究中，尚无耐药细胞株，而人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞系、构建方法及其应用暂无相关报道。

因此，需要提供一种针对上述现有技术不足的改进技术方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株及其构建方法和应用，以有助于解决或改善难以进行食管癌耐药机制研究或克服盐酸安罗替尼耐药的问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株，所述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2022113。

优选地，所述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株对盐酸安罗替尼的耐药倍数RI＝7.46。

优选地，所述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株对盐酸安罗替尼耐药，IC50＝36.77μM。

优选地，所述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株呈长梭形及多边形。

本发明还提出了一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的构建方法，其采用下述技术方案：如上所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的构建方法，包括下述步骤：(1)将人食管癌细胞EC109培养于含有10％灭火胎牛血清和1％双抗的培养液中，于37℃、5％CO

本发明还提出了一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的应用，其采用下述技术方案：如上所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株在对盐酸安罗替尼耐药机制研究中的应用。

优选地，如上所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株在制备耐药细胞模型中的应用。

优选地，如上所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株在筛选逆转肿瘤耐药性药物或抗肿瘤药物中的应用。

有益效果：

本发明构建了一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株，其可在作用浓度为4μM盐酸安罗替尼的培养体系中稳定生长、传代，对盐酸安罗替尼的耐药倍数(RI)为7.46倍，为研究食管癌细胞对靶向药耐药机制、寻找克服食管癌耐药的有效治疗方法及指导临床用药提供了耐药细胞模型，具有重要的作用和良好的应用前景。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。其中：

图1为耐药细胞株形态学变化对比图；左图为亲本细胞EC109/pt的细胞形态图；右图为耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4的细胞形态图；

图2为耐药细胞株药物敏感性及耐药性检测结果图；

图3为耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4和其亲代人食管癌细胞EC109/pt的凋亡能力分析结果图；

图4为耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4和其亲代食管癌细胞EC109/pt的周期分析结果图；其中，“CN”代指盐酸安罗替尼浓度为0的情况；

图5为基因测序前后对比图；其中，上图为亲本细胞EC109/pt的基因测序结果图，中图为耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4的基因测序结果图，下图为耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4和亲本细胞EC109/pt的基因测序对比图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本发明针对目前“尚无人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞系，不利于盐酸安罗替尼耐药机制研究和克服盐酸安罗替尼耐药”的问题，提供一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株，人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2022113。

本发明优选实施例中，人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株对盐酸安罗替尼的耐药倍数RI＝7.46。

本发明优选实施例中，人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株对盐酸安罗替尼耐药，IC50＝36.77μM。

本发明优选实施例中，人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株呈长梭形及多边形(多数细胞呈长梭形，少量细胞呈多边形，两种形态同时存在)。

本发明还提出了一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的构建方法，本发明实施例的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的构建方法包括下述步骤：(1)将人食管癌细胞EC109培养于含有10％灭火胎牛血清和1％双抗的培养液中，于37℃、5％CO

其中，上述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的构建方法中，采用含0.5μM盐酸安罗替尼的培养液开始进行诱导是根据MTT法测得的人食管癌细胞EC109在不同盐酸安罗替尼浓度下的体外存活能力选取的(IC20为0.5μM，IC50为4.92μM)。

本发明还提出了一种如上所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的应用：如上所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株在对盐酸安罗替尼耐药机制研究中的应用。

本发明的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的应用的优选实施例中，如上所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株在制备耐药细胞模型中的应用。

本发明的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的应用的优选实施例中，如上所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株在筛选逆转肿瘤耐药性药物或抗肿瘤药物中的应用。

下面通过具体实施例对本发明的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株及其构建方法和应用进行详细说明。

下面实施例中：除非特别说明，本发明均采用技术领域常规的试剂、方法和设备；除非特别说明，以下实施例所用试剂盒材料均为市购。

实施例1：耐药细胞株的制备

人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株EC109/AL3818-ZZ4的构建：

(1)将食管癌细胞系EC109培养于含有10％灭活胎牛血清，1％双抗(100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)的RPMI-1640培养基中，放置37℃、5％CO

(1)MTT法检测食管癌细胞EC109的体外存活能力，确定AL3818的起始浓度：将8000个/孔的EC109细胞接种于96孔板中，12h后分别加入不同浓度(0、0.25μM、0.5μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM)的盐酸安罗替尼，置于培养箱中培养48h后弃上清，加入5mg/ml MTT 100μL/孔，置于培养箱中作用4h后弃上清，加入150μL/孔DMSO，检测细胞在570nm和630nm的吸光光度值。测得的IC50为4.92μM，IC20为0.5μM，并以IC20(0.5μM)为初始诱导浓度。

(2)盐酸安罗替尼耐药细胞诱导：

A.将处于对数生长期的食管癌细胞以1×10

B.待细胞恢复正常形态后，加入0.5μM AL3818药物培养液作用细胞2h，用PBS清洗；

C.重复步骤B，重复的过程中，0.5μM AL3818药物培养液作用细胞的时间依次为4h、8h、12h、24h和48h；

D.待细胞状态稳定(在0.5μM AL3818药物培养液作用细胞时，细胞稳定生长和传代)一个月后，MTT法检测细胞IC50值；

E.将AL3818的浓度依次提高为1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM，循环进行步骤A-D(即，0.5μM AL3818诱导结束后，再采用1μM AL3818诱导经0.5μM AL3818诱导后得到的细胞；1μM AL3818诱导结束后，再采用1.5μM AL3818诱导经1μM AL3818诱导后得到的细胞……，直至AL3818的浓度为4μM)；

(4)经过上述的方式培养1年6个月后，筛选得到在作用浓度为4μMAL3818的培养体系中稳定生长(按照1:2传代，每3-4天传代一次)、传代的细胞株，2-3天更换一次培养基，待细胞生长至80％-90％，以1:2比例传代。每两周用MTT法检测一次IC50值，盐酸安罗替尼在耐药细胞的IC50值稳定在36.77μM，是亲本细胞EC109亲本细胞(EC109/pt)IC50的7倍以上(RI值)。

(5)本实施例所得细胞株命名为“耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4”，并于2022年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2022113，保藏地址：中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心。

实施例2：耐药细胞株的形态学观察

1、实验细胞株材料：

实施例1构建的食管癌耐药细胞株，即耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4，以及人食管癌亲本细胞株EC109/pt。

2、实验方法：

将两种细胞分别接种于6孔板中，培养至对数生长期，倒置相差显微镜下观察细胞形态。

3、实验结果：

实验结果如图1所示。EC109/pt和EC109/AL3818-ZZ4细胞在倒置显微镜(100×)下均呈上皮样单层排列贴壁生长，EC109/pt细胞边界清晰，多呈圆形，聚集成簇生长；而耐药后的EC109/AL3818-ZZ4细胞体积变大，呈长梭形及多边形(多数细胞呈梭形，少量细胞呈多边形，两种形态的细胞同时存在)。

与亲本细胞相比，食管癌耐药细胞株体积增大，形态改变。说明食管癌耐药细胞株在形态上发生了变化。

实施例3：耐药细胞株的药物敏感性及耐药性的检测

1、实验细胞株材料：

实施例1构建的食管癌耐药细胞株，即耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4，以及人食管癌亲本细胞株EC109/pt。

2、实验方法：

将对数生长期的耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4，亲本食管癌细胞EC109/pt分别配置成浓度为5.4×10

抑制率(％)＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％；

耐药指数(RI)＝耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。

3、实验结果：

实验结果如图2所示。

人食管癌亲本细胞株EC109/pt的IC50值为4.92，耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4的IC50值为36.77μM；本发明构建的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株(耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4)对AL3818的耐药指数(RI)为7.46倍(中度耐药)。

实施例4：耐药细胞株凋亡能力分析

1、实验细胞株材料：

实施例1构建的食管癌耐药细胞株，即耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4，以及人食管癌亲本细胞株EC109/pt。

2、实验方法：

取处于对数生长期的耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4和食管癌亲本细胞EC109/pt(细胞汇合度80％-90％)，接种至6孔板中，每种细胞设置7种药物浓度(0μM、2.5μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM)，每个浓度3个复孔。将6孔板细胞培养板置于37℃，5％CO

3、实验结果：

实验结果如图3所示。随着药物浓度的增加，细胞凋亡率明显增加，耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4的凋亡率明显低于亲本细胞株EC109，并且从5μM AL3818开始耐药细胞株的凋亡率维持在“40％”之间不再增加；耐药细胞和亲代细胞对抗AL3818促凋亡的能力具有显著差异(P<0.05)。

实施例5：耐药细胞株周期测定

1、实验细胞株材料：

实施例1构建的食管癌耐药细胞株，即耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4，以及人食管癌亲本细胞株EC109/pt。

2、实验方法：

观察耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4和食管癌亲本细胞EC109/pt生长至80％细胞汇合度(对数生长期)，按照传代比例(耐药细胞1:2，亲本细胞1:3)计算所需细胞，接种至6孔板中。放置于37℃，5％CO

3、实验结果：

实验结果如图4所示。随着盐酸安罗替尼浓度的增加(0、5μM、25μM)，G

实施例6：耐药细胞株的基因突变检测

1、实验细胞株材料：

实施例1构建的食管癌耐药细胞株，即耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818-ZZ4，以及人食管癌亲本细胞株EC109/pt。

2、实验方法：

Illumina细胞全基因组高通量测序，新一代测序(NGS)技术分析全基因组，可提供所有基因组改变的碱基视图，包括单核苷酸位点变异(SNV)、插入和缺失、拷贝数变化及结构变异。

3、实验结果如图5所示：

EC109/pt细胞：重复(Duplication，DUP)9.15％；插入(Insertion，INS)14.08％；缺失(Deletion，DEL)65.49％；转置(Inversion，INV)1.41％；染色体易位(Intra-chromosomal translocations，ITX)9.86％；染色体移位(Inter-chromosomaltranslocations，CTX)0.00％。

EC109/AL3818-ZZ4细胞：重复(Duplication，DUP)8.67％；插入(Insertion，INS)14.67％；缺失(Deletion，DEL)63.33％；转置(Inversion，INV)2.67％；染色体易位(Intra-chromosomal translocations，ITX)10.67％；染色体移位(Inter-chromosomaltranslocations，CTX)0.00％。

EC109/AL3818-ZZ4细胞相比于EC109/pt细胞：重复(Duplication，DUP)8.02％；插入(Insertion，INS)0.00％；缺失(Deletion，DEL)33.02％；转置(Inversion，INV)1.18％；染色体易位(Intra-chromosomal translocations，ITX)39.39％；染色体移位(Inter-chromosomal translocations，CTX)18.40％。

测序结果说明EC109/AL3818-ZZ4细胞相对于EC109/pt细胞遗传背景已经完全发生变化，是一株新的细胞株。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。