抗原递呈细胞及CAR-T细胞联合在抗肿瘤中的应用

摘要

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及抗原递呈细胞及CAR‑T细胞联合在抗肿瘤中的应用。更为具体的，本发明涉及抗原递呈细胞及CAR‑T细胞在联合制备用于治疗肿瘤的药物中应用，其中所述抗原递呈细胞表达有肿瘤抗原，所述CAR‑T细胞的嵌合抗原受体胞外域靶向识别所述肿瘤抗原。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及抗原递呈细胞及CAR-T细胞联合在抗肿瘤中的应用。

背景技术

近些年免疫疗法的发展为肿瘤治疗领域带来深刻的改变，尤其是以PD1/PDL1通路抑制剂为代表的免疫检查点疗法和以CAR-T为代表的过继性细胞疗法。过继性细胞疗法包括TIL、NK、TCR-T、CAR-T等。其中靶向CD19的CAR-T疗法在B细胞肿瘤中取得了优秀的临床疗效，并且在2017年有两款CAR-T产品被FDA批准用于B细胞白血病或者淋巴瘤的治疗。

虽然CAR-T在血液瘤中取得了重大的突破，但其杀伤效果仍需进一步改进。此外CAR-T在实体瘤领域一直进展有限，其中一个重要原因为CAR-T细胞进入体内后存续时间较短，无法保持有效持续的扩增，导致无法保持对肿瘤细胞的持续杀伤效果，进而导致CAR-T对肿瘤的治疗效果差及后续的高复发率。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种抗原递呈细胞及CAR-T细胞在联合制备用于治疗肿瘤的药物中应用，其中所述抗原递呈细胞表达有肿瘤抗原，所述CAR-T细胞的嵌合抗原受体胞外域靶向识别所述肿瘤抗原。

本发明的第二目的在于提供一种抗原呈递细胞，其表达有肿瘤抗原并过表达利于激活CAR-T细胞的细胞因子。

本发明的第三目的在于提供一种细胞药物制剂，其包含a)或b)：

a)独立包装或混合在一起的抗原递呈细胞及CAR-T细胞；

其中所述抗原递呈细胞及所述CAR-T细胞如上所定义；

b)如上所述的抗原呈递细胞。

本发明将抗原递呈细胞及CAR-T细胞联用，能显著促进CAR-T细胞增殖并增强CAR-T杀伤肿瘤作用，还能增加CAR-T细胞在实体瘤中的浸润水平。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为基于腺病毒的表达载体表达框的示意图；

图2为DC细胞诱导成熟1、3、5天后表型分析检测

图3为CLDN18.2在DC上的表达情况检测；

图4为CLDN18.2 CAR-T构建后对CAR分子阳性率的检测；

图5为CLDN18.2 CAR-T细胞对于不同细胞系的杀伤检测；

图6为DC-182、DC-182.IL12、DC-182.CXCL9、DC-182.IL12.CXCL9在体外促进CLDN18.2 CAR-T增殖；

图7为DC-182、DC-182.IL12、DC-182.CXCL9、DC-182.IL12.CXCL9在体外提高CLDN18.2 CAR-T中心记忆表型的比例；

图8为DC-182、DC-182.IL12、DC-182.CXCL9、DC-182.IL12.CXCL9在体外提高CLDN18.2 CAR-T杀伤靶细胞NUGC4的能力；

图9为DC-182、DC-182.IL12、DC-182.CXCL9、DC-182.IL12.CXCL9在体外提高CLDN18.2 CAR-T与靶细胞NUGC4共孵育时能够提高细胞因子(IFN-γ，TNF-α，IL2)释放的水平；

图10为DC-182.IL12.CXCL9促进CAR-T细胞清除肿瘤；

图11为CAR-T在小鼠外周血中的增殖情况；

图12为小鼠肿瘤组织中CAR-T的免疫荧光染色。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2％，可以允许±0.1％范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1％、±2％、±5％等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10％的波动。

本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

本发明涉及一种抗原递呈细胞及CAR-T细胞在联合制备用于治疗肿瘤的药物中应用，其中所述抗原递呈细胞表达有肿瘤抗原，所述CAR-T细胞的嵌合抗原受体胞外域靶向识别所述肿瘤抗原。

本发明将抗原递呈细胞及CAR-T细胞联用治疗肿瘤，能显著增加CAR-T细胞在肿瘤中的浸润水平、促进CAR-T细胞增殖并增强CAR-T杀伤肿瘤作用。

在一些实施方式中，所述肿瘤抗原在所述抗原递呈细胞中是外源基因过表达得到的。

在本发明中“外源基因过表达”是指将目的基因通过人工导入细胞并大量表达的过程。通常的导入细胞的方法是将目的基因构建到工具载体上，导入细胞使基因实现大量转录和翻译，从而实现基因产物的过表达；也可以通过电转或脂质体转导等方式将目的基因导入细胞。工具载体通常包括原核表达载体、普通真核表达载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等。

“过表达”则包含“外源基因过表达”以及“内源基因的过表达”，后者指细胞本身可表达目的基因，可通过诸如CRISPR-dCas9转录激活等手段以提高其表达量。

在一些实施方式中，所述药物不包含用于核酸转染的试剂。

术语“肿瘤抗原”是肿瘤细胞高表达的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原，这些抗原通常由肿瘤细胞经过基因变异(如基因点突变、基因缺失、基因移位、基因融合)等产生，又称肿瘤新抗原(neo-antigen)。

CAR-T细胞即表达嵌合抗原受体的T细胞，T细胞可以为本领域所熟知的亚类，例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、MAIT细胞、NKT细胞以及γδT细胞中的一种或多种。

在本发明中，肿瘤包括实体瘤和血液瘤。“血液瘤”主要包括各类白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。“实体瘤”包括：骨、骨连接、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、毛细血管、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、脊髓、脑脊液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处病变生成的肿瘤。

本发明中所述肿瘤抗原是本领域技术人员所公知的，其包括肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen，TSA)和肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)，例如选自以下抗原或其功能片段组成的组中的任一种或多种：α-甲胎蛋白(AFP)、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、BMCA、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD37、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CLDN家族蛋白、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、纤维母细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、GD2、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和它的亚单位、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导性因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、间皮素(MSLN)、胰腺癌粘蛋白、PD1受体、前列腺干细胞抗原(PSCA)、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、滋养层细胞表面抗原2(TROP2)、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆逊-弗雷登里希抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志物、bc1-2、bc1-6、Kras、致癌基因标志物和致癌基因产物。较为优选的实体瘤特异性抗原选自CLDN家族蛋白、Ep-CAM、FAP、PSCA、TROP2和MSLN。CLDN家族蛋白可以选自CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN5、CLDN6、CLDN7、CLDN8、CLDN9、CLDN10、CLDN11、CLDN12、CLDN15、CLDN16、CLDN18(CLDN18.1或CLDN18.2)、CLDN20、CLDN23。

在一些实施方式中，所述抗原递呈细胞为天然细胞，例如专职抗原递呈细胞，包括树突状细胞、巨噬细胞或B细胞。在一些实施方式中，所述抗原递呈细胞不包括人工抗原提呈细胞(aAPC)。

在一些实施方式中，所述抗原递呈细胞过表达利于激活CAR-T细胞的细胞因子。细胞因子可以为白介素、IFN、TNF、CSF、趋化因子、生长因子中的一种或多种。“激活CAR-T细胞”可理解为诱导T细胞的活化和/或促进T细胞增殖和/或促进T细胞的浸润作用；在一些实施方式中，细胞因子协助所述抗原提呈细胞激活CAR-T细胞；在另一些实施方式中，细胞因子直接激活CAR-T细胞。白介素可选自IL1～IL36中的一种或多种。在一些实施方式中，所述白介素包括IL12。趋化因子可选自CXCL1～19、CCL1～28、XCL1、XCL2、CX3CL1中的一种或多种。在一些实施方式中，所述趋化因子包括CXCL9。在一些实施方式中所述抗原递呈细胞过表达IL12和CXCL9。

当抗原递呈细胞表达多种蛋白时，例如肿瘤抗原及一种或多种细胞因子，可以将它们用诸如2A肽(如T2A、P2A、E2A、F2A)一类的可自我剪切的短肽串联起来，以便于表达，也可分别转入抗原递呈细胞。

在一些实施方式中，所述胞外域为sc-Fv、Fab、scFab、scFab、scIgG或V

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是指包含能够结合抗原的胞外结构域、衍生自不同于衍生胞外结构域的多肽的多肽的跨膜结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。“嵌合抗原受体(CAR)”有时称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指可结合特定抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知在细胞中作为传输信号以引起生物过程的活化或抑制的结构域起作用的任何寡肽或多肽。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含其包含铰链区、跨膜区和胞内信号传导区；

如本文所用，所述嵌合抗原受体中所包含的“区”或者“域”是指多肽中的一个区，其可以独立于其它区而折叠成为特定结构。这些“区”或者“域”可以是鼠源或其他动物源性的序列，优选为人源序列。

在一些实施方式中，所述铰链区为CD8或CD28的hinge区；

在一些实施方式中，所述跨膜域选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和NKG2C中的一种。

在一些实施方式中，所述胞内信号传导区包括CD3ζ信号传导域。

在一些实施方式中，所述胞内信号传导区还包括选自如下蛋白或其胞内信号传导区中的一种或多种：CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40-MyD88、DAP12、DAP10以及2B4。

在一些实施方式中，所述肿瘤抗原为CLDN18.2，所述胞外域的氨基酸序列选自SEQID NO：8～10中的任一项。

在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自SEQ ID NO：5～7中的任一项。

在一些实施方式中，所述肿瘤抗原为CLDN18.2，所述抗原递呈细胞表达SEQ IDNO：1～4中的任一项所示的蛋白。

SEQ ID NO：1～10任一项的的变体亦在本发明的保护范围内，变体可与SEQ IDNO：1～10相应所示序列具有诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体可具有一个或多个氨基酸的缺失、增加或替换；替换通常是保守的，通常视为保守置换的置换是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置换、羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香残基Phe、Tyr间的置换。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,TheBenjamin/CummingsPub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

根据本发明的再一方面，还涉及一种抗原呈递细胞，其表达有肿瘤抗原并过表达利于激活CAR-T细胞的细胞因子；

其中所述肿瘤抗原如上所定义；

所述细胞因子如上所定义；

所述抗原呈递细胞如上所定义。

本发明还涉及一种细胞药物制剂，其包含a)或b)：

a)独立包装或混合在一起的抗原递呈细胞及CAR-T细胞；

其中所述抗原递呈细胞及所述CAR-T细胞如上所定义；

b)如上所述的抗原呈递细胞。

在一些实施方式中，所述细胞药物制剂还包含药学上可接受的辅料。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括当与活性组分组合时允许所述组分保持生物学活性并且与受试者的免疫系统不发生反应的任何材料。实例包括但不限于标准药物载剂(诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液))和各种类型的润湿剂中的任一者。用于气雾剂或肠胃外施用的示例性稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9％)盐水。包含此类载剂的组合物通过熟知的常规方法来配制(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，A.Gennaro编,Mack PublishingCo.,Easton,PA,1990；和Remington,TheScience andPractice of Pharmacy,第21版,Mack Publishing,2005)。

在一些实施方式中，所述细胞药物制剂是冷冻的或低温保存的。

在一些实施方式中，所述细胞药物制剂可以包含在一种细胞递送媒介中(如注射器等)。

在一些实施方式中，所述细胞药物制剂不包含用于核酸转染的试剂。

在一些实施方式中，所述细胞药物制剂包含至少10

根据本发明的再一方面，还涉及一种治疗有需要的患者的肿瘤的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的如上所述的细胞药物制剂。

术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

应该理解的是，设想的治疗方法还将包括施用其他免疫治疗实体，特别优选为免疫治疗实体，包括病毒癌症疫苗(例如，编码癌症特异性抗原的腺病毒载体)、细菌癌症疫苗(例如，表达一种或多种癌症特异性抗原的非热原性大肠杆菌)、酵母癌症疫苗、N-803(也被称为ALT-803，ALTOR生物科学公司)、和抗体(例如，与肿瘤相关抗原或患者特异性肿瘤新抗原结合)、干细胞移植物(例如，异体或自体)和肿瘤靶向细胞因子(例如，NHS-IL12，IL-12与肿瘤靶向抗体或其片段偶联)。

“患者”是哺乳动物，哺乳动物包括但不限于人、猴子、猪和其他农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、大熊猫、啮齿动物(包括小鼠、大鼠、豚鼠)等。

在一些实施方式中，所述CAR-T细胞与所述抗原提呈细胞同时给药，优选以混合物的形式给药。在一些实施方式中，所述CAR-T细胞与所述抗原提呈细胞分开给药，例如先给予CAR-T细胞再给予抗原提呈细胞，或者先抗原提呈细胞再给予CAR-T细胞；间隔时间可以为1～50天，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40天。间隔时间以最后一次给予CAR-T细胞至第一次给予抗原提呈细胞计算；或者，以最后一次给予抗原提呈细胞至第一次给予CAR-T细胞计算。也可以将二者交替给药。CAR-T细胞/抗原提呈细胞的给药次数独立地选自1、2、3、4、5、6或更多次。

在一些实施方式中，所述CAR-T细胞与所述抗原提呈细胞的数量比为50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

实施例1表达CLDN18.2的DC细胞构建

为了构建过表达CLDN18.2的DC细胞，我们首先构建了基于腺病毒的表达载体，该腺病毒表达载体编码序列如下表所示，并见示意图见图1。该腺病毒载体由CRO公司进行合成和制备。具体序列参见表1。

表1

DC细胞制备：通过Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血PBMC，通过磁珠分选CD14+单核细胞，使用DC专用培养基加入GM-CSF(800IU/ml)，IL-6(500IU/ml)诱导分化为未成熟DC细胞，通过加入IL-1beta(10ng/ml)，IL-6(10ng/ml)，TNF-a(10ng/ml)，PGE2(10ng/ml)诱导未成熟DC细胞成熟，通过FACS检测CD80+CD86+CD83+成熟DC细胞诱导比例。DC的表型检测结果如图2所示，说明DC细胞已经成功分化和诱导成熟。

DC细胞转导：在成熟DC细胞中加入上述各腺病毒或空腺病毒载体对照H225，在转导3天之后检测CLDN18.2在DC上的表达，结果如图3所示，CLDN18.2在DC细胞上成功表达。进一步的，我们检测了各载体转导后DC细胞上清中IL12或者CXCL9的分泌情况，结果如表2所示。

表2各DC细胞分泌细胞因子检测

实施例2CLDN18.2 CAR-T细胞的构建

1.CLDN18.2 CAR的质粒构建：

CAR不同模块部分的基因片段由CRO公司进行引物合成后按照常规的基因合成技术合成后，再使用常规分子克隆技术进行克隆构建得到。相关序列如表3所示。若未特殊说明，以下实施例中所示CLDN18.2 CAR-T细胞均为CAR1。

表3

CLDN18.2 Binder1、Binder2、Binder3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：8、SEQIDNO：9、SEQ ID NO：10所示。

2.CLDN18.2 CAR的病毒包装

将抽提好的中抽质粒进行慢病毒包装，具体步骤如下：

1)实验前需确认293T细胞状态(包括细胞形态、扩增状况、传代数小于15代)；

2)第一天铺板293T细胞(T75培养瓶约接种6-7×10

3)第二天包病毒前，需确认293T细胞汇合度在70％-80％以上，且小于95％，并进行等体积换液，换液后继续培养，等待Tube A和Tube B混合液准备好；

4)分别配置Tube A和Tube B(T175和T75体积不同，具体如下所述)，并进行颠倒或者低速振荡混匀；

T175体系：

Tube A：Opti-MEM(4.6ml)+Lipo3000(129μl)

Tube B：Opti-MEM(4.6ml)+P3000(111μl)+辅助质粒PZ201/PZ202/PZ203(41.4μg，1：1：1质量比)+CAR分子质粒(13.8μg)；

T75体系：

Tube A：Opti-MEM(2ml)+Lipo3000(55μl)

Tube B：Opti-MEM(2ml)+P3000(46μl)+辅助质粒PZ201/PZ202/PZ203(18μg，1：1：1质量比)+CAR分子质粒(6μg)。

5)将Tube A加入到Tube B中，振荡混匀，室温孵育15分钟；

6)将第3步中换过液的培养瓶翻面，使培养基处于培养瓶另一面，将Tube A+B混合物加入，轻摇混匀后，再将培养瓶缓慢翻回正面；

7)放回培养箱中培养2天后，收集上清，500g离心10min，用0.45μm滤器过滤上清至50ml离心管中，包好封口膜，10000g，4℃离心2h，可见沉淀；

8)在生物安全柜中，弃上清，将离心管倒扣在外科用纱布上，3min后，取新的纱布轻轻擦拭管内壁，注意不要碰到沉淀；

9)用200μl X-vivo培养基溶解沉淀后，取2μl进行滴度测定，剩余贴好标签，标明LV病毒ID编号、制备批次、制备人和分装体积，后置于-80℃保存。

3.CLDN18.2 CAR-T细胞的构建

首先从健康人PBMC中分离得到T细胞，使用CD3/CD28抗体激活T细胞。激活24h后使用上述慢病毒感染T细胞。24h后将培养基替换为完全培养基(X-VIVO+5％FBS+IL2)以洗去残留的慢病毒。细胞扩增2天后检测CAR分子阳性率，5天后用于功能实验。如图4所示，CAR-T细胞阳性率为46％，构建成功。

4.CLDN18.2 CAR-T细胞杀伤靶细胞能力验证

我们进一步使用LDH的方法验证了CLDN18.2 CAR-T杀伤靶细胞的能力。NUGC4细胞为CLDN18.2阳性靶细胞，293T细胞为CLDN18.2阴性对照细胞。如图5所示，结果显示，CLDN18.2 CAR-T能够有效且呈剂量依赖性杀伤靶细胞NUGC4，但是不杀伤阴性对照细胞293T。说明CLDN18.2CAR-T细胞能够特异性杀伤CLDN18.2阳性靶细胞。

实施例3表达CLDN18.2的DC在体外促进CLDN18.2 CAR-T细胞增殖

为了验证表达CLDN18.2的DC是否能够在体外促进CAR-T细胞增殖，我们将表达18.2的DC和CLDN18.2 CAR-T以不同比例(1:10、1:20、1:30)共孵育，同时以未转导DC细胞作为对照与CLDN18.2 CAR-T共孵育(1:10)，共孵育5天后检测了CAR-T细胞的增殖情况。结果如图6A所示，相对于对照DC细胞，DC-182明显促进了CAR-T的增殖能力。检测CAR阳性率结果显示DC-182的刺激可以提高CAR阳性率(图6B)。我们进一步研究了增加IL12和/或CXCL9的DC-182.IL12、DC-182.CXCL9、DC-182.IL12.CXCL9对于CAR-T的增殖效果。结果如图6C和6D所示，DC-182.IL12、DC-182.CXCL9、DC-182.IL12.CXCL9均可促进CAR-T细胞的增殖(6C)和阳性率(6D)升高。

实施例4表达CLDN18.2的DC在体外提高CLDN18.2 CAR-T细胞中心记忆表型水平

我们进一步验证了表达CLDN18.2的DC是否能够在体外促进CAR-T细胞增殖，我们将表达18.2的DC和CLDN18.2 CAR-T共孵育五天后检测了CAR-T细胞上CCR7和CD45RA的表达。结果如图7所示，DC-182、DC-182.IL12、DC-182.CXCL9、DC-182.IL12.CXCL9能够提高中心记忆表型T细胞(Tcm)比例。其中DC-182.IL12组CAR-T细胞的Tcm比例最高。

实施例5表达CLDN18.2的DC在体外提高CLDN18.2 CAR-T细胞杀伤靶细胞以及细胞因子分泌的能力

为了验证CAR-T细胞在表达CLDN18.2的DC体外刺激后杀伤靶细胞能力的区别，我们首先讲CAR-T细胞分别与DC-182、DC-182.IL12、DC-182.CXCL9、DC-182.IL12.CXCL9或者Mock DC细胞共孵育五天，之后将各CAR-T细胞与靶细胞NUGC4共孵育(效靶比为1:3,1:1,3:1)检测了杀伤能力。结果如图8所示DC-182、DC-182.IL12、DC-182.CXCL9、DC-182.IL12.CXCL9刺激后的CAR-T细胞杀伤NUGC4的能力显著高于Mock DC或者无刺激的CAR-T细胞。我们进一步分析了刺激后的CAR-T细胞与NUGC4共孵育后细胞因子IFN-γ的分泌水平，结果显示修饰后的DC刺激后的CAR-T细胞均能被NUGC4激活和释放IFN-γ，其具体的释放水平排序为DC-182.IL12.CXCL9>DC-182.CXCL9>DC-182.IL12>DC-182(图9)。此结果说明CXCL9和IL12能够提高DC激活CAR-T的水平。

实施例6表达CLDN18.2的DC在体内促进CLDN18.2 CAR-T细胞清除肿瘤

为了进一步验证过表达CLDN18.2的DC细胞能否在体内与CAR-T协同作用清除肿瘤，我们进行了基于NUGC4-luc肿瘤模型药效实验。

NUGC4-luc肿瘤模型构建：人胃癌细胞NUGC-4-luc以RPMI1640培养基添加10％FBS培养于含5％CO

实施例7表达CLDN18.2的DC在体内促进CLDN18.2 CAR-T细胞增殖和肿瘤浸润

为了进一步探索DC-182.IL12.CXCL9增强CAR-T功能的作用机制，我们检测了小鼠外周血中CAR-T的水平和肿瘤中CAR-T的浸润水平。首先在DC给药前和给药后14天使用FCM检测了CAR-T的水平，结果如图11所示，在DC给药前，各组小鼠CAR-T在外周血中均处于较低水平(0～0.5)，而在DC给药后14天，DC-182.IL12.CXCL9的水平明显升高，而MOCK DC组无明显变化。以上结果说明DC-182.IL12.CXCL9能够有效增强CAR-T的体内增殖。我们进一步在实验终点收集了肿瘤组织，通过hCD45进行免疫荧光染色检测肿瘤中的CAR-T浸润情况。结果如图12所示，DC-182.IL12.CXCL9的处理显著增加了CAR-T细胞在肿瘤中的浸润水平。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州易慕峰生物科技有限公司

<120> 抗原递呈细胞及CAR-T细胞联合在抗肿瘤中的应用

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<170> PatentIn version 3.3

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