一种UPLC-MS/MS法检测血浆中利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物的方法

摘要

本发明公开了一种UPLC‑MS/MS法检测血浆中利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物（利福平、利福布汀、利福喷汀、25‑去乙酰利福平、25－O‑去乙酰利福布汀和25‑去乙酰利福喷汀）的方法。首先精密量取空白血浆，加入一系列混合标准品标准工作液，加入同位素内标标准品工作液，采用蛋白沉淀法前处理后，利用UPLC‑MS/MS进行分析，得到各样本色谱图，以待测物与内标峰面积比为纵坐标，以待测物浓度为横坐标建立标准曲线；然后精密量取待测血浆，再加入同位素内标标准品工作液，采用蛋白沉淀法前处理后，利用UPLC‑MS/MS进行分析，得到各样本色谱图，利用标准曲线计算出血浆样本的浓度。本方法操作简便快速、灵敏度、准确度和精密度高，基质效应小。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用超高效液相质谱联用技术进行的检测血浆中利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物（利福平、利福布汀、利福喷汀、利福平活性代谢物25-去乙酰利福平、利福布汀活性代谢物25－O-去乙酰利福布汀和利福喷汀活性代谢物25-去乙酰利福喷汀）的方法，可用于这6种药物的治疗药物浓度监测，属于药物动力学分析技术领域。

背景技术

利福平（rifampin RFP）、利福布汀（rifabutin RFB）、利福喷汀（RifapentineRFPT）同属于利福霉素类杀菌剂，通过抑制结核分枝杆菌的RNA聚合酶使菌体无法完成转录过程而死亡。近年来，结核病不规范治疗造成的耐药结病例数逐年递增，给结核病控制工作带来巨大挑战。研究显示，治疗两个月末痰菌未阴转的肺结核患者中，利福平的耐药率高达45%且单独使用时可迅速产生耐药。利福平耐药被认为是耐多药的重要标志。利福霉素衍生物—利福布汀、利福喷汀诞生了，以其低耐药率、高效价、不良反应发生率低等优点受到广泛关注。

利福布汀被批准用于预防和治疗HIV 感染者鸟分枝杆菌-胞内分枝杆菌复合体的广泛播散性感染，也用于多重耐药结核病的治疗。药代动力学方面，利福布汀具有极强的膜穿透力，较利福平强3-5倍，这使得利福布汀在临床应用的过程中能够迅速地渗透病灶，从而发挥其优良胞内杀菌活性。此外，利福布汀在体内能够广泛分布于各器官及组织细胞中。利福布汀在组织细胞中的浓度远高于血浆中的含量，其在胆道浓度可达血药浓度的300-500倍。利福布汀在体内消除较为缓慢，血浆半衰期约为利福平的13倍，具有更高、更持久的效价及药理活性。对于肝功能轻度损害及肾功能不全的患者，利福布汀的药代动力学过程几乎不受影响；对于肝功能严重损害的患者，AUC明显增大。利福喷汀的蛋白结合率高达98%以上，在组织中停留时间较长, 消除半衰期为较利福平的4-5倍，是一种长效抗结核药物，给药次数较少。

利福霉素类药物经由细胞色素P450代谢转化为具有药理活性的代谢物25-去乙酰利福平、25-去乙酰利福喷汀、25-O-去乙酰利福布汀。抗结核药物因其治疗窗窄，需要检测其血药浓度，从而抗结核药物的临床合理用药提供关键依据。然而目前临床上对利福霉素类药物的检测仍集中于主药的检测，基于代谢物具有药理活性，因此对利福霉素类药物活性代谢产物的检测也亟待开发。目前已有的利福霉素类及其代谢产物的联合检测方法仅在2015年有相关报道，但该方法存在诸多问题：如前处理时间过长（80分钟）难以满足临床样品快速检测的需求；而且该方法没有真正实现利福霉素类药物及其活性代谢物的同时检测，利福布汀及其代谢物是需要单独进样。因此急需开发前处理简单且分析时间短的检测方法，以满足临床检测的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，建立一种前处理简单、快速、灵敏、准确度和精密度高的超高效液相色谱质谱联用（UPLC-MS/MS）检测血浆中利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物（利福平、利福布汀、利福喷汀、利福平活性代谢物25-去乙酰利福平、利福布汀活性代谢物25－O-去乙酰利福布汀和利福喷汀活性代谢物25-去乙酰利福喷汀）的方法，满足临床应用利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物浓度检测的需要和目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种LC-MS/MS法同时检测血浆中利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物的方法，所述利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物为利福平、利福布汀、利福喷汀、利福平活性代谢物（25-去乙酰利福平）、利福布汀活性代谢物（25－O-去乙酰利福布汀）和利福喷汀活性代谢物（25-去乙酰利福喷汀），所述方法包括如下步骤：

S1.标准工作液配制

分别精密称取3种利福霉素抗结核药物标准品、3种利福霉素抗结核药物活性代谢物及同位素内标粉末，分别用甲醇溶解并稀释成标准工作液；所述同位素内标包括：利福平-d

S2.标准曲线建立

精密量取空白血浆，加入混合利福霉素类药物及其活性代谢产物标准工作液，以及混合同位素内标标准工作液，采用蛋白沉淀方法前处理，后利用UPLC-MS/MS进行分析，得到各样本色谱图，以待测物峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，以待测物浓度为横坐标建立标准曲线；

S3.待测样本检测

S31.待测样本血浆前处理：精密量取待测血浆，加入混合同位素内标标准工作液，进行蛋白沉淀方法前处理；

S32.利用UPLC-MS/MS进行分析，得到各样品的色谱图，利用标准曲线计算出样本血浆中药物浓度；

步骤S2或S32中，所述UPLC-MS/MS的色谱流动相设定如下：A（水相）：0.1% 甲酸水溶液，B（有机相）：0.1% 甲酸乙腈；

实验发现只有在该色谱流动相设定条件下，才能达到较好的检测效果。

通常，步骤S2或S31所述蛋白沉淀方法前处理的所用试剂为乙腈。

优选的，步骤S2中所述蛋白沉淀方法前处理的方法为：样本加入混合同位素内标标准工作液，再加入5倍体积的乙腈，涡旋震荡0.8~1.5min后，低温离心，取出全部上清，即为供试品溶液，用UPLC-MS/MS进样分析。

其中，所述涡旋震荡的时间为0.8~1.5（优选为1 min）。

优选地，所述离心为12000 r/min，离心温度为4℃，离心5min。

具体的，步骤S2中所述混合同位素内标标准工作液的体积为血浆和混合抗结核药物标准工作液总和的1/10。

优选的，步骤S2或S32中所述UPLC-MS/MS的色谱条件为：流速0.3 mL/min；进样量10 μL；柱温40℃；进样室温度4℃。

优选的，步骤S2或S32所述UPLC-MS/MS的色谱柱为Inertsil HILIC ( 2.1 mm ×150 mm, 3 μm)。

步骤S1中利福霉素类药物及其活性代谢产物的标准工作液的配制方法具体为：各精密称取五种利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物，用甲醇溶解为高浓度标准储备液，再用甲醇梯度稀释，配制成一系列的标准工作液。标准储备液存于-20℃冰箱。

所述一系列浓度的混合标准工作液的浓度分为8个浓度点（SA-SH），具体如下：

步骤S1中同位素内标的标准工作液的配制方法具体为：各精密称取4种同位素内标，用甲醇溶解为高浓度标准储备液，临用时用甲醇稀释，配制成标准工作液。标准储备液存于-20℃冰箱。

所述的质控样本的浓度为4个浓度点（包括QC高浓度-QH、QC中浓度-QM、QC低浓度-QL、定量下限LLOQ）具体浓度如下：

所述的混合同位素内标的标准工作液为：利福平-d

优选地，在上述UPLC-MS/MS分析方法中，采用ESI源离子化；利福霉素类药物、活性代谢产物及同位素内标的分子离子和碎片离子的质谱参数见下表；

更优选地，在步骤S2或S32所述UPLC-MS/MS的色谱柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ C18（2.0 mm ×50 mm，1.6 μm）前连接预柱Pre-column C18 (2.1×10 mm，2.0 μm)。

本发明所用水溶液均为超纯水，所用有机试剂均为HPLC级。

本发明的显著优点在于：

1、本发明建立了一种前处理简单、快速、灵敏度高、准确度和精密度高的超高效液相色谱质谱联用（UPLC-MS/MS）检测血浆中利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物（包括利福平、利福布汀、利福喷汀、利福平活性代谢物25-去乙酰利福平、利福布汀活性代谢物25－O-去乙酰利福布汀和利福喷汀活性代谢物25-去乙酰利福喷汀）浓度的方法，本发明由于对样本前处理进行了合理优化，且采用同位素内标来克服药物在血浆中的基质效应，提供了高效稳定的血浆样本前处理方法，处理时间短，基质效应小。

2、同时，本发明对色谱条件进行了合理调整，使得采用本发明的方法所得的待测物和内标色谱图稳定可靠，本发明提供的检测技术灵敏度高，分析时间短且准确度和精密度高，可更好的达到利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物临床治疗药物检测的目的。

附图说明

图1为利福平的二级质谱图。

图2为利福布汀的二级质谱图。

图3为利福喷汀的二级质谱图。

图4为利福平活性代谢物25-去乙酰利福平的二级质谱图。

图5为利福布汀活性代谢物25－O-去乙酰利福布汀的二级质谱图。

图6为利福喷汀活性代谢物25-去乙酰利福喷汀的二级质谱图。

图7为利用Shim-pack XR-ODS Ⅲ C18色谱柱，在设定的色谱条件下的利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物的色谱图。

图8为本发明建立的测定人血浆中利福霉素及其活性代谢产物（包括利福平、利福布汀、利福喷汀、利福平活性代谢物25-去乙酰利福平、利福喷汀活性代谢物25-去乙酰利福喷汀、利福布汀活性代谢物25－O-去乙酰利福布汀）的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

文中所述的UPLC-MS/MS为超高效液相色谱质谱联用技术的简称。

本发明提供的检测利福平、利福布汀、利福喷汀、利福平活性代谢物（25-去乙酰利福平）、利福喷汀活性代谢物（25-去乙酰利福喷汀）、利福布汀活性代谢物（25－O-去乙酰利福布汀）的方法，采用液相色谱-质谱联用法进行检测，既结合了液相色谱仪有效分离不同化合物的分离能力，又结合质谱仪很强的组分鉴别能力，能够有效分离和鉴别待测生物样本中3中利福霉素类药物及其代谢物，血样用量少，分析时间短，灵敏度高；通过采用50mm的C18色谱柱，使得6种待测物的色谱峰峰形较好，不会出现拖尾和分叉，待测物色谱峰和干扰峰可以有效地分离。该检测方法可应用于血浆中利福霉素及其活性代谢物的定性或定量检测，为研究利福霉素及其活性代谢产物的药物浓度于疗效之间的关系及利福霉素药物治疗药物浓度范围的重新定义奠定了技术基础。

进一步地，本发明所述采用利福平、利福布汀、利福喷汀、利福平活性代谢物（25-去乙酰利福平）、利福喷汀活性代谢物（25-去乙酰利福喷汀）、利福布汀活性代谢物（25－O-去乙酰利福布汀）标准品配制混合标准曲线定量，包括：以所述待测物的浓度为横坐标，所述待测物与内标峰面积比为纵坐标，以1/x2 为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，建立标准曲线回归方程；将所述待测生物样本中待测物和内标物的峰面积的比值代入所述标准曲线回归方程，计算所述待测生物样本中待测物的浓度。

进一步地，本发明所述对待测生物样本进行预处理，包括：在待测生物样本中加入内标物工作液，再加入乙腈沉淀蛋白，离心，取离心后的上层澄清液体作为待测液。现有技术中多采用步骤繁琐的固相萃取和液液萃取对待测生物样本进行处理，本发明采用乙腈蛋白沉淀法对待测生物样本进行预处理，前处理过程较简单，便于操作，安全且样本用量少，整个实验成本低。

进一步地，本发明所述质谱条件包括：离子源：电喷雾ESI，扫描方式：多反应监测，离子化方式：正离子；所述离子源的参数设置如下：碰撞气CAD：6～10psi，气帘气CUR：30～50psi，离子源Gas1：40～60psi，离子源Gas2：40～60psi，离子喷雾电压IS：5000～6000v，离子源温度TEM：450～650℃；所述利福霉素抗结核药物及其活性代谢产物的二级质谱图，如图1～6。

实施例1：

分别采集3份来自接受包含利福霉素类药物抗结核治疗方案的感染结核杆菌的患者血浆样本，命名为样品1、样品2、样品3。

（1）a.标准品处理：

取90μL空白血浆，加10μL不同浓度混合标准溶液，涡旋混匀后，加10μL混合同位素内标工作液，再加入500 μL乙腈，涡旋1 min，12000 r/ min 离心5 min；吸取上清液，用0.45μm过滤器过滤得供试品溶液；取上清10μL进行分析，记录色谱图（图7）；

利福平、利福平活性代谢物（25-去乙酰利福平）的定量系列浓度均为：25，50，100，200，300，400，600，800ng/mL；

利福布汀的定量系列浓度为：10，20，40，80，120，160，240，320ng/mL，

利福布汀活性代谢物（25－O-去乙酰利福布汀）的定量系列浓度为：5，10，20，40，60，80，120，160ng/mL；

利福喷汀、利福喷汀活性代谢物（25-去乙酰利福喷汀）的定量系列浓度均为：50，100，200，400，600，800，1200，1600ng/mL。

b. 标准曲线的制备

以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，用加权（W=1/x

（2）按以下相同的处理方法处理3份样品：取100μL血浆样品加入空白血浆300μL，将血浆样品稀释4倍后，取100μL稀释后的样品加10μL混合同位素内标工作液，再加入500 μL乙腈，涡旋1 min，12000 r/ min离心5 min；吸取上清液经由0.45μm过滤器过滤得供试品溶液；取上清10μL进行分析。按照发明内容中的条件对样品中的利福霉素及其活性代谢物上样检测，根据图8的标准曲线和表1中的线性范围计算各成分的含量，结果见表2。

表2：血浆样本中各成分含量测定

实施例2：

（1）基质效应检测

取90μL空白血浆，加10μL不同浓度混合标准溶液，涡旋混匀后，加10μL混合同位素内标工作液，再加入500 μL乙腈，涡旋1 min，12000 r/ min 离心5 min；吸取上清液由0.45μm过滤器过滤得供试品溶液；平行配置6份，取上清10μL进行分析。

用50-60%乙腈水溶液配制低、高两个浓度的工作液（即同发明内容中质控样本中各化合物对应的浓度），平行配置6份，取10μL进行分析，结果见表3。

表3：蛋白沉淀实验方法的基质效应

从表3可以看出，由于使用了一一对应的同位素内标进行校正，各分析物在本研究的最佳分离分析方法下，内标校正基质效应均约为100%，且变异系数也在FDA对此类分析方法规定的±15%的范围之内。

（2）提取回收率检测

取90μL空白血浆，加10μL不同浓度混合标准溶液，涡旋混匀后，加10μL混合同位素内标工作液，再加入500 μL乙腈，涡旋1 min，12000 r/ min离心5 min；吸取上清液由0.45μm过滤器过滤得供试品溶液；平行配置6份，取上清10μL进行分析。

取90μL空白血浆，加入500 μL乙腈，涡旋1 min，12000 r/ min 离心5 min；吸取全部上清液于另一干净1.5 mL离心管中，再加入10μL不同浓度混合标准溶液和10μL混合同位素内标工作液，涡旋混匀后，0.45μm过滤器过滤得提取后工作液；平行配置6份，取上清10μL进行分析。结果见表4。

表4：蛋白沉淀实验方法的回收率

由表4可以看到，各分析物在本研究的最佳分离分析方法下，提取回收率稳定。能很好的满足临床样本的分析。

以上对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围，凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围内。