一种防治小麦纹枯病生物源方法及应用

摘要

提供了一种防治小麦纹枯病的生物源方法，包括：对小麦种子依次进行春化和灭菌处理；使用印度梨形孢孢子液对小麦种子进行处理，并使小麦种子发芽；选择发芽良好的小麦种子移植于土壤中；待小麦种子破土后，向小麦叶片喷洒硝普钠溶液。该方法通过根部内生真菌定殖与叶片信号分子诱导双重作用于小麦，二者协同激活植物体内免疫反应，增强小麦抵抗病原体能力；抗纹枯病效果更优，且避免药剂对环境产生污染或增加植株抗药性问题，绿色环保，操作简单，成本低廉。

说明书

技术领域

本发明属于微生物菌肥技术领域，具体涉及一种防治小麦纹枯病生物源方法及应用。

背景技术

小麦是全球种植最广泛的谷物作物之一，在农业经济中发挥着重要作用。2015-2016年全球小麦产量约为7.368亿吨，价值约1450 亿美元。随着世界人口的增加，人们对作物产品的需求以及粮食安全和营养均衡的要求也不断提高，预计到2050年，对小麦的需求将增长60％。

小麦纹枯病是由立枯丝核菌感染引起的土传病害，在整个生长发育期均可染病，造成小麦烂芽、病苗枯死、花秆烂茎、枯株白穗等症状。病情严重的一些小麦主茎和大分蘗常无法抽穗，形成枯孕穗，还有些虽能抽穗，但结实少，籽粒干瘪，形成枯白穗，严重威胁小麦的高质高产。

针对小麦出现的病原菌感染问题一般依靠种植抗病品种和化学药剂防治两种措施。然而对小麦纹枯病病原体具有天然抗性的小麦品种有限，这严重阻碍了使用常规方法进行抗性育种的进展。因此目前，防治植物病害的方式还主要依靠化学药剂，但化学防治存在严重的环境和生态安全隐患，如非目标效应和病原体抗性增加问题。

另外，大量使用化肥是农业实现增产的主要方式。

因此，小麦增产及病害的防控需要寻找绿色高效、经济环保的新药剂和新方法。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种防治小麦纹枯病，提高小麦产量的生物源抗病促生新方法。

本发明另一目的在于提供上述防治小麦纹枯病的生物源抗病促生方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现:

一种防治小麦纹枯病的生物源方法，包括：

(1)对小麦种子依次进行春化和灭菌处理；

(2)使用印度梨形孢孢子液对小麦种子进行处理，并使小麦种子发芽；

(3)选择发芽良好的小麦种子移植于土壤中；

(4)待小麦种子破土后，向小麦叶片喷洒硝普钠溶液。

其中，所述步骤(1)中，所述春化处理包括：将小麦种子放在 3-5℃(优选4℃)的冰箱中春化过夜。

其中，所述步骤(1)中，所述灭菌处理包括：依次分别用乙醇溶液和次氯酸钠溶液浸泡小麦种子以对小麦种子进行灭菌，然后将灭菌后的小麦种子均匀置于培养皿中。

其中，所述步骤(1)中，所述灭菌处理包括：用65-75体积％ (优选70体积％)浓度的乙醇溶液浸泡小麦种子2-5min(优选 3min)；用水冲洗4-6遍(优选5遍)；然后用有效氯浓度为15-25体积％(优选20体积％)的次氯酸钠溶液浸泡小麦种子8-12min(优选10min)，用水冲洗5-9遍(优选7遍)；将灭菌后的小麦种子均匀置于灭菌并铺有两层滤纸的培养皿中。

其中，所述步骤(1)中，所述灭菌处理中，在用乙醇溶液或次氯酸钠溶液浸泡小麦种子时，优选同时进行搅拌处理，优选磁力搅拌。

其中，所述步骤(1)中，所述灭菌处理中，优选用蒸馏水进行冲洗步骤。

其中，所述步骤(2)中，包括：使用0.015-0.025体积％(优选 0.02体积％)浓度的吐温水刮取印度梨形孢孢子液，调配，得到密度约为10

其中，所述步骤(2)中，印度梨形孢孢子液不可浸没小麦种子，使得种子充分浸润即可。

其中，所述步骤(3)中，包括：选择发芽良好的种子移植于土壤中，每天喷浇适量水，以确保植物存活。

其中，所述步骤(4)中，包括：待小麦种子破土而出2-4天 (优选3天)后，向小麦各个叶片喷洒0.20-0.30mmol/L(优选0.25 mmol/L)硝普钠溶液，隔1-2天(优选隔1天)再次向小麦各个叶片喷洒0.20-0.30mmol/L(优选0.25mmol/L)硝普钠溶液，每次喷洒硝普钠溶液的喷洒量为2-5ml/株(优选3ml/株)。

其中，所述步骤(2)中，所述吐温为吐温20。

其中，各步骤中所用的调配试剂的水为蒸馏水。

其中，所述步骤(4)中，所述硝普钠提供外源性NO；且待印度梨形孢定殖后再实施所述硝普纳叶片喷洒。

其中，所述培养皿、滤纸、吐温水均已灭菌，所述灭菌为使用高压蒸汽灭菌锅在120-125℃(优选121℃)下灭菌15-25min(优选 20min)。

本发明还提供了将上述防治小麦纹枯病的生物源方法用于防治小麦纹枯病的应用。

本发明的有益效果为：

(1)本发明所述的防治小麦纹枯病方法，首先采用浸种法可有效使得有益真菌印度梨形孢定殖于小麦根部。

印度梨形孢与植物根部共生可通过三方面介导植物抗病性增强：

(a)印度梨形孢通过维持生物膜系统完整性、维持低水平膜脂过氧化程度并稳定细胞内渗透压以及调节酶活性从而实现对病原菌的抵抗；

(b)印度梨形孢通过诱导抗性基因表达提高植物对病原菌的抵抗；

(c)印度梨形孢通过重排基因表达谱影响激素代谢从而提高植物对病原菌的抵抗。

(2)本发明所述的防治小麦纹枯病方法，当印度梨形孢成功定殖小麦根系后，采用外源性信号分子一氧化氮即硝普钠对地上部分即叶片进行喷浇。NO作为植物的信号分子可在植物-病原菌相互作用过程中，通过激活防御基因和诱导过敏性细胞死亡以及产生植物抗毒素参与防御反应。

(3)总体而言，本发明先用印度梨形孢根部定殖，然后用NO 叶片喷浇，这可实现先根后叶的植物系统全面免疫诱导，并充分保证硝普钠喷浇不会影响印度梨形孢前期定殖。

(4)本发明通过根部内生真菌定殖与叶片信号分子诱导双重作用于小麦，二者协同激活植物体内免疫反应，增强小麦抵抗病原体能力。研究显示，经本发明所述防治小麦纹枯病的生物源方法处理的小麦，相较于单独纹枯病感染、单独施加印度梨形孢生物菌肥、或单独NO信号物质处理染病小麦，14天后小麦株高分别增加 15％、13％和11％，根长分别增加16％、7.4％和6.7％，鲜重分别增加32.3％，18.9％和22％；相较于单独施加印度梨形孢生物菌肥或 NO信号物质处理染病小麦，超氧化物歧化酶活性分别提高15％和 53％，过氧化氢酶活性分别提高54％和16％，过氧化物酶活性分别提高16％和17％，且相对电导率(膜稳定性表征指数)、丙二醛含量都显著改善，光合作用指标叶绿素含量和相对水含量也显著提高，因此本发明所述方法抗纹枯病效果更优，且避免药剂对环境产生污染或增加植株抗药性问题，绿色环保，操作简单，成本低廉。

(5)本发明为一种立足于市场对绿色环保、有效抵抗小麦纹枯病方法的需求，有效防治病原体对小麦植株的伤害，并克服了现有技术环境污染、抗药性强等不足，效果稳定，成本低廉，操作简单，具有市场可开发前景的生物源抗病促生组合方法。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述。但应理解这些实施例仅用于说明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。

实施例1

内生真菌选用印度梨形孢，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会(CGMCC:10325)。

植物选用小麦，小麦品种为bread wheat，种子购买于市场，储存于4℃冰箱中。

土壤选用蛭石和珍珠岩质量配比为2:1的混合土壤。

为对比本发明方法的效果，设置七个处理组，分别为：

(1)空白对照组(Mock)；

(2)单染纹枯病菌(Rh)；

(3)单施硝普钠(NO)；

(4)单接种印度梨形孢(Piri)；

(5)硝普钠+纹枯病菌(NO+Rh)；

(6)印度梨形孢+纹枯病菌(Piri+Rh)；

(7)印度梨形孢+硝普钠+纹枯病菌(Piri+NO+Rh)。

具体施用方法为：

(1)将小麦种子放置在4℃冰箱中春化过夜；使用70％乙醇浸泡种子3min，蒸馏水冲洗5遍，再使用20％次氯酸钠浸泡种子 10min，蒸馏水冲洗7遍；将灭菌后的种子均匀置于灭菌并铺有两层滤纸的培养皿中；

(2)使用0.02％吐温水刮取印度梨形孢真菌孢子，获取孢子液，调配孢子液密度至约为10

(3)将发芽良好的种子移植于土壤中，将花盆置于25℃下培养，模拟自然条件光照，12h光照、12h黑暗；

(4)待种子发芽3天后，向NO、NO+Rh、Piri+NO+Rh处理组的小麦各个叶片均匀喷洒0.25mmol/L硝普钠，隔天，即生长第5 天进行二次加强喷洒；

(5)待小麦发芽第6天对小麦Rh、NO+Rh、Piri+Rh、 Piri+NO+Rh处理组染纹枯病菌，使用牙签刮取病菌插入小麦茎基部，每天喷浇适量水，保证小麦正常生长。

表1-9给出了不同处理组的各项性能数据对比。

表1 7d、14d不同处理组生长参数对比

表2. 7d、14d不同处理组超氧化物歧化酶活性对比

表3. 7d、14d不同处理组过氧化氢酶活性对比

表4. 7d、14d不同处理组过氧化物酶活性对比

表5. 7d、14d不同处理组相对电导率对比

表6. 7d、14d不同处理组丙二醛含量对比

表7. 7d、14d不同处理组叶绿素含量对比

表8. 7d、14d不同处理组相对含水量对比

表9. 7d、14d不同处理组可溶性糖含量对比

采用上述具体实例所述方法进行抗病试验，测定了7种处理组的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性，进行抗性对比；测定膜稳定性指标包括相对电导率和丙二醛含量，判断不同处理组的膜氧化稳定状况；并对生长指标进行测定如叶绿素含量、相对含水量光合作用指标及株高、根长、鲜重生长参数指标，对比不同处理的生长状况。实验开展7天、14天数据记录统计，确保实施方法效果稳定有效，且方法1-3各重复三次，每次数据基本稳定，以证明实验没有误差。

由数据可知，Piri+NO+Rh处理组在7天及14天的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性均低于Rh处理组；但高于 NO+Rh、Piri+Rh处理组，这说明Piri和NO协同作用能进一步激活植物体内氧化防御系统，但其又不同于病原菌对寄主的伤害程度。根据膜氧化程度丙二醛含量及膜受损程度相对电导率得出，Piri和 NO的双重作用有效缓解了病菌对细胞膜的伤害，并进一步增强植物体内叶绿素及可溶性糖含量。

综合上述实验结果，采用本发明所述方法，能显著提高纹枯病侵染下小麦植株生物产量，增强细胞膜稳定性及提高植物体内叶绿素及可溶性糖含量；有效缓解病害症状。该方法操作简单，成本低廉，绿色环保，可达到有效防治小麦纹枯病的效果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。