一种破伤风抗毒素的纯化方法、层析填料及破伤风抗毒素

摘要

本公开涉及破伤风抗毒素制备技术领域，涉及一种破伤风抗毒素的纯化方法、层析填料及破伤风抗毒素，其中，纯化方法包括：使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理，以对所述制品溶液进行纯化，得到破伤风抗毒素；其中，所述层析填料偶联有用于特异性结合破伤风抗体的亲和物质。本申请使用含有亲和物质的层析填料吸附蛋白溶液中的破伤风抗毒素，并调整适宜的条件使破伤风抗毒素解吸附，以对所述制品溶液进行纯化，得到破伤风抗毒素，实现了破伤风抗体效价的富集。通过本工艺生产的破伤风抗毒素，蛋白纯度更高、血浆综合利用率达到提升、提高了破伤风抗毒素市场供给量。

说明书

技术领域

本公开涉及破伤风抗毒素制备技术领域，具体涉及一种破伤风抗毒素的纯化方法、层析填料及破伤风抗毒素。

背景技术

破伤风抗毒素是一种马抗血清制品，它能中和血液中破伤风梭菌产生的破伤风毒素，缓解破伤风症状和降低病死率。当前破伤风抗毒素的生产工艺主要为破伤风类毒素免疫马匹后采集的血浆经胃蛋白酶消化，后者在IgG铰链区二硫键的近羧基端处将其剪切为F(ab')2片段和若干无生物活性的小分子多肽pFc'片段，然后去除大量白蛋白、可溶性杂质及Fc片段，最后超滤除盐、浓缩和去小分子蛋白。《中国药典》2015版破伤风抗毒素检验项下F(ab')2含量标准规定预防用及治疗用从2010版的应不低于50％及60％提升到了应不低于60％及70％，同时IgG含量也从应不高于10％降低为应不高于5％。可见针对破伤风抗毒素生产工艺的发展现状及其临床使用的局限性，我国现行国家标准提高了对此类生物制品纯化工艺的要求，建议增加柱色谱、免疫吸附等纯化技术和完善酶解工艺。

可见，目前破伤风抗毒素的分离纯化方式存在无法同时满足高纯度、低成本、高回收率及工业化生产等问题，尤其在处理大量原料时，获得大量且高纯度的破伤风抗毒素的成本很高。

需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

发明内容

本公开的目的在于提供一种破伤风抗毒素的纯化方法、层析填料及破伤风抗毒素，进而至少在一定程度上克服由于相关技术的限制和缺陷而导致的在处理大量原料时，获得大量且高纯度的破伤风抗毒素的成本很高的情况。

本公开的其他特性和优点将通过下面的详细描述变得显然，或部分地通过本公开的实践而习得。

根据本公开的第一方面，提供了一种破伤风抗毒素的纯化方法，包括：

使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理，以对所述制品溶液进行纯化，得到破伤风抗毒素；其中，所述层析填料偶联有用于特异性结合破伤风抗体的亲和物质。

进一步的，步骤使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理，以对所述制品溶液进行纯化包括：

将所述制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液处理层析柱；

使用洗脱溶剂处理经由平衡液处理后的层析柱，获得含有破伤风抗毒素的洗脱液，以完成对所述制品溶液的纯化。

进一步的，步骤将所述制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液处理层析柱中，层析柱中的每毫升层析填料上样≤1000IU破伤风抗体效价的制品溶液；

所述制品溶液的上样的流速范围为0.5ml/min-1.0ml/min；

所述平衡液的成分包括：磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，所述平衡液的pH值范围为6.8-7.2；所述平衡液的用量为3-5倍层析柱的柱床体积；所述平衡液的流速范围为2.0ml/min-5.0ml/min。

进一步的，所述洗脱溶剂的成分包括：醋酸；所述洗脱剂的pH值范围为2.0-4.0；所述洗脱溶剂的流速范围为1.0ml/min-4.0ml/min；所述洗脱溶剂的用量为2-3倍层析柱的柱床体积。

进一步的，步骤使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理之前，所述方法还包括：

对所述层析柱进行前处理；其中，所述前处理的方法包括：分别使用3-5倍层析柱的柱床体积的水和平衡液对所述层析柱进行清洗，直至清洗后的流出液的pH范围为6.8-7.2；其中，水和平衡液的流速范围均为2.0ml/min-5.0ml/min。

进一步的，所述制品溶液的原料包括：马血浆过滤后物料、破伤风抗毒素半成品、破伤风抗毒素成品、人免疫球蛋白产品。

根据本公开的第二方面，提供了一种层析填料，用于装填上述的层析柱，所述层析填料的原料包括：CNBr-Activated Sepharose 4FF介质、NHS-Activated介质、Epoxy-Activated介质和配体，所述配体为重组破伤风毒素c片段。

进一步的，所述层析填料的制作方法包括：

S1配体准备：将所述配体浓缩，然后用偶联缓冲液稀释，获得配体溶液；

S2介质准备：使用盐酸溶液分别清洗CNBr-Activated Sepharose 4FF介质、NHS-Activated介质、Epoxy-Activated介质，获得活化介质；

S3配体偶联：活化介质与配体溶液混合，经反应获得偶联后的微球；

S4清洗和纯化：使用去离子水洗涤偶联后的微球；然后使用缓冲液A和缓冲液B交替清洗偶联后的微球；最后使用缓冲液C平衡偶联后的微球，获得所述层析填料。

进一步的，偶联缓冲液的成分包括：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，偶联缓冲液的pH值为7.5-8.5；

在步骤S2介质准备中，所述盐酸溶液为1mmol/L的盐酸溶液；清洗次数为3-5次；

在步骤S3配体偶联中，所述活化介质与所述配体溶液的体积比为：1:1-1:100；反应的温度范围为4-25℃；反应的pH值范围为7.5-9.5；反应的时间为4-16h；

在步骤S4清洗和纯化中，所述缓冲液A的成分包括：Tris和氯化钠，所述缓冲液A的pH值为8.0-8.5；所述缓冲液B的成分包括：醋酸钠和氯化钠，所述缓冲液B的pH值为3.5-4.5；所述缓冲液C的成分包括：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，所述缓冲液C的pH值为6.5-7.5。

根据本公开的第三方面，提供了一种破伤风抗毒素，采用上述的破伤风抗毒素的纯化方法纯化获得。

本公开的一种破伤风抗毒素的纯化方法、层析填料及破伤风抗毒素，其中，纯化方法包括：使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理，以对所述制品溶液进行纯化，得到破伤风抗毒素；其中，所述层析填料偶联有用于特异性结合破伤风抗体的亲和物质。本申请使用含有亲和物质的层析填料吸附蛋白溶液中的破伤风抗毒素，并调整适宜的条件使破伤风抗毒素解吸附，以对所述制品溶液进行纯化，得到破伤风抗毒素，实现了破伤风抗体效价的富集。通过本工艺生产的破伤风抗毒素，蛋白纯度更高、血浆综合利用率达到提升、提高了破伤风抗毒素市场供给量。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示意性示出本公开示例性实施例中一种流穿液和洗脱液的典型AKTA图像。

具体实施方式

现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的范例；相反，提供这些实施方式使得本公开将更加全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式结合在一个或更多实施方式中。

此外，附图仅为本公开的示意性图解，并非一定是按比例绘制。图中相同的附图标记表示相同或类似的部分，因而将省略对它们的重复描述。附图中所示的一些方框图是功能实体，不一定必须与物理或逻辑上独立的实体相对应。可以采用软件形式来实现这些功能实体，或在一个或多个硬件模块或集成电路中实现这些功能实体，或在不同网络和/或处理器装置和/或微控制器装置中实现这些功能实体。

实施例1

基于本申请背景的介绍，可以得知：目前破伤风抗毒素的分离纯化方式存在无法同时满足高纯度、低成本、高回收率及工业化生产等问题，尤其面对处理大量原料时，获得的破伤风抗毒素纯度和产量更是需要付出极大代价。因此，本申请的目的在于设计一种采用层析的方式来对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行纯化，进而得到破伤风抗毒素，以用于解决现有技术缺少有效的富集血浆中的破伤风抗体的方法的技术问题，以及在处理大量原料时，获得大量且高纯度的破伤风抗毒素的成本很高的问题。具体方案如下：

本公开的示例性实施例中首先提供一种破伤风抗毒素的纯化方法，包括：使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理，以对所述制品溶液进行纯化，得到破伤风抗毒素；其中，所述层析填料偶联有用于特异性结合破伤风抗体的亲和物质。

本示例实施方式中，层析填料的原料可以包括：CNBr-Activated Sepharose 4FF介质、NHS-Activated介质、Epoxy-Activated和配体，所述配体为重组破伤风毒素c片段。

本示例实施方式中，随着对蛋白质的认知不断深入对蛋白质纯化技术的不断革新，蛋白质的分离纯化是一项复杂的工作，分离纯化的方式多种多样，对于不同的目标产物分离纯化的方法不同，亲和色谱是60年代发展起来的一种高效、快速蛋白分离的色谱方法，是利于蛋白质分子与某一分子专一可逆结合的生物特性，来选择分离目标蛋白质，亲和色谱具有容量大、分离效率高、且对目标产物的生物活性物质之间具有可逆又专一性的相互作用。亲和色谱主要包含基质、配基及亲和色谱的分离机理，随着研究的深入，基质及新配基的研究发现，亲和色谱的应用领域不断扩大。

本研究采用重组破伤风毒素c片段作为亲和填料配基与填料基质偶联制作亲和层析填料，使用该亲和层析填料特异性吸附蛋白溶液中的破伤风抗毒素，并调整适宜的条件使破伤风抗毒素解吸附，再通过超滤浓缩、配制得到高效价的破伤风抗毒素制品，实现了破伤风抗体效价的富集。通过本工艺生产的破伤风抗毒素，蛋白纯度更高、血浆综合利用率达到提升、提高了破伤风抗毒素市场供给量。

综上所述，本技术方案的有益效果总结如下：工艺简单、方便，不影响现有生产工艺路线和产品生产；由于在生产中采用的是特异性吸附层析，故产品纯度也更高，临床副反应发生可能性更低；提高血浆的综合利用率，避免了浪费提高了破伤风抗体回收率。

在一种具体实施方式中，步骤使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理，以对所述制品溶液进行纯化包括：将所述制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液处理层析柱；使用洗脱溶剂处理经由平衡液处理后的层析柱，获得含有破伤风抗毒素的洗脱液，以完成对所述制品溶液的纯化。

本示例实施方式中，将制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液处理层析柱，最后使用洗脱溶液处理层析柱，收集流出液获得抗体富集溶液。将制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液调节层析柱pH值和电导率，使得破伤风免疫球蛋白吸附于层析柱上，然后再使用洗脱液将含有大量破伤风免疫球蛋白的抗体富集溶液洗脱并收集。

在一种具体实施方式中，步骤将所述制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液处理层析柱中，层析柱中的每毫升层析填料上样≤1000IU破伤风抗体效价的制品溶液；所述制品溶液的上样的流速范围为：0.5ml/min-1.0ml/min；所述平衡液的成分包括：磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，所述平衡液的pH值范围为6.8-7.2；所述平衡液的用量为3-5倍层析柱的柱床体积；所述平衡液的流速范围为2.0ml/min-5.0ml/min。

本示例实施方式中，每毫升层析填料上样≤1000IU破伤风抗体效价的制品溶液，作为优选的方式，可以每毫升层析填料上样≤500IU破伤风抗体效价的制品溶液；制品溶液的上样流速为0.5ml/min-1.0ml/min；所述平衡液的成分包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，pH为6.8-7.2，平衡液的用量为3-5倍柱床体积，平衡液流速为2.0ml/min-5.0ml/min。采用上述的参数条件，层析柱的pH值和电导率维持在理想水平，非破伤风免疫球蛋白的蛋白成分得到分离，破伤风免疫球蛋白吸附于层析柱上。

在一种具体实施方式中，所述洗脱溶剂的成分包括：醋酸；所述洗脱剂的pH值范围为2.0-4.0；所述洗脱溶剂的流速范围为：

1.0ml/min-4.0ml/min；所述洗脱溶剂的用量为2-3倍层析柱的柱床体积。

本示例实施方式中，洗脱溶剂的成分包括醋酸，pH值为2.0-4.0，洗脱溶剂流速为1.0ml/min-4.0ml/min，洗脱溶剂的用量为2-3倍柱床体积。上述pH值以及组成的洗脱溶剂，可以有效将层析柱上吸附的免疫球蛋白洗脱。

在一种具体实施方式中，步骤使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理之前，所述方法还包括：对所述层析柱进行前处理；其中，所述前处理的方法包括：分别使用3-5倍层析柱的柱床体积的水和平衡液对所述层析柱进行清洗，直至清洗后的流出液的pH范围为6.8-7.2；其中，水和平衡液的流速范围均为：

2.0ml/min-5.0ml/min。

本示例实施方式中，将制品溶液上样于层析柱中之前，对所述层析柱进行前处理；所述前处理为：分别使用3-5倍柱床体积水和平衡液清洗所述层析柱，直至流出液的pH为6.8-7.2；水和平衡液的流速范围均为2.0ml/min-5.0ml/min，作为优选的方式，为了提高水和平衡液清晰层析柱的效果，可以将水和平衡液的流速范围均为2.0ml/min-5.0ml/min。上述处理手段将层析柱的pH值和电导率维持在理想水平。

在一种具体实施方式中，所述制品溶液的原料包括：马血浆过滤后物料、破伤风抗毒素半成品、破伤风抗毒素成品、人免疫球蛋白产品。

根据本公开的第二方面，提供了一种层析填料，用于装填上述的层析柱，所述层析填料的原料包括：CNBr-Activated Sepharose 4FF介质、NHS-Activated介质、Epoxy-Activated介质和配体，所述配体为重组破伤风毒素c片段。

在一种具体实施方式中，所述层析填料的制作方法包括：

S1.配体准备：将配体浓缩，然后用偶联缓冲液稀释，获得配体溶液。

S2.介质准备：使用盐酸溶液清洗交联琼脂糖基介质，获得活化介质；其中，交联琼脂糖基介质包括：CNBr-Activated Sepharose 4FF介质、NHS-Activated介质、Epoxy-Activated介质。

S3.配体偶联：活化介质与配体溶液混合，经反应获得偶联后的微球；

S4.清洗和纯化：使用去离子水或中性缓冲液洗涤偶联后的微球；然后使用缓冲液A和缓冲液B交替清洗偶联后的微球；最后使用缓冲液C平衡偶联后的微球，获得所述层析填料。

本示例实施方式中，采用上述技术手段可以制备获得效果理想的层析填料，通过将配体(破伤风毒素c片段)偶联到交联琼脂糖基介质上的方式，使得层析填料具有可逆吸附破伤风免疫球蛋白的能力。

在一种具体实施方式中，偶联缓冲液的成分包括：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，偶联缓冲液的pH值为7.5-8.5；在步骤S2介质准备中，所述盐酸溶液为1mmol/L的盐酸溶液；清洗次数为3-5次；在步骤S3配体偶联中，所述活化介质与所述配体溶液的体积比为：1:1-1:100；反应的温度范围为4-25℃；反应的pH值范围为7.5-9.5；反应的时间为4-16h；在步骤S4清洗和纯化(纯化)中，所述缓冲液A的成分包括：Tris和氯化钠，所述缓冲液A的pH值为8.0-8.5；所述缓冲液B的成分包括：醋酸钠和氯化钠，所述缓冲液B的pH值为3.5-4.5；所述缓冲液C的成分包括：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，所述缓冲液C的pH值为6.5-7.5。

本示例实施方式中，在S1中，将配体浓缩至10mg/ml以上；偶联缓冲液的成分包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠，pH值为7.5-8.5，作为优选的实施方式，偶联缓冲液的pH值为7.5-8.5或者偶联缓冲液的pH值为8-10；在S2中，在4℃的条件下使用1mmol/L的盐酸溶液清洗交联琼脂糖基介质3-5次，获得活化介质；在S3中，活化介质与配体溶液按照体积比1:1-1:100，作为优选的方式，可以采用1:1-1:20的比例混合；在4℃以及pH 7.5-9.5的条件下反应12-16h，获得偶联后的微球；在S4中，缓冲液A的成分包括Tris-HCl和氯化钠，pH值为8.0-8.5；缓冲液B的成分包括醋酸钠和氯化钠，pH值为3.5-4.5；缓冲液C的成分包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠，pH值为6.5-7.5。

本示例实施方式中，采用上述技术参数可以实现破伤风毒素c片段在交联琼脂糖基介质上的高效偶联。其中，说明配体偶联的温度对于活化介质与配体之间的结合效果有非常关键的影响。层析填料的制备过程较为复杂，步骤繁多，如何找到影响层析填料效果的关键技术点，是发明人一直尝试解决的问题。通过大量实验研究发现，配体偶联的温度需要控制在4-15℃的范围内，获得的层析填料才能高效地捕获破伤风免疫球蛋白，以及通过控制洗脱条件实现对破伤风免疫球蛋白的高效富集(即与层析填料解离)。

根据本公开的第三方面，提供了一种破伤风抗毒素，采用上述的破伤风抗毒素的纯化方法纯化获得。

本发明涉及一种破伤风抗毒素纯化技术领域，具体涉及一种马血清破伤风抗毒素的纯化方法。破伤抗毒素的纯化方法包括使用层析柱对制品进行亲和层析处理；所述层析柱填装有层析填料，所述层析填料偶联有用于特异性结合破伤风抗体的亲和物质。亲和层析填料的原料包括CNBr-Activated Sepharose 4FF介质、NHS-Activated介质、Epoxy-Activated和配体，配体为重组破伤风毒素c片段。本技术方案可以解决现有技术缺少有效的富集血浆中的破伤风抗体的方法的技术问题。通过本工艺生产的破伤风抗毒素，蛋白纯度更高、血浆综合利用率得到提升、提高了破伤风抗毒素市场供给量。

实施例2

在实施例1的基础上，本实施例结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

本实施例提供了一种层析填料的制备方法，具体如下：

1.层析填料的准备

(1)配体准备：配体的原料为重组破伤风毒素c片段，本公司发酵表达纯化获得，浓缩至合适浓度即得配体溶液。

(2)介质准备：将CNBr-Activated Sepharose 4FF介质、NHS-Activated介质、Epoxy-Activated分别用4℃，1mmol/L盐酸溶液清洗3-5次，获得活化介质。

(3)配体偶联：清洗后的活化介质与配体溶液按照1:1-1:100混合(即1ml活化的介质与1ml-100ml配体溶液混合)，在4℃、缓慢搅拌条件下调整pH值7.5-9.5，反应16h，获得偶联后体系，加入0.15mol/L甘氨酸继续搅拌4h，封闭剩余基团。

(4)清洗和纯化：反应结束后用偶联后体系体积的10倍左右的超纯水或中性缓冲液(PB中性缓冲液)洗去配体溶液，再用10倍体积的缓冲液A(0.1mol/L Tris-HCl，0.5mol/L氯化钠、pH8.0-8.5)、缓冲液B(0.1mol/L醋酸钠+0.5mol/L氯化钠、pH3.5-4.5)交替清洗三次偶联后微球，每次清洗时间间隔10-15min。最后用10倍缓冲液C(0.02mol/L磷酸缓冲液+0.3mol/L氯化钠、pH6.5-7.5)平衡pH，获得本方案的微球状的层析填料。

实施例3

在实施例2所制备的层析填料的基础上，本实施例提供了一种采用实施例2制备的层析填料对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行纯化，具体的破伤风抗毒素的纯化过程如下：

(1)层析填料装柱：将平衡好的微球装载至层析柱中。

(2)制品准备：准备含有破伤风抗毒素的溶液，包括原料马血浆、相关破伤风抗毒素的半成品、成品。

(3)层析柱前处理：分别用柱床体积3-5倍的注射用水、平衡液(0.01±0.005mol/L磷酸氢二钠+0.01±0.005mol/L磷酸二氢钠，pH6.8-7.2)平衡层析柱出液pH6.8-7.2，处理流速0.5ml/min-1.5ml/min。

(4)制品层析：根据层析前的制品溶液中破伤风抗毒素效价，按照≤500IU/ml上样层析，即每毫升填料上样含有≤1000IU单位的层析前的制品溶液，上样流速0.5ml/min-1.5ml/min，收集流穿液。上样结束后用3-5倍柱床体积平衡液(0.01±0.005mol/L磷酸氢二钠+0.01±0.005mol/L磷酸二氢钠，pH6.8-7.2)平衡层析柱，平衡液合并至流穿液中收集用于制作免疫球蛋白产品。

(5)洗脱：用2-3倍柱床体积的洗脱溶剂(1.0mol/L醋酸、pH2.0-3.5)洗脱层析柱，流速1.0ml/min-1.5ml/min，收集获得洗脱液。流穿液和洗脱液的典型AKTA图像参见图1。

本示例实施方式中，参见表1所示，提供了实施例1-实施例3的参数选择：

表1

如表1所示，在实施例1-3中，表明CNBr-Activated Sepharose 4FF可以有效偶联破伤风毒素c片段，不同浓度偶联效果不同。

本示例实施方式中，参见表2所示，提供了实施例4-实施例6的参数选择：

表2

在实施例4-6中，表明CNBr-Activated Sepharose 4FF、NHS-Activated、Epoxy-Activated均可以有效偶联破伤风毒素c片段，不同的介质偶联效果不同。

本示例实施方式中，参见表3所示，提供了实施例7-实施例9的参数选择：

表3

在实施例7-9中，表明偶联时间影响偶联的效果，合适的偶联时间可以有效偶联破伤风毒素c片段。

以下实施例中，半成品均为疫苗生产过程中的中间产品，原料血浆是血液离心去除细胞后的上清，含有蛋白质、无机盐和水等，不含血细胞，半成品是指原液添加各类辅料后的产品。原液和半成品和吸附破伤风疫苗成品一样，均含有大量的破伤风抗毒素。

表4实施例10-12的参数选择：

破伤风抗体效价收率以及蛋白收率的计算方法为：对于洗脱液：破伤风抗体效价收率(％)＝(洗脱液体积×洗脱液中抗体效价/层析前体积×层析前抗体效价)×100％，蛋白收率＝洗脱液中蛋白含量/层析前制品溶液中蛋白含量×100％。

在实施例12中，虽然在层析过程中大部分破伤风抗体被流穿，但洗脱液中仍然回收率50％的破伤风抗体效价，且蛋白含量只有5％，蛋白纯度提高11倍，故以原料血浆进行层析的工艺能达到提取破伤风抗体的目的。

表5实施例13-15的参数选择：

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本公开的其他实施例。本申请旨在涵盖本公开的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本公开的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本公开的真正范围和精神由权利要求指出。

应当理解的是，本公开并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本公开的范围仅由所附的权利要求来限。