链霉菌在水果保鲜中的应用及其作为水果保鲜剂的应用

摘要

本发明涉及一种链霉菌在水果保鲜中的应用及其作为水果保鲜剂的应用，属于水果保存技术领域。本发明在水果保鲜中应用的链霉菌为链霉菌(Streptomyces sp.)MS001，保藏编号为CCTCC NO:M 2019266。本发明的链霉菌在水果保鲜中的应用，利用链霉菌MS001处理采后的水果(例如山楂)可以有效缓解水果的腐烂速率，抑制水果糖含量和VC含量的下降，对水果果实品质具有较好的维持作用。经处理的水果果实，可以缓解水果体内清除活性氧能力的降低，从而达到水果保鲜的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及一种链霉菌在水果保鲜中的应用及其作为水果保鲜剂的应用，属于水果保存技术领域。

背景技术

植物内生菌(Endophyte)是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。植物内生菌的种类繁多，普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物内均有内生细菌，增强植物对病原菌的抗性，已成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用。其抗菌机制主要有产生抗菌物质、与病原菌竞争营养、诱导植物抗病性和促进植物生长等四类，从而达到抗病的作用。链霉菌因能产生多种拮抗物质而成为生物防治领域的一类重要微生物，目前已有多种抗生素广泛应用到果蔬病害控制中。例如授权公号为CN110029078B的中国专利公开了一种从新疆野苹果枝干中分离得到具有防病杀虫双重作用的内生链霉菌MS001，可以防治苹果树、园林植物、蔬菜、和粮食作物上的一些病害和虫害。

此外，由于新鲜水果采后腐烂变质主要受到病原侵染，研究者不断从自然界中寻找对人畜安全无毒、无残留、特异性强、不伤害有益生物、无二次污染、无抗药性的保鲜剂取代化学药剂进行防治。作为重要生防微生物之一的内生菌，可以通过提高植物抗病性、与病原菌竞争生态位或产生拮抗物质等发挥防病功效，具有防治水果采后病害的优势。通过植物内生菌防治水果采后病害，可以避免使用化学杀菌剂、防腐剂造成的农药残留问题，提高食品安全性。植物生防菌为防治水果采后病害打开了新思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种链霉菌在水果保鲜中的应用，该链霉菌能够发挥较好的水果保鲜作用。

本发明还提供了一种链霉菌作为水果保鲜剂的应用。

为了实现以上目的，本发明的链霉菌在水果保鲜中的应用所采用的技术方案是：

一种链霉菌在水果保鲜中的应用，所述链霉菌为链霉菌(Streptomyces sp.)MS001，保藏编号为CCTCC NO:M 2019266。

本发明的链霉菌在水果保鲜中的应用，利用链霉菌MS001处理采后的水果(例如山楂) 可以有效缓解水果的腐烂速率，抑制水果糖含量和VC含量的下降，对水果果实品质具有较好的维持作用。经处理的水果果实，可以缓解水果体内清除活性氧能力的降低，从而达到水果保鲜的目的。本发明所采用的链霉菌MS001经鉴定为哥斯达黎加链霉菌，该菌株分离自健康的野苹果，实验表明它对植物无毒无害，是一株安全的植物内生菌。

进一步地，所述链霉菌用于延缓水果腐烂。

进一步地，所述链霉菌用于抑制水果含糖量下降。

进一步地，所述链霉菌用于延缓水果中过氧化物酶(POD酶)活性上升。

进一步地，所述链霉菌用于抑制水果中超氧化物歧化酶(SOD酶)活性下降。

进一步地，所述链霉菌用于抑制水果中维生素C(VC)含量下降。

进一步地，所述的链霉菌在水果保鲜中的应用，包括以下步骤：将所述链霉菌接种到液体培养基中进行发酵培养，然后进行稀释，得到稀释液；将水果在稀释液中浸果2～5min。

进一步地，所述接种是将链霉菌种子液接种到液体培养基中。所述链霉菌种子液是将所述链霉菌接种于营养琼脂培养基(NA培养基)中培养至OD值为0.1得到。链霉菌种子液制备过程中进行培养的温度优选为24～28℃。链霉菌种子液制备过程在摇床中振荡培养至OD值1.0。例如可以采用旋转摇床，培养过程中控制旋转摇动的速率为130～180r/min。所述链霉菌种子液在高氏一号培养基中的接种量为4～6％。发酵培养过程中，控制液体培养基的初始pH为4～7。所述发酵培养的温度为23～32℃，发酵培养的时间为3～4天，例如在28℃培养4天。例如发酵培养可以在500mL三角瓶中进行，加入的液体培养基的体积为100mL。链霉菌种子液在制备过程中培养以及发酵培养均在有氧条件下进行。

进一步地，稀释的倍数为50～200倍，例如稀释50～100倍。

进一步地，所述水果为山楂或苹果。

本发明的链霉菌作为水果保鲜剂的应用所采用的技术方案为：

链霉菌作为水果保鲜剂的应用，所述链霉菌为链霉菌(Streptomyces sp.)MS001，保藏编号为CCTCC NO:M 2019266。将所述链霉菌作为水果保鲜剂应用时，需要将链霉菌在液体培养基中进行发酵培养，将发酵结束的体系稀释后进行使用。例如稀释50～200倍或50～100倍后使用。

本发明的链霉菌作为水果保鲜剂的应用，对采后的水果(例如山楂)进行浸果处理可以有效缓解水果的腐烂速率，抑制水果糖含量和VC含量的下降，对水果果实品质具有较好的维持作用。经处理的水果果实，可以缓解水果体内清除活性氧能力的降低，从而达到水果保鲜的目的。

进一步地，所述水果保鲜剂为山楂保鲜剂或苹果保鲜剂。

附图说明

图1为实验例1中浸果处理后不同时间点山楂腐烂率的变化图；

图2为实验例1中浸果处理后不同时间点山楂含糖量的变化图；

图3为实验例1中浸果处理后不同时间点山楂POD酶活性的变化图；

图4为实验例1中浸果处理后不同时间点山楂SOD酶活性的变化图；

图5为实验例1中浸果处理后不同时间点山楂VC含量的变化图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1

本实施例的链霉菌在水果保鲜中的应用，包括以下步骤：

1)将链霉菌Streptomyces sp. MS001 (保藏编号为CCTCC NO:M 2019266；保藏日期：2019年04月 17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。)接种于NA培养基中，在摇床中于28℃振荡培养至 OD值1.0，得到种子液；在500mL的三角瓶中加入100mL pH值为7的高氏一号培养基，然后将种子液按照4％(体积)接种量接种到三角瓶中的高氏一号培养基中，控制发酵温度为28℃发酵培养4天，获得新鲜发酵液，然后将新鲜发酵液用蒸馏水稀释50倍得到稀释液；以上均是在有氧条件下进行培养；

2)将山楂在稀释液中浸果2min，取出后风干，装盒保存。

实施例2

本实施例的链霉菌在水果保鲜中的应用，与实施例1的应用的区别仅在于：本实施例的步骤2)将山楂在稀释液中浸果5min。

实施例3

本实施例的链霉菌在水果保鲜中的应用，与实施例的1的应用的区别仅在于：本实施例的步骤1)中将新鲜发酵液用蒸馏水稀释100倍得到稀释液。

实施例4

本实施例的链霉菌在水果保鲜中的应用，与实施例3的应用的区别仅在于：本实施例的步骤2)将山楂在稀释液中浸果5min。

实施例5

本实施例的链霉菌在水果保鲜中的应用，与实施例的1的应用的区别仅在于：本实施例的步骤1)中将新鲜发酵液用蒸馏水稀释200倍得到水果保鲜剂。

实施例6

本实施例的链霉菌在水果保鲜中的应用，与实施例5的应用的区别仅在于：本实施例的步骤2)将山楂在稀释液中浸果5min。

实验例1

取健康无损的市售山楂分别浸入到实施例1、实施例3、实施例5中的步骤1)中新鲜发酵液稀释后得到的稀释液中，分别浸果2min和5min后取出风干装盒，常温遮光保存。以蒸馏水浸泡同等时间为空白对照(CK对照组)，以纳他霉素(Natamycin)10mg/L浸泡同等时间为阳性对照(纳他霉素阳性对照组，即CK(阳)对照组)。每组处理重复3次，每个重复15个山楂；分别取储藏第7天、第12天和第17天的山楂果实测量山楂腐烂率、果肉含糖量、维生素C含量、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等相关生理指标。

1)山楂判定为腐烂的标准为表皮出现水浸状腐烂斑，腐烂斑处组织软化。不同时间山楂腐烂率的统计结果见表1，如图1所示。

表1菌株MS001稀释处理后山楂腐烂率(单位：％)

注：采用Duncan单因素方差分析法进行分析，表中同列标有不同小写字母者表示组间差异极显著 (P＜0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P＞0.05)。

由表1和图1可知，随着贮藏时间的延长，各个处理组山楂的腐烂率都呈逐渐上升趋势。相比于CK对照组，经菌株MS001发酵液稀释的处理组均能延缓山楂果实的腐烂速率，并且浸果2min稀释100倍处理组延缓山楂腐烂率上升的效果最佳。在山楂贮藏过程中， CK对照组的腐烂率上升最快。在贮藏17天时，浸果5min的CK对照组和纳他霉素阳性对照组腐烂率分别达到58.33％和45.83％，经菌株MS001发酵液稀释50倍、100倍和200 倍处理组分别比CK对照组降低了38.42％、35％和23.61％，比纳他霉素阳性对照组降低了 25.92％、22.5％和11.11％。同样，浸果2min的CK对照组和纳他霉素阳性对照组的腐烂率分别是46.67％和12.42％，经菌株MS001发酵液稀释50倍、100倍和200倍处理组分别比 CK对照组降低了21.82％、40.31％和13.94％，其中稀释100倍处理比纳他霉素阳性对照组降低了6.06％。综上表明，经菌株MS001发酵液稀释的处理组可以延缓山楂果实的腐烂速率。

2)山楂果肉含糖量采用NK-55T高精度数显糖度计测定，测定结果见表2和图2。

表2菌株MS001稀释处理后山楂含糖量(单位：％)

注：采用Duncan单因素方差分析法进行分析，表中同列标有不同小写字母者表示组间差异极显著 (P＜0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P＞0.05)。

由表2和图2可知，相比对照组，经菌株MS001发酵液稀释的处理组可以有效抑制山楂果实含糖量的下降，且浸果2min处理组对抑制山楂含糖量下降的效果最佳。在山楂贮藏过程中，经菌株MS001发酵液稀释的处理组山楂果实的含糖量整体呈先上升后下降的趋势。这是因为在贮藏前期山楂中的大分子碳水化合物转换为可溶性糖类，贮藏一段时间后由于呼吸作用的增强，糖类等营养物质被大量消耗，山楂中的糖含量下降。在贮藏17天时，浸果5min的CK对照组和纳他霉素阳性对照组含糖量分别是12.35％和13.35％，经菌株MS001发酵液稀释50倍、100倍和200倍处理组分别比CK对照组增加了2.5％、1.65％和2.5％，比纳他霉素阳性对照组增加了1.5％、0.65％和1.5％。同样，浸果2min的CK对照组和纳他霉素阳性对照组的含糖量是13.5％，经菌株MS001发酵液稀释50倍、100倍和200倍处理组分别比CK对照组和纳他霉素阳性对照组增加了2.5％、1.5％和2.17％。综上表明，经菌株MS001发酵液稀释的处理组对山楂果实含糖量的降低有延缓作用。在不同的浸果时间中，稀释50倍处理组对抑制山楂含糖量下降的效果最佳。

3)过氧化物酶(POD)活性参照张志良等人在《植物生理学试验指导》(高等教育出版社，2009)中提供的方法测定，测试结果如表3和图3所示。

表3菌株MS001稀释处理后山楂POD酶活性(单位：U·g

注：采用Duncan单因素方差分析法进行分析，表中同列标有不同小写字母者表示组间差异极显著 (P＜0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P＞0.05)。

由表3和图3可知，随着贮藏时间的延长，经菌株MS001发酵液稀释的处理组POD 酶活性呈先上升后下降的趋势。相比于纳他霉素阳性对照组，经菌株MS001发酵液稀释的处理组可以抑制山楂果实POD酶活性的上升，且浸果2min处理对抑制山楂POD酶活性上升的效果最佳。POD在植物体中能参与果蔬的酶促褐变反应，可以催化酚类物质、谷胱甘肽、抗坏血酸的氧化，使果蔬变色，是衡量水果保鲜价值的一个重要指标。在贮藏17 天时，浸果5min的CK对照组和纳他霉素阳性对照组POD酶活性分别是5.28U·g

4)超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)光还原法的方法测定，测试结果见表4和图4。氮蓝四唑(NBT)光还原法参照《Horseradish peroxidase-mediatedsynthesis of an antioxidant gallic acid-g-chitosan derivative and itspreservation application in cherry tomatoes》(RSC Advances,2018,8)

表4菌株MS001稀释处理后山楂SOD酶活性(单位：U·g

注：采用Duncan单因素方差分析法进行分析，表中同列标有不同小写字母者表示组间差异极显著 (P＜0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P＞0.05)。

由表4和图4可知，随着贮藏时间的延长，经菌株MS001发酵液稀释的处理组SOD 酶活性都呈现先上升后下降的趋势。相比于纳他霉素阳性对照组，经菌株MS001发酵液稀释的三个处理组可以有效抑制山楂果实SOD酶活性的下降，且浸果2min处理组对抑制山楂果实SOD酶活性下降的效果最佳。SOD是一种专门清除超氧阴离子自由基的抗氧化酶, 它能提高机体对自由基引发疾病的抵抗力，因此SOD酶可以作为山楂保鲜的测定指标。在贮藏17天时，浸果5min的CK对照组和纳他霉素阳性对照组SOD酶活性分别是0.01944 U·g

5)维生素C(Vc)含量参照李润丰等在《2，6-二氯靛酚反滴定法测定红色果蔬中还原型VC》(营养学报,2012,34(5):507-509)提供的方法利用2,6-二氯靛酚滴定法测定，测试结果见表5和图5。

表5菌株MS001稀释处理后山楂VC含量(单位：mg·g

注：采用Duncan单因素方差分析法进行分析，表中同列标有不同小写字母者表示组间差异极显著 (P＜0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P＞0.05)。

由表5和图5可知，随着贮藏时间的延长，各处理组的VC含量均呈现逐渐下降趋势。相比于纳他霉素阳性对照组，经菌株MS001发酵液稀释50倍和100倍处理组可以有效抑制山楂果实VC含量的下降，并且浸果2min处理对抑制山楂果实VC含量下降的效果最佳。 VC是一种抗氧化剂，参与植物中许多的生产代谢活动，对于植物的衰老腐烂有延缓的作用。但VC极不稳定，其含量变化可在一定程度上反映水果腐烂的情况。在贮藏17天时，浸果5min的CK对照组和纳他霉素阳性对照组VC含量分别是17.46mg·g

由上述实验例可知不同稀释倍数的MS001发酵液对山楂保鲜效果差异很大。菌株MS001发酵液稀释50倍和100倍处理均可有效减缓山楂果实的含糖量、VC含量和SOD 酶活性的下降，抑制腐烂率和POD酶活性的上升。菌株MS001发酵液稀释50倍处理对减缓山楂果实的含糖量、VC含量和SOD酶活性的下降效果最好，而稀释100倍处理对抑制山楂果实腐烂率和POD酶活性的上升效果最好。相比于MS001稀释50倍和100倍处理，稀释200倍处理会出现部分生理指标和酶活性略差于对照组的现象，这可能是因为链霉菌 MS001发酵液稀释200倍浓度太低，导致处理山楂的MS001菌悬液浓度过低，没有起到很好的保鲜效果。

实验例2

新鲜无损伤‘富士’苹果果实浸入实施例3中新鲜发酵液稀释后得到的稀释液(即稀释 100倍链霉菌MS001发酵液)中，以蒸馏水浸果为空白对照，5min后取出晾干。处理后的果实去除长度为7mm表皮后接种苹果轮纹病病原菌葡萄座腔菌菌饼，每个处理12个苹果，每个苹果接种4个菌饼。28℃保存，接种病原菌第4天统计发病情况。

分级标准：

0级：未发病；

1级：菌饼面积＜S≤5倍菌饼面积；

2级：5菌饼面积＜S≤10倍菌饼面积；

3级：10倍菌饼面积＜S≤15倍菌饼面积；

4级：15倍菌饼面积＜S≤20倍菌饼面积；

5级：S＞20倍菌饼面积；

S为病斑面积。

链霉菌MS001浸果后对苹果轮纹病防治效果见表6。苹果轮纹病病原菌葡萄座腔菌接种4天时，处理组和对照组发病率均为83.33％，但病情指数有所差异。链霉菌MS001稀释100倍液处理组果实病情指数为20.00，显著低于对照组，病情指数为35.83；对果实轮纹病防效达到44.18％。试验结果表明链霉菌MS001稀释液浸泡苹果，能够有效降低葡萄座腔菌对苹果果实的侵染速率。

表6链霉菌MS001浸泡果实防治苹果轮纹病

注：采用Duncan单因素方差分析法进行分析，表中同列标有相同小写字母者表示组间差异不显著 (P＞0.05)。