以交替式组织培养的方式获取铜陵白姜再生苗的方法

摘要

本发明提供以交替式组织培养的方式获取铜陵白姜再生苗的方法，采用铜陵白姜作为材料，催芽制备获得0.5～1cm姜芽；在超净工作台中，取0.5～1mm茎尖外植体，依次置于四个阶段的诱导培养基中，以交替式组织培养诱导出不定芽；待不定芽长出3～5片叶片后转入生根培养基中进行生根培养。本发明极大的缩短生姜不定芽诱导时间，并提高不定芽诱导率，通过交替式组织培养的改良培养基配方，无需特殊激素，仅用6‑BA和NAA两种激素，在30天内即可获得大量再生植株，具有处理步骤简单、不定芽诱导时间短、不定芽诱导率高等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及生姜育苗技术领域，具体涉及以交替式组织培养的方式获取铜陵白姜再生苗的方法。

背景技术

生姜(Zingiber officinale Roscoe)作为一种药食两用的经济作物，在世界范围内被广泛种植；生姜以其地下根状茎供食用，内含多种营养成分，有发汗解毒、温中止吐、温肺止咳、解毒等功效。中国是生姜的主要生产国，提高生姜产量与品质对我国生姜产业的健康发展有着重要作用。铜陵白姜因姜嫩皮白而得名，品质上乘，有“中华白姜”之美誉，生姜瓣粗肥厚，姜指饱满，块大皮薄，汁多渣少，肉质脆嫩，香味浓郁，味辣而不呛口。

生姜不开花或很少开花，生产上主要依靠无性繁殖，易造成病毒和病菌积累，最终导致生姜品种种性退化，产量降低、品质下降。国内外目前尚无高抗病毒的生姜品种和高效灭杀病毒的药剂；因此采用组织培养获得脱毒生姜苗，是防治姜瘟病等病害、提高生姜产量和品质的首选方法。生姜组织培养要经过4个过程，即外植体消毒、愈伤组织诱导不定芽、不定芽增殖、再生植株生根及驯化，涉及到不同的消毒方案、不同的诱导分化培养基、不同增殖培养基、不同生根培养基等。其中，愈伤组织诱导不定芽一般需要3～6个月时间，所耗时间过长，是生姜组织再生的限速阶段，大大增加了生姜组织再生周期。

现有技术下，生姜组织培养再生方法有：《一种生姜脱毒繁育方法》(申请号CN201711001036.1)、《一种优化的生姜脱毒苗再生扩繁方法及其产业化流程的开发》(申请号CN202010741973.6)、杨松宸等发表在《分子植物育种》期刊《六盘水小黄姜脱毒快繁技术及遗传变异研究》(2017年)等。

以上参考文件记载的培养方法存在以下不足：

1、按《一种生姜脱毒繁育方法》，只用了一种浓度的培养基，未建立获取生姜脱毒苗的具体方法，获得再生不定芽所需时间约为3个月；

2、按《一种优化的生姜脱毒苗再生扩繁方法及其产业化流程的开发》，确定了最佳外植体类型，最佳消毒方法，但没有找到适合的能够最短时间内促进芽诱导的培养方法，获得再生不定芽所需时间最少为3.5个月；

3、按《六盘水小黄姜脱毒快繁技术及遗传变异研究》，仅证明了促进组培苗丛生芽生长及分化的最优激素浓度组合，获得再生植株所需时间为3～4个月，未显著缩短再生不定芽诱导时间；

以上几种生姜组培方法还存在较多缺陷，其共性问题在于未提供一种具体有效的快速获得生姜组培苗的方法；因此，目前生姜组织的培养周期仍然较长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以交替式组织培养的方式获取铜陵白姜再生苗的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

以交替式组织培养的方式获取铜陵白姜再生苗的方法，具体通过以下步骤实现：

S1、采用铜陵白姜作为材料，催芽制备获得0.5～1cm姜芽；

S2、在超净工作台中，取0.5～1mm茎尖外植体，依次置于四个阶段的诱导培养基中，以交替式组织培养诱导出不定芽；

其中：第一阶段培养周期为五天，诱导培养基一配方为：MS+6-BA9.0mg/L+NAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8；

第二阶段培养周期为五天，诱导培养基二配方为：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8；

第三阶段培养周期为五天，诱导培养基三配方为：MS+6-BA 9.0mg/L+NAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8；

第四阶段培养周期为十五天，诱导培养基四配方为：MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8；

S3、待不定芽长出3～5片叶片后，转入生根培养基中进行生根培养；

所述生根培养基配方为：MS+NAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8。

进一步地，所述步骤S1中的姜芽具体通过以下方法制备：

在铜陵白姜材料中挑选生长健壮、无病、未受冻、质地硬、健康的姜芽，放入经过高温灭菌后的基质内催芽，温度维持在25℃左右，湿度70％；

待姜芽生长至1～2cm时切下，用清水持续冲洗10min，剥去最外圈表皮至0.5～1cm后，再冲洗5min，放入超净工作台中备用。

进一步地，所述步骤S2中，在超净工作台中，取0.5～1mm茎尖外植体具体包括以下步骤：

将姜芽转入灭菌过的烧杯中，依次采用75％无水乙醇消毒30～45s、0.1％升汞消毒6min，期间不断晃动烧杯；

再用无菌水冲洗3～5次，最后放入无菌滤纸上，用无菌镊子和无菌手术刀再次剥去外圈，直至保留0.5～1mm茎尖外植体。

进一步地，将获得的茎尖外植体，按照所述S2中，分四个阶段以此进行交替培养；

进一步地，所述茎尖外植体诱导出不定芽的条件为：温度25±2℃，光照时间16h，黑暗8h，光照强度3000Lux。

由以上技术方案可知，本发明创造与现有技术相比存在以下优点和进步：

1、本发明提供了一种可以快速获得铜陵白姜组培苗的方法，获得3～5片叶片再生不定芽时间为30天内，再生效率为93％以上，极大地缩短不定芽诱导时间，并提高不定芽诱导率；

2、本发明提供了一种交替式组织培养的配方，无需特殊激素，仅用6-BA和NAA两种激素。处理步骤简单，极短时间内即可获得大量再生植株；

3、本发明选用生姜茎尖作为外植体，使用最佳消毒方式，极大的控制了污染率，使之能够更大程度的减少浪费，从而培养更加优质的组培苗。

附图说明

图1为本发明培养方法的步骤原理示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的一种优选实施方式做详细的说明。

如图1所示的快速获得铜陵白姜再生苗的培养方法，具体包括以下步骤：

S1、采用铜陵白姜作为材料，催芽制备获得0.5～1cm姜芽；

在具体的操作中，该姜芽具体通过以下方法制备：在铜陵白姜材料中挑选生长健壮、无病、未受冻、质地硬、健康的姜芽，放入经过高温灭菌后的基质内催芽，温度维持在25℃左右，湿度70％；然后待姜芽生长至1～2cm时切下，用清水持续冲洗10min，剥去最外圈表皮至0.5～1cm后，再冲洗5min，放入超净工作台中备用。

S2、在超净工作台中，取0.5～1mm茎尖外植体，依次置于四个阶段的诱导培养基中，以交替式组织培养诱导出不定芽；

在具体的操作中，在超净工作台中，取0.5～1mm茎尖外植体，包括以下步骤：将姜芽转入灭菌过的烧杯中，依次采用75％无水乙醇消毒30～45s、0.1％升汞消毒6min，期间不断晃动烧杯；然后再用无菌水冲洗3～5次，最后放入无菌滤纸上，用无菌镊子和无菌手术刀再次剥去外圈，直至保留0.5～1mm茎尖外植体。

本优选实施例中：第一阶段培养周期为五天，诱导培养基一配方为：MS+6-BA9.0mg/L+NAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8；第二阶段培养周期为五天，诱导培养基二配方为：MS+6-BA3.0mg/L+NAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8；第三阶段培养周期为五天，诱导培养基三配方为：MS+6-BA9.0mg/L+NAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH5.8；第四阶段培养周期为十五天，诱导培养基四配方为：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8；以上各阶段茎尖外植体诱导出不定芽的条件为：温度25±2℃，光照时间16h，黑暗8h，光照强度3000Lux。

S3、待不定芽长出3～5片叶片后转入生根培养基中进行生根培养；所述生根培养基配方为：MS+NAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8。

下面通过两组具体对比实施例对本发明以交替式组织培养的方式获取铜陵白姜再生苗的方法的优点和进步进行具体的阐述：

对比实施例一、不同细胞分裂素6-BA浓度对生姜芽诱导的影响

以铜陵白姜作为材料，挑选生长健壮、无病、未受冻、质地硬、健康的姜芽，放入经过高温灭菌后的基质内催芽，温度维持在25℃左右，湿度70％，待姜芽生长至1～2cm时切下，用清水持续冲洗10min，剥去最外圈表皮至0.5～1cm后，再冲洗5min，放入超净工作台中备用。

将姜芽转入灭菌过的烧杯中，用75％无水乙醇消毒30～45s，0.1％升汞消毒6min，期间不断晃动烧杯；再用无菌水冲洗3～5次，最后放入无菌滤纸上，用无菌镊子和无菌手术刀再次剥去外圈，直至保留0.5～1mm茎尖外植体；将茎尖外植体置于下述不同浓度细胞分裂素6-BA的诱导培养基中，诱导出不定芽，并进行对比分析：

1、处理1：诱导培养基配方为：MS+6-BA 9.0mg/L+NAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8。

2、处理2：诱导培养基配方为：MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8。

3、处理3：诱导培养基配方为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8。

4、处理4(CK)：诱导培养基配方为：MS+6-BA0mg/L+NAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8。

每个处理接种30个茎尖，每处理重复3次。培养条件为温度25±2℃，光照时间16h，黑暗8h，光照强度3000Lux。在茎尖外植体培养1个月及6个月时，分别统计芽诱导率，同时在培养过程中记录不定芽出现时间。

从下表1中可以看出，细胞分裂素6-BA浓度为1.0或3.0mg/L时，可以获得相对较高的不定芽率；而6-BA浓度为9.0mg/L时，不定芽诱导时间显著缩短。

表1、不同细胞分裂素6-BA浓度对生姜芽诱导的影响

不同字母表示Duncan‘s多重比较在p<0.05水平上差异显著。

对比实施例二、交替式与非交替式培养对生姜芽诱导的影响

以铜陵白姜作为材料，挑选生长健壮、无病、未受冻、质地硬、健康的姜芽，放入经过高温灭菌后的基质内催芽，温度维持在25℃左右，湿度70％，待姜芽生长至1～2cm时切下，用清水持续冲洗10min，剥去最外圈表皮至0.5～1cm后，再冲洗5min，放入超净工作台中备用。

实验组：将姜芽转入灭菌过的烧杯中，用75％无水乙醇消毒30～45s，0.1％升汞消毒6min，期间不断晃动烧杯；再用无菌水冲洗3～5次，最后放入无菌滤纸上，用无菌镊子和无菌手术刀再次剥去外圈，直至保留0.5～1mm茎尖外植体；将茎尖外植体置于下述四个阶段的诱导培养基中，诱导出不定芽：

1、第一阶段(1～5d)：将切下茎尖外植体转入诱导培养基一中培养5天；其配方为：MS+6-BA 9.0mg/L+NAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8。

2、第二阶段(6～10d)：第一阶段结束后转入诱导培养基二中继续培养5天；其配方为：MS+6-BA3.0mg/L+NAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8。

3、第三阶段(11～15d)：第二阶段结束后转入诱导培养基三中继续培养5天，其配方为：MS+6-BA 9.0mg/L+NAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8。

4、第四阶段(16～30d)：第三阶段结束后转入诱导培养基四中继续培养15天，其配方为：MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8。

每个处理接种30个茎尖，每处理重复3次。培养条件为温度25±2℃，光照时间16h，黑暗8h，光照强度3000Lux。在茎尖外植体培养1个月及6个月时统计芽诱导率，同时在培养过程中记录不定芽出现时间。

对照组：将姜芽转入灭菌过的烧杯中，用75％无水乙醇消毒30～45s，0.1％升汞消毒6min，期间不断晃动烧杯；再用无菌水冲洗3～5次，最后放入无菌滤纸上，用无菌镊子和无菌手术刀再次剥去外圈，直至保留0.5～1mm茎尖外植体；将茎尖外植体置于诱导培养基(MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％蔗糖，pH 5.8)中，诱导出不定芽。在茎尖外植体培养1个月及6个月时统计芽诱导率。

每次接种30个茎尖，3次重复。培养条件为温度25±2℃，光照时间16h，黑暗8h，光照强度3000Lux。在茎尖外植体培养1个月及6个月时，分别统计芽诱导率，同时在培养过程中记录不定芽出现时间。

从下表2可以看出：利用交替式培养方案可极显著缩短不定芽诱导时间并提高不定芽诱导率；在生姜组织培养芽诱导第一阶段使用激素，其效果不显著。

表2、交替式与非交替式培养对生姜芽诱导的影响

**表示Duncan‘s多重比较在p<0.01水平上差异极显著。

综上所述，本发明极大的缩短了不定芽诱导时间，并显著提高了不定芽诱导率，通过交替式组织培养的配方，仅用6-BA和NAA两种激素，无需特殊激素处理，步骤简单，极短时间即可获得大量再生植株；选用生姜茎尖作为外植体，使用最佳消毒方式，极大的控制了污染率，使之能够更大程度的减少浪费，从而培养更加优质的组培苗。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。