一种注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的二维检测方法

摘要

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的二维检测方法。所述方法为取注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠配制供试品溶液，进行高效液相色谱‑质谱联用(HPLC‑UV‑MS)检测，在一维色谱分离出注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠的三个杂质，在二维色谱条件下对注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中的杂质进行二次分离，方法定性、定量准确度高，重现性好，专属性强。

说明书

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的二维检测方法。

背景技术

头孢哌酮钠舒巴坦钠是由辉瑞公司开发上市的广谱抗生素，最早于1986年在日本上市，1996年在中国上市，截止2021年，注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠已在国内多家企业上市并用于治疗感染，临床疗效良好。广泛用于敏感菌所致的呼吸道感染、泌尿道感染、腹膜炎、胆囊炎、胆管炎和其他腹腔内感染、败血症、脑膜炎、皮肤软组织感染、骨骼及关节感染、盆腔炎、子宫内膜炎、淋病及其他生殖系统感染。

头孢哌酮钠舒巴坦钠化学名称为(6R，7R)-7-{(2R)-2-[((4-乙基-2,3-二氧杂哌嗪-1-羰基)氨基)-2-](4-羟基苯基)乙酰氨基}-3-(1-甲基-1氢-四唑-5-基硫烷基甲基)-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯钠，其结构式为：

注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠适用于治疗特定微生物敏感菌株引起的感染。临床应用广泛，如呼吸道感染、耳鼻喉感染及泌尿系统感染等，安全性方面，注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠具有致敏性。其致敏强度与聚合物杂质含量有一定关系，检索国内外文献及专利，主流的控制方式为G10色谱柱法和TSK色谱柱法两种方式，但这两种方式均存在局限性，G10色谱柱法，聚合物与主成分的分离度不佳，方法重现性较差，TSK色谱法中部分小分子杂质在主峰前出锋，导致聚合物测定结果大于其实际含量。

检索国内外文献，未检索到本发明杂质二维检测方法的相关报道。本领域缺少可准确定性、定量且重新性好的注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中聚合物杂质的分离检测方法。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的二维检测方法，该方法可同时满足定性、定量分离检测杂质的要求，并且重现性好，准确度高。

本发明检测出了注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中的杂质1、杂质2和杂质3。其中，杂质1，保留时间3.81min，分子量为429.24045；杂质2，保留时间8.64min，分子量为650.07422；杂质3保留时间9.91min，分子量为955.17865。推测杂质1和杂质2是小分子，杂质3是聚合物。

具体来说，本发明提供了如下技术方案。

一种注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的二维检测方法，其包括以下步骤：

1)配制供试品溶液：称取注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠，配制成供试品溶液；

2)取上述供试品溶液，注入液相色谱仪，采用如下的一维色谱条件，进行一维色谱检测；

其中，所述一维色谱条件为：

色谱柱：TSKgel G20SWXL凝胶色谱柱；

流动相A：磷酸盐缓冲液，为磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液混合液，比例为：(62～64)：(38～36)，pH调节为6.5～7.5；

流动相B：乙腈；

流动相洗脱方式为：等度洗脱；

3)在步骤2)中一维色谱条件下，将供试品溶液中的杂质与主成分头孢哌酮钠舒巴坦钠完全分离，将杂质收集在收集环中；

4)将上述杂质，切换进入液相色谱和质谱联用仪中，进行二维色谱检测，得到二维杂质；

其中，所述二维色谱条件为：

色谱柱以辛烷基键合硅胶为填充剂；

流动相A：乙酸铵水溶液，pH调节为4.5～6.3；

流动相B：乙腈；

流动相洗脱方式：梯度洗脱；

其中，所述方法检测注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠以下杂质中的1种或多种，所述步骤3)中，杂质的收集条件为：

其中，切换阀6-1检测液不进入检测器，具体的，检测液进入废液系统；切换阀1-2检测液进入检测器，进行质谱检测。

在一些实施方案中，其中，所述步骤3)收集环的数量至少为3个。

在一些优选的实施方案中，其中，所述方法一维色谱条件中，TSKgel G20SWXL凝胶色谱柱的型号为7.8mm×300mm，5.0μm。

在一些优选的实施方案中，其中，所述一维色谱条件中，流动相A中磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液的体积比为63：37。

在一些优选的实施方案中，其中，所述一维色谱条件中，所述流动相A的pH为7.0。

在一些实施方案中，其中，所述二维色谱条件中，色谱柱类型为Aclaim C8色谱柱；优选的，型号为2.1mm×500mm，2.0μm。

在一些实施方案中，其中，所述二维色谱条件中，流动相A浓度为4.5～6.0mM，优选为5.5mM。

在一些实施方案中，其中，所述二维色谱条件中，流动相A的pH为5.5。

在一些实施方案中，其中，所述二维色谱条件中，梯度洗脱的程序为：

。

在一些实施方案中，其中，所述一维色谱条件中，所述流动相A与流动相B体积比为(95～99)：(5～1)，运行时间为20～40min；

优选的，所述流动相A与流动相B体积比为99：1，运行时间为30min。

在一些实施方案中，其中，所述一维色谱条件和/或二维色谱条件的检测波长为220～230nm；优选的，检测波长为226nm。

在一些实施方案中，其中，所述一维色谱条件中，所述流动相的流速为0.4～0.8mL/min，优选为0.6mL/min；

所述二维色谱条件中，所述流动相的流速：0.2～0.4mL/min，优选为0.3mL/min。

在一些实施方案中，其中，所述一维色谱条件和/或二维色谱条件的柱温为25～30℃，优选为25℃。

在一些实施方案中，其中，所述二维色谱条件中，质谱条件鞘气压力为30～40arb，优选为35arb。

其中“arb”约等于0.3L/min。

在一些优选的实施方案中，其中，所述二维色谱条件中，质谱条件进一步包括以下：

在一些优选的实施方案中，其中，所述二维色谱条件中，扫描模式为：

。

在一些优选的实施方案中，其中，二维杂质分别为：

二维杂质1分子量为429.24045，保留时间为3.81min，碎片信息为279.15881～2914.29932；

二维杂质2分子量为650.07422，保留时间为8.64min，碎片信息279.15887～2840.85083；

二维杂质3分子量为955.17865，保留时间为9.91min，碎片信息279.15881～2865.31274。

在一些实施方案中，

所述步骤1)中，还包括：

配制对照品溶液：取头孢哌酮钠对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中含5μg的溶液，作为对照品溶液；

所述步骤2)中，注入液相色谱仪的还包括对照溶液；

还包括：

5)供试品溶液色谱图中如有杂质峰，相对保留时间在9.0～10.5间的杂质峰面积不得大于对照溶液主峰头孢哌酮钠面积。

在一些实施方案中，

所述步骤1)中，还包括：

配制灵敏度溶液：精密量取对照溶液1mL，用流动相定量稀释制成每1mL中含0.06μg的溶液，作为灵敏度溶液；

所述步骤2)中，注入液相色谱仪的还包括灵敏度溶液。

所述步骤5)中，供试品溶液色谱图中小于灵敏度溶液主峰头孢哌酮钠面积的峰忽略不计。

本发明所取得的有益效果如下：

本申请提供了一种头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的二维检测方法，可同时实现注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的定性和定量研究。本申请首次检测出了注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中的杂质1、杂质2和杂质3。其中，杂质1，保留时间3.81min，分子量为429.24045；杂质2，保留时间8.64min，分子量为650.07422；杂质3保留时间9.91min，分子量为955.17865。推测杂质1和杂质2是小分子，杂质3是聚合物。所述方法定性、定量准确度高，重现性和专属性良好。

附图说明

图1为本发明实施例1的杂质1二维色谱定性谱图；

图2为本发明实施例1的杂质2二维色谱定性谱图；

图3为本发明实施例1的杂质3二维色谱定性谱图；

图4为本发明实施例1杂质的一维谱图；

图5为本发明实施例2色谱柱为Cef-SEC亲水硅胶时，杂质的一维谱图；

图6为本发明实施例3流动相A的体积比为62：38时，杂质的一维谱图；

图7为本发明实施例4流动相A的pH为6.0时，杂质的一维谱图；

图8中上图为本发明实施例1的一维杂质谱图，中间图为一维杂质谱图中杂质3特征峰对应的二维谱图，下图为二维谱图中保留时间为9.91min特征峰对应的质谱图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明使用的液相色谱仪主要配备紫外及质谱/质谱(MS/MS)检测器。

实施例1：专属性试验

1-1.溶液配制：

空白溶剂：水。

供试品溶液：取注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含主成分头孢哌酮钠0.5mg的溶液，作为供试品溶液。

系统适用性溶液：取注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠原料适量(高温60℃，30天)，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含主成分头孢哌酮钠0.5mg的溶液，作为系统适用性溶液。

1-2.色谱条件：

一维色谱条件：

色谱柱：TSKgelG20SWXL(7.8mm×300mm，5.0μm)；

流动相A：磷酸盐缓冲液(pH7.0)，磷酸氢二钠溶液-磷酸二氢钠溶液，体积比为63：37；

流动相B：乙腈；

柱温：25℃；

流动相：流动相A：流动相B＝99：1；

流速：0.6mL/min；

洗脱方式：等度洗脱；

运行时间：30min；

检测波长：226nm。

二维色谱条件：

色谱柱：Aclaim C8(2.1mm×500mm，2.0μm)；

流动相A：5.5mM乙酸铵水溶液(pH为5.5)；流动相B：乙腈；

柱温：25℃；

检测波长：226nm；

流动相洗脱方式为：梯度洗脱；

梯度洗脱程序为：

质谱条件：

检测条件为：

扫描模式为：

比例阀切换次数为3次；其中杂质的收集条件为：

如图1～图3所示的二维谱图结果，杂质1分子量为429.24045，保留时间为3.81min，碎片信息为279.15881～2914.29932；

杂质2分子量为650.07422，保留时间为8.64min，碎片信息279.15887～2840.85083；

杂质3分子量为955.17865，保留时间为9.91min，碎片信息279.15881～2865.31274。

1-3.实验步骤及结论：

精密量取上述溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，收集杂质1、杂质2和杂质3，进行一维色谱检测；然后将上述杂质1、杂质2和杂质3，切换进入液相色谱和质谱联用仪中，进行二维色谱检测和质谱检测，结果见下表。

结论：对空白溶剂进行检测，发现其基线平稳，没有出现特征峰，表明空白溶剂对头孢哌酮钠舒巴坦钠的测定不产生干扰；

由供试品溶液和系统适用性检测结果(质谱定性谱图见图1～3)，发现一维谱图主峰前各杂质分离度均>1.5，可实现完全分离；二维谱图的各杂质峰成分单一，各杂质之间分离度均>1.5，可实现完全分离，分离度良好，该方法专属性良好。

实施例2：一维色谱条件：色谱柱的选择

2-1.溶液配制：

供试品溶液：取注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含主成分头孢哌酮钠0.5mg的溶液，作为供试品溶液。

2-2.测试条件：

改变一维色谱条件色谱柱的类型：

将实施例1色谱柱：TSKgelG20SWXL(7.8mm×300mm，5.0μm)；

更换为，

色谱柱：Cef-SEC亲水硅胶(7.8mm×300mm，5.0μm，150A，Sepax)；

其他测试条件同实施例1。

2-3.实验步骤及结论：

精密量取上述溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图和结果，结果见下表。

结论：使用本发明实施例1的凝胶色谱柱，TSKgelG20SWXL(7.8mm×300mm，5.0μm)对供试品溶液进行分离时(图4)，分离度>1.5，杂质3峰型良好，分离度良好；

相同条件下，采用Cef-SEC亲水硅胶色谱柱(7.8mm×300mm，5.0μm，150A，Sepax)(图5)，各杂质的峰型差，分离度差，无法实现各杂质分离。

实施例3：一维色谱条件：流动相A体积比的选择

溶液配制同实施例2。

改变一维色谱条件中流动相A的磷酸氢二钠与磷酸二氢钠体积比：

实施例1：体积比为63：37；

方法1：体积比为62：38；

方法2：体积比为64：36；

方法3：体积比为61：39；

方法4：体积比为65：35；

其他测试条件同实施例1。

精密量取上述溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图和结果，结果见下表。

结论：采用流动相A体积比在(62～64)：(38～36)(图6)对供试品溶液进行分离，分离度>1.5，分离度良好；

实施例3方法3采用流动相A体积比为61：39，分离度差；

实施例3方法4采用流动相A体积比为65：35，杂质3位于主峰前沿，包裹到主峰中，无法分离；

因此，流动相A体积比在(62～64)：(38～36)时，分离效果良好；流动相A体积比为63：37时，杂质3峰型良好，分离效果最好。

实施例4一维色谱条件：流动相A的pH的选择

溶液配制同实施例2。

改变一维色谱条件中流动相A的pH：

实施例1：pH为7.0；

方法1：pH为6.5；

方法2：pH为7.5；

方法3：pH为6.0；

方法4：pH为8.0；

其他测试条件同实施例1。

精密量取上述溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图和结果，结果见下表。

结论：采用流动相A的pH范围在6.5～7.5时，各杂质分离度>1.5，分离效果良好；

实施例4方法3～4采用流动相A的pH为6.0(图7)和8.0，各杂质分离度<1.0，分离度差；

因此，流动相A的pH范围在6.5～7.5时，分离效果良好；流动相A的pH为7.0时，各杂质分离度>1.5，杂质3峰型良好，分离效果最好。

实施例5：二维色谱条件：色谱柱的选择

溶液配制同实施例2。

改变二维色谱条件的色谱柱的类型：

将实施例1色谱柱：Aclaim C8(2.1mm×500mm，2.0μm)；

更换为，

色谱柱：Caprisil C8(4.6mm×150mm，5.0μm)；

其他测试条件同实施例1。

精密量取上述溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图和结果，结果见下表。

结论：使用本发明实施例1的凝胶色谱柱，Aclaim C8(2.1mm×500mm，2.0μm)对供试品溶液进行分离时，分离度>1.5，杂质3峰型良好，分离度良好；

相同条件下，采用其他色谱柱(例如，实施例5)，各杂质的峰型差，分离度差，无法实现各杂质分离。

实施例6二维色谱条件流动相A的pH的选择

溶液配制同实施例2。

改变二维色谱流动相A的pH：

实施例1：二维色谱条件流动相A的pH为5.5；

方法1：流动相A的pH为4.5；

方法2：流动相A的pH为6.3；

方法3：流动相A的pH为4.0；

方法4：流动相A的pH为6.5；

其他测试条件同实施例1。

精密量取上述溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图和结果，结果见下表。

结论：二维色谱条件采用流动相A的pH在4.5～6.3时，二维色谱的峰型良好，各杂质分离度>1.5，分离度良好；

实施例6方法3～4采用流动相A的pH在5.0和6.5，各杂质分离度<1.0，峰型差，分离效果不好；

因此，二维色谱的流动相A的pH在4.5～6.3时，各杂质分离效果良好；流动相A的pH在5.5(图8)时，各杂质分离度>1.5，杂质3峰型良好，分离效果最好。

实施例7收集条件的选择

溶液配制同实施例2，改变步骤3)中杂质的收集条件：

将实施例1步骤3)中杂质的收集条件：

更改为：

其他测试条件同实施例1。

精密量取上述溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图和结果，结果见下表。

结论：采用实施例1所述收集条件，二维色谱的各杂质分离度>1.5，杂质3峰型良好，分离度良好；

采用其他收集条件(例如，实施例7)，色谱图未出现组分特征响应，无法收集到上述杂质。

实施例8灵敏度测试

灵敏度测试溶液：取注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠原料适量，精密称定，稀释至信/噪比(S/N)＝10：1及信/噪比(S/N)＝3：1，作为方法的定量限及检测限测试溶液。

测试条件同实施例1。

精密量取上述溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录一维色谱图和结果，结果见下表。

结论：杂质3灵敏度以头孢哌酮钠计，定量限低至0.06μg/mL，检测限低至0.03μg/mL，远低于杂质检测限的限度标准(2.5μg/mL)，方法灵敏度高。

实施例9重复性测试

对照溶液：取头孢哌酮钠对照品适量(高温60℃，30天)，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含主成分5μg的溶液，作为1％自身对照溶液。

供试品溶液(重复性测试溶液)：取注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠原料适量(高温60℃，30天)，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含主成分头孢哌酮钠0.5mg的溶液，平行配制六份，记作样1～6。

计算公式：杂质3含量(％)＝(A

式中，A

测试条件同实施例1。

精密量取上述溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录一维色谱图和结果，结果见下表。

结论：通过重复性测试，杂质3的平均含量为0.5％，远低于杂质限度标准(<1.0％)，RSD为1.2％，远低于杂质测定标准要求(<2.0％)，采用此方法的重复性良好。

实施例10稳定性测试

稳定性测试溶液：取注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠原料适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含主成分头孢哌酮钠0.5mg的溶液，作为稳定性测试溶液。

测试条件同实施例1。

精密量取上述溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录一维色谱图和结果，结果见下表。

结论：供试品稳定性考察结果显示，在16h内头孢哌酮钠舒巴坦钠的杂质3的峰面积变化明显，远大于稳定性限度标准(<10％)，表明16h内的供试品溶液稳定性差，需临用新制。

实施例11杂质3中二聚体的定量测定

溶液配制：

对照品溶液：取头孢哌酮钠对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含头孢哌酮钠5μg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液：取注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含主成分头孢哌酮钠0.5mg的溶液，作为供试品溶液。

测试条件同实施例1。

计算公式：

二聚体含量(％)＝[A

式中，

A

A

C

C

实验步骤及结论：

精密量取上述溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图和结果，经计算得到注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中二聚体的含量见下表。

实施例12二聚体的结构分析

头孢哌酮聚合物合成路线为：由头孢哌酮酸和7-氨基-3-(1,2,3-三唑-4-硫代)甲基-头孢环-4-羧酸(7-TACA/头孢哌酮杂质D)反应生成二聚体头孢哌酮双母核；

反应过程如下所示：

在此基础上，结合图3中，QE-PLAS高分辨质谱正离子检测显示该聚合物的元素组成为C

从上图虚线标示所示的C-S键处断裂，[M+H]

对比例1

对比文件1：冀峰，赵辰辰，高慧等。在线体积排阻色谱-反相液相色谱-飞行时间质谱法鉴定注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中聚合物杂质[J]。中国药学杂志，2021，56(2)：7。

本申请和对比文件测试条件对比

二维条件下本申请和对比文件杂质对比

采用对比文件1的检测条件和方法对实施例1中注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠的供试品溶液和系统适用性溶液中的杂质进行检测。由测试结果可知，采用对比文件1的方法无法检测分离出本申请收集条件为如下参数的3种杂质：

因此，对比文件1的方法无法适用于本申请注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的检测。

采用对比文件1方法对实施例10中稳定性测试溶液进行测定，控制进样量为10μL，对对比文件1中的杂质进行检测，其中一维色谱图检测，其中，相同条件下，对比文件1中聚合物(峰6～峰9)的峰面积的变化值，均显著高于实施例10中杂质3(二聚体)的峰面积变化值。经上述稳定性考察结果显示，本发明方法测定头孢哌酮钠舒巴坦钠的杂质的稳定性显著优于对比文件1方法。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。