链间二硫键CysA24-CysB23替代为硫醚键的H2 Relaxin衍生物

摘要

本发明公开了一种链间二硫键CysA24‑CysB23替代为硫醚键的H2Relaxin衍生物及其合成方法，其中H2Relaxin衍生物的结构式如下所示：。本发明首先借助二氨基二酸分子，通过N‑芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成方法单次固相合成链间二硫键CysA24‑CysB23替代为硫醚键的H2Relaxin衍生物的折叠复性前体。然后通过一步氧化折叠复性高效获取链间二硫键CysA24‑CysB23替代为硫醚键的H2Relaxin衍生物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种链间二硫键Cys

背景技术

多肽具有高活性、高选择性和低毒性等特点，可以作为激素、神经递质、生长因子、离子通道配体等发挥重要调控作用，具有非常重要的临床药用价值。例如治疗糖尿病的胰岛素，促进分娩的催产素，以及治疗铁代谢紊乱的铁调素等。

H2 Relaxin是胰岛素超家族成员，是含有53个氨基酸的异源二聚体多肽，具有两对链间二硫键(Cys

下面是现有技术中H2 Relaxin及其衍生物的化学合成方法：

文章(J.Biol.Chem.1991,266:10754-10761.)报道了基于正交巯基保护的二硫键顺序构建策略。首先分别合成含有两对正交巯基保护基的A链和B链，通过连续的二硫键氧化与正交巯基脱保护完成折叠复性，最终获得H2 Relaxin衍生物。该方法需要多步化学反应及多次分离纯化，复杂、耗时且低效。

文章(J.Pept.Sci.2017,23,455-465)报道了模拟天然单链的合成策略。首先分别合成氮端带有醛基官能团的

文章(Chem.Sci.,2016,7,3805-3819)报道化学合成H2 Relaxin的B链单链衍生物。通过 Fmoc固相合成即可简单、高效地获取B7-33。但由于与全长H2 Relaxin存在较大的序列、结构差异，B7-33表现出较差的活性。

发明内容

本发明针对上述现有技术所存在的不足，提供了一种链间二硫键Cys

本发明链间二硫键Cys

本发明链间二硫键Cys

步骤1：化合物Ⅰ的合成

1a、取0.1mmol的Rink Amide AM树脂(取代度为0.32mmol/g)，加入5mL二氯甲烷(DCM) /N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液(体积比1:1)，使树脂溶胀，溶胀时间为30分钟，利用隔膜泵作为动力源，将混合溶液抽干，得到溶胀好的树脂；

1b、以标准的Fmoc固相多肽合成方法(5倍当量的Fmoc氨基酸，5倍当量的6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)和10倍当量的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，下述制备过程中其它原料添加的当量均是相对于树脂的摩尔量倍)进行氨基酸缩合，在1a树脂上依次连接Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH，获得化合物Ⅰ；

步骤2：化合物Ⅱ的合成

2a、向1b树脂中加入2mL含有20％哌啶的DMF溶液反应5分钟，之后再依次用DMF、DCM和DMF分别冲洗三次；重复上述步骤(反应10分钟)，完成Fmoc的脱除；

2b、向2a树脂中加入1mL溶有相对于树脂的2倍当量的假二肽Fmoc-Ser(tBu)-Thr(Psi(Me, Me)Pro)-OH和缩合试剂的DMF溶液，使假二肽裸露的羧基和2a树脂裸露的氨基发生缩合反应，放入常温摇床中振荡反应12小时，获得化合物Ⅱ；

步骤2b中，所述缩合试剂为(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAop)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)和N-甲基吗啡啉(NMM)，试剂配比如下：2 倍摩尔量的PyAop、2倍摩尔量的HOAt、4倍摩尔量的NMM。

步骤3：化合物Ⅲ的合成

以标准的Fmoc固相多肽合成方法进行氨基酸缩合，在2b树脂上依次连接Fmoc-Met-OH、 Fmoc-Gly-OH，获得化合物Ⅲ；

步骤4：化合物Ⅳ的合成

4a、向步骤3树脂中加入2mL含有20％哌啶的DMF溶液反应5分钟，之后再依次用DMF、 DCM和DMF分别冲洗三次；重复上述步骤(反应10分钟)，完成Fmoc的脱除，裸露出氨基；

4b、向4a的树脂中加入含2倍当量的二氨基二酸分子和缩合试剂的DMF溶液1mL，使预先合成的二氨基二酸分子裸露的羧基和4a树脂裸露的氨基发生缩合反应，放入常温摇床中振荡反应12小时，获得化合物Ⅳ；

步骤4b中，所述缩合试剂为(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAop)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)和N-甲基吗啡啉(NMM)，试剂配比如下：2 倍摩尔量的PyAop、2倍摩尔量的HOAt、4倍摩尔量的NMM。

步骤5：化合物Ⅴ的合成

以标准的Fmoc固相多肽合成方法进行氨基酸缩合，在4b树脂上依次连接Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、Boc-Asp(OtBu)-OH，获得化合物Ⅴ；

步骤6：化合物Ⅵ的合成

6a、向步骤5树脂中加入1倍当量的Pd(PPh

6b、向6a的树脂中加入含二乙基二硫代氨基甲酸钠的DMF溶液2mL，常温振荡5min，再分别依次用DMF、DCM和DMF冲洗。重复上述步骤多次，直到树脂上的黑色褪去，获得化合物Ⅵ；

步骤7：化合物unfolded-H2-1的获取

7a、以标准的Fmoc固相多肽合成方法进行氨基酸缩合，在6b树脂上依次连接Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc- Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Boc-Pyr-OH；

7b、向7a树脂中依次加入DMF、DCM、DMF、DCM冲洗各三次。利用隔膜泵作为动力源，将洗涤后的产物抽干，得到干燥的树脂；

7c、向7b树脂中加入6mL的切割试剂，室温下反应3小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡法进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3mL以内后，加入40mL冰乙醚，离心(4500转/分钟)除去上清液后再次加入40mL冰乙醚，除去上清液后自然风干得到固体粗肽；

步骤7c中，所述切割试剂为三氟乙酸、苯酚、水、茴香硫醚和乙二硫醇的混合物，体积比为：三氟乙酸：水：苯酚：茴香硫醚：乙二硫醇＝82.5:5:5:5:2.5。

7d、取少量上述步骤7c得到的固体粗肽用含有20％乙腈的纯水溶液溶解，过膜后使用反相高效液相色谱(HPLC)进行分析。分析梯度为20％-90％的乙腈浓度，时间为30min。色谱分析后对主峰进行ESI-MS鉴定，验证unfolded-H2-1的正确性。验证正确后，使用C4的半制备柱，将上述步骤7c得到的固体粗肽进行纯化(半制备梯度为20％-90％的乙腈浓度，时间为30min)，收集纯化的溶液合并后冷冻干燥得到白色固体unfolded-H2-1。

步骤8：复性获取H2-1

8a、将7d中得到的unfolded-H2-1(6mg)溶解在含有6.2mg氧化性谷胱甘肽(GSSH)和31mg 还原性谷胱甘肽(GSH)的100mL纯水溶液。常温复性10min后,使用C4半制备柱，将复性溶液进行纯化(半制备梯度为1％-90％的乙腈浓度，时间为30min)，收集纯化后的溶液并通过 ESI-MS鉴定验证H2-1的正确性，冷冻干燥后获得H2-1。

本发明合成路线如下所示：

本发明链间二硫键Cys

本发明的有益效果体现在：

本发明设计了一种链间二硫键Cys

附图说明

图1是化合物unfolded-H2-1的高效液相色谱图。

图2是化合物unfolded-H2-1的质谱图。

图3是化合物H2-1的高效液相色谱图。

图4是化合物H2-1的质谱图。

图5是化合物H2-1对受体RXFP1的剂量-响应曲线。

图6是化合物H2-1对受体RXFP2的剂量-响应曲线。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合具体实施范例对本发明实施过程作进一步说明，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征及优点，而不是对发明权利要求的限制。

实施例1：

取315mg(0.1mmol)的Rink Amide AM树脂(取代度为0.32mmol/g)加入到固相合成管中，向合成管中加入5mL二氯甲烷(DCM)/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液，体积比为1:1，使树脂溶胀，溶胀时间为30分钟，利用隔膜泵作为动力源，将混合溶液抽干，得到溶胀好的树脂；

向溶胀好的树脂中加入2mL含有20％哌啶(体积分数)的DMF溶液，放入常温摇床中振荡反应5分钟，之后再依次用DMF、DCM和DMF分别冲洗三次。再次向树脂中加入2mL 含有20％哌啶的DMF溶液，放入常温摇床中振荡反应10分钟，之后再依次用DMF、DCM 和DMF分别冲洗三次，完成Fmoc的脱除。将首个需要缩合的氨基酸 Fmoc-Ser(tBu)-OH(191.72mg，5eq，0.5mmol)和6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU，206.845mg，5eq，0.5mmol)用2mL的DMF溶解，加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA， 165μL，10eq，1mmol.)振荡活化30s后添加到固相合成管中，放入摇床中常温振荡反应1小时；反应结束后用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，再将Fmoc-Ser(tBu)-OH(191.72mg，5eq， 0.5mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，190.12mg，5eq， 0.5mmol.)和N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt，68.0mg，5eq，0.5mmol.)溶于DMF。加入 DIEA(165μL，10eq，1mmol.)活化30s后加入到树脂中，放入摇床中常温振荡反应1小时。反应结束后用DMF、DCM、DMF各洗涤三次。此后的氨基酸缩合以上述步骤和试剂当量重复进行(氨基酸振荡缩合时间改为30分钟)。

以Fmoc固相多肽合成方法在树脂上继续连接Fmoc-Trp(Boc)-OH。

向溶胀好的树脂中加入2mL含有20％哌啶的DMF溶液，放入常温摇床中振荡反应5分钟，之后再依次用DMF、DCM和DMF分别冲洗三次。再次向树脂中加入2mL含有20％哌啶的DMF溶液，放入常温摇床中振荡反应10分钟，之后再依次用DMF、DCM和DMF分别冲洗三次，完成Fmoc的脱除。将假二肽Fmoc-Ser(tBu)-Thr(Psi(Me,Me)Pro)-OH(104.92mg， 2eq，0.2mmol)、(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAop，104.278mg，2eq，0.2mmol)和HOAt(27.22mg，2eq，0.2mmol)溶于1mL的DMF中。加入 N-甲基吗啡啉(NMM，45μL，4eq，0.4mmol)活化30s后加入到树脂中，放入常温摇床振荡反应12小时。反应结束后依次用DMF、DCM和DMF洗涤三次。

以Fmoc固相多肽合成方法在树脂上继续连接Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gly-OH。

向溶胀好的树脂中加入2mL含有20％哌啶的DMF溶液，放入常温摇床中振荡反应5分钟，之后再依次用DMF、DCM和DMF分别冲洗三次。再次向树脂中加入2mL含有20％哌啶的DMF溶液，放入常温摇床中振荡反应10分钟，之后再依次用DMF、DCM和DMF分别冲洗三次，完成Fmoc的脱除。将二氨基二酸分子(105.5mg，2eq，0.2mmol)、PyAop(104.2mg， 2eq，0.2mmol)和HOAt(27.22mg，2eq，0.2mmol)溶于1mL的DMF中。加入NMM(45μL， 4eq，0.4mmol)活化30s后加入到树脂中，放入常温摇床振荡反应12小时。反应结束后依次用DMF、DCM和DMF洗涤各三次。

以Fmoc固相多肽合成方法在树脂上依次连接Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Boc-Asp(OtBu)-OH。

将四(三苯基膦)钯(Pd(PPh

将400mg的二乙基二硫代氨基甲酸钠溶于10mL的DMF溶液，取2mL的DMF溶液加入合成管中，常温摇床中振荡反应5min，再分别依次用DMF、DCM和DMF各冲洗三次。重复上述步骤多次，直到树脂上残留的黑色钯试剂褪去。

以Fmoc固相多肽合成方法在树脂上依次连接Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Boc-Pyr-OH，完成链间二硫键CysA24-CysB23替代为硫醚键的H2 Relaxin衍生物在树脂上的单次固相合成。

实施例2：

向实施例1得到的树脂中依次加入DMF、DCM、DMF、DCM冲洗各三次。利用隔膜泵，将洗涤后的树脂抽干，得到干燥的树脂；

将321mg的苯酚溶于300μL水、300μL茴香硫醚和150μL乙二硫醇的混合溶液，用三氟乙酸(TFA)将混合溶液定量到6mL，完成切割液的配制。向装有干燥树脂的固相合成管加入 6mL的切割液，在常温摇床中震荡反应3小时。将切割液转移至离心管后，利用氮气鼓泡法吹扫TFA，使切割液的浓缩至3mL以内。向离心管中加入40mL冰乙醚使粗肽沉出，用低速离心机以4500转/分钟的转速对其离心，使固体粗肽沉降在底部。除去上清液后再次加入40mL冰乙醚，通过超声使沉降的粗肽重新悬浮。再次离心后去除上清液，将固体沉降物风干获得unfolded-H2-1。

取20mg的粗肽用3mL含有20％乙腈的纯水溶液(体积分数)超声溶解，过膜后通过反向高效液相色谱(RP-HPLC)用C4半制备柱对固体粗肽进行分离纯化(半制备梯度为20％-90％的乙腈浓度，时间为30min)，收集主峰溶液。并通过ESI-MS对主峰进行鉴定验证unfolded-H2-1的正确性。

实施例3：

将6.2mg的氧化性谷胱甘肽(GSSH)和31mg还原性谷胱甘肽(GSH)溶于100mL纯水溶液，完成复性溶液的配制。将6mg unfolded-H2-1溶于100mL的复性溶液，混匀。调PH至7.5-8后常温复性10min后，使用C4半制备对复性溶液进行纯化(半制备梯度为1％-90％的乙腈浓度，时间为30min)，收集主峰并对主峰进行ESI-MS鉴定，验证H2-1的正确性。收集纯化后的H2-1溶液，通过冻干机将溶液冻干，获取白色固体的H2-1。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，也不因各实施例之间的前后次序对本发明造成任何限制，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭示的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。