治疗肺炎支原体感染的药物的筛选方法与波形蛋白的应用

摘要

本发明涉及医学微生物学与免疫学领域，尤其涉及治疗肺炎支原体感染的药物的筛选方法与波形蛋白的应用。本发明通过对肺炎支原体P1蛋白羧基端的1,160～1,498位氨基酸肽段进行表达纯化，以此作为筛选治疗支原体感染相关疾病的药物的制剂。结果表明波形蛋白能与肺炎支原体P1蛋白发生相互作用，且能通过抑制肺炎支原体对人呼吸道上皮细胞的黏附从而治疗肺炎支原体感染。

说明书

技术领域

本发明涉及医学微生物学与免疫学领域，尤其涉及治疗肺炎支原体感染的药物的筛选方法与波形蛋白的应用。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是一类特殊的病原体，细胞壁的缺失使其具有多形性，该病原菌常引起下呼吸道感染，如肺炎、咽炎和气管炎，是社区获得性肺炎(CAP)的主要病因。Mp仅对人类有致病性，可通过飞沫和气溶胶在人群中传播，因此，Mp的感染及爆发常出现于学校、军队和社区等人员密集的场所，其感染的临床表现为咳嗽、发热、头痛、肌肉酸痛、全身乏力等。尽管Mp的感染常不致命，但也存在不少出现难治性肺炎和肺外并发症的严重病例，该菌引起的肺外并发症常见的有中枢神经系统疾病，如脑炎和视神经炎，以及皮肤疾病，如斑丘疹和带状疱疹。Mp引起的感染病程多绵延反复，给患者带来极大痛苦，甚至可留下长期后遗症。然而随着抗生素的滥用日益严重，耐大环内酯类Mp在多地涌现，使得各医院对Mp的治疗束手无策。因此，对Mp致病机制的研究能够为Mp的防治提供新的策略。

Mp对宿主呼吸道上皮细胞的黏附是其致病的首要条件。Mp拥有多种黏附蛋白，如P30、P40、P90等，这些蛋白与P1蛋白相辅相成，构成Mp的顶端结构，使得Mp能牢固黏附于细胞膜表面，汲取宿主细胞内的营养物质，引起反复感染。同时，Mp在宿主细胞表面的生存也表明宿主细胞表面必定存在某种能与Mp结合的受体。

已有研究证实在宿主细胞膜上存在多种能与病原微生物发生特异结合的受体，而关于Mp在宿主细胞膜上的受体也有一些报道，相关研究报道了Mp能附着于末端含有Gal(3SO

Mp导致患者致病的主要机制为对宿主细胞的黏附、毒素的释放以及Mp引起的免疫病理反应。Mp对呼吸道上皮细胞的黏附是其发病机制的初始步骤，由位于Mp顶端结构的黏附细胞器介导。相关研究表明，缺乏黏附能力的Mp菌株通常也缺乏致病性，说明Mp对细胞的黏附是致病的关键。Mp的黏附细胞器主要由P1、P30、P40、P90和HMW1-3组成。其中，分子量为170kDa的P1蛋白是Mp最重要的黏附蛋白。P1蛋白由P1操纵子编码，该操纵子同时编码P40与P90，P1二聚体与P90二聚体构成一个异四聚体复合体——P1黏附素，参与Mp对宿主的黏附以及Mp在宿主细胞上的滑行运动。研究表明，P1蛋白可直接与宿主细胞膜表面受体结合，其氨基酸序列由三个预测结构域和一个跨膜片段组成，结构域Ⅰ高度保守，跨膜片段位于结构域II与Ⅲ之间。

研究表明P1蛋白的黏附表位位于其羧基末端，且该端具有强免疫原性。此外，相关研究人员也发现P1蛋白还可被菌体主动释放至细胞外环境，从而引起自身免疫反应或充当免疫诱饵。毫无疑问，P1蛋白在Mp的致病过程中发挥至关重要的作用。然而，P1蛋白的受体及具体的黏附机制至今尚未阐明。

病毒铺覆蛋白印迹技术(Virus overlay protein blot assay,VOPBA)是蛋白-蛋白相互作用研究中常用的一项技术，利用免疫印迹的原理，对特定病毒的受体蛋白进行筛选，VOPBA技术成熟、灵敏度高。高灵敏度带来的的低特异性使得需要更多的实验以验证VOPBA的结果。Far-western blotting、co-IP等经典实验均可用于两特定蛋白相互作用的进一步鉴定。

波形蛋白是一种细胞骨架蛋白，属于Ⅲ型中间丝蛋白，主要表达于间充质细胞中，如成纤维细胞、内皮细胞等。波形蛋白不仅在维持细胞形态、运动和分裂中发挥作用，也与病原体感染、肿瘤侵袭和信号转导过程密切相关。研究证实波形蛋白参与细胞的黏附与迁移，波形蛋白的缺失可影响伤口愈合及创面修复。此外，波形蛋白目前被认为是EMT的典型标志，其在肿瘤细胞内的异常表达可增加肿瘤细胞的侵袭性，如在直肠癌、肺癌、乳腺癌和胶质母细胞瘤中，波形蛋白的表达水平上升，增加了细胞的迁移与侵袭。

在病原体感染过程中，早已有多项研究表明波形蛋白可在胞内、胞外发挥重要作用。在SARS-CoV对Vero E6细胞的感染过程中，波形蛋白通过直接与刺突-ACE2复合物相互作用参与病毒进入细胞的过程，随着波形蛋白表达降低，细胞对病毒刺突蛋白的摄取急剧减少；EV71以波形蛋白为黏附受体，实现病毒跨血脑屏障的转运，促进病毒进入脑实质、单核李斯特菌也被证实以同样的方式穿透血脑屏障，引起危及生命的脑膜炎和脑炎。除HPV-16外，多数病原体通过波形蛋白入侵宿主细胞后，通过多种不同的机制诱导波形蛋白的表达增加。而波形蛋白的上调为更多的病原体的黏附和侵袭提供了条件，从而保证病原体的稳定定植。而Mp与波形蛋白间的相互作用是否能上调宿主细胞中波形蛋白的表达有待进一步研究。在蓝舌病毒的感染过程中，波形蛋白通过与VP2蛋白结合，驱动成熟病毒颗粒的释放，波形蛋白的破坏可导致病毒颗粒无法在细胞中释放和积累。此外，波形蛋白还参与着登革病毒和HIV-1的病毒复制复合物的合成。波形蛋白似乎在宿主细胞中病原体的增殖和释放中也发挥着积极的作用。

宿主细胞表面的受体，尤其是那些直接与病原体相互作用的受体，与病原体的致病性密切相关。金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌和肠球菌等，这些细菌通过与纤连蛋白结合而致病。因此，宿主细胞上的受体与病原体的定植有密切关系。除了与定植相关，病原体与受体结合后引起的细胞信号转导的变化也促进了微生物的进一步入侵、致病和增殖。如轮状病毒的VP4刺突蛋白通过与宿主PRAF1相互作用来增强病毒在宿主体内的组装；传染性黄热病病毒颗粒的释放由NS3和ALIX之间的相互作用介导。研究表明，生殖支原体可通过与人尿道上皮细胞膜上的黏附受体亲环素A相互作用而促进细胞分泌促炎症细胞因子和抑制细胞凋亡，从而造成持续性感染。因此，研究病原体和细胞受体之间的相互作用可以更好地理解病原体的致病机制，同样也有助于开发新的潜在的药物靶点，然而，P1蛋白的受体及具体的黏附机制至今尚未阐明，而Mp作为一类常见的病原菌，必定也存在着某种与之相互作用的受体蛋白等待揭示，因此本发明旨在发现这种受体蛋白。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供治疗肺炎支原体感染的药物的筛选方法与波形蛋白的应用。在本发明中，发现波形蛋白表达量的减少使得Mp对宿主呼吸道上皮细胞的黏附量降低；波形蛋白表达量的增加则导致了Mp黏附量的增加。

本发明提供了如下I～V中的至少一种在制备治疗支原体感染相关疾病药物中的应用；

I：具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的波形蛋白；

II：在波形蛋白的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且与波形蛋白具有相同或相似功能的蛋白；

III：编码I或II所述波形蛋白的核酸分子；

IV：在III的所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子；

V：能够调控I～IV中的至少一种的水平或活性的物质。

本发明所述的应用中，所述支原体感染相关疾病包括由Mp感染引起的支原体肺炎。研究发现，波形蛋白可以阻断Mp对呼吸道上皮细胞的黏附。本发明所述的波形蛋白具有如SEQ ID NO.1的氨基酸序列，或者为与SEQ ID NO.1所述波形蛋白具有相似功能的蛋白，本发明不做限定，凡能实现阻断Mp感染的波形蛋白，其治疗支原体肺炎的用途皆在本发明的保护范围之内。具体实施例中，记载了用SEQ ID NO.1的波形蛋白验证其与P1蛋白的黏附效果，结果表明，其可与rP1-C特异性地相互作用。

本发明所述的应用中，所述治疗包括抑制Mp对细胞的黏附。本发明试验表明：rP1-C和波形蛋白形成的复合物可被rP1-C或波形蛋白的抗体沉淀。较多的Mp黏附于BEAS-2B细胞膜表面，使用波形蛋白抗体预处理的细胞表面的Mp的量则有所减少，且使用波形蛋白预处理Mp后，Mp对细胞的黏附减少(图8中的C)。上述结果证实了波形蛋白及其抗体可以抑制Mp对细胞的黏附。rP1-C对细胞的黏附情况与Mp相似，同样受到波形蛋白及其抗体的影响(图8中的D-F)。综上，波形蛋白及其抗体抑制了Mp和rP1-C对BEAS-2B细胞的黏附，说明波形蛋白与Mp和rP1-C对细胞的黏附密切相关。

本发明还提供了如下材料中的至少一种：

①编码所述波形蛋白的核酸。

②表达载体，其包括骨架载体和如①所述的核酸。

③宿主，其转化或转染如②所述的表达载体；

④抗体，其由如③所述的宿主表达的波形蛋白免疫动物后产生。

本发明提供的宿主细胞为BEAS-2B细胞。本发明所述的抗体为单抗或者多抗，本发明不做限定。

本发明所述波形蛋白的制备方法，其包括培养所述的宿主，获得含有所述波形蛋白的培养物。本发明所述波形蛋白抗体的制备方法包括以波形蛋白免疫动物，获得含有波形蛋白抗体的腹水或细胞株。

本发明提供了治疗Mp感染相关疾病的药物，其包括波形蛋白和/或所述的抗体。本发明所述的治疗Mp感染相关疾病药物中，包括如前所述I～V中的至少一种，也可包括如前所述①～④中至少一种，本发明对此不做限定。所述药物的剂型可为口服制剂也可为注射剂，或者为吸入式制剂，本发明对此亦不做限定。本发明所述的治疗Mp感染可以外源给予波形蛋白或其抗体，也可以使机体产生内源性的波形蛋白或其抗体。所述的外源给予波形蛋白或其抗体，包括使用含有波形蛋白或其抗体的制剂。所述的使机体产生内源性的波形蛋白或其抗体，包括给予疫苗等制剂。

本发明还提供了治疗Mp感染的方法，其包括给予本发明所述的药物。

为了筛选治疗Mp感染相关疾病的药物，本发明提供了P1蛋白的截短体，记为rP1-C截短体或rP1-C。该片段位于MP黏附蛋白P1的N末端1 160～1498aa，相对于P1蛋白的全长，或其他截短体，本发明所述的rP1-C截短体可以更高效地表达，且更容易被纯化，从而更有效的应用于治疗Mp感染相关疾病的药物的筛选。

本发明还提供了如下材料中的至少一种：

A)编码所述rP1-C截短体的核酸。

B)表达载体，其包括骨架载体和A)所述的核酸。

C)宿主，其转化或转染如B)所述的表达载体。

本发明提供了所述rP1-C截短体蛋白的制备方法，其包括培养所述的宿主，获得含有所述rP1-C截短体蛋白的培养物。

本发明还提供了筛选治疗Mp感染相关疾病的药物的试剂，所述试剂包括rP1-C截短体。本发明中，所述rP1-C截短体具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明所述的筛选治疗支原体感染相关疾病的药物的试剂中，所述试剂中rP1-C截短体的浓度为0.5mg/mL。

本发明所述的试剂中，所述试剂中包括蛋白互作缓冲液，所述蛋白互作缓冲液中包括如下浓度的pH7.4的TBST。

本发明提供了筛选治疗Mp感染相关疾病的药物的方法，所述方法包括使用所述的试剂，检测待筛选的药物是否与rP1-C截短体发生相互作用。

本发明所述方法中，包括将待筛选的药物和rP1-C截短体混合，然后进行相互作用的检测，具体包括：

步骤1：BAES-2B细胞的传代与培养，Mp的传代与培养；

步骤2：重组P1蛋白及其多克隆抗体的表达纯化；

步骤3：检测rP1-C截短体与待筛选的药物的相互作用。

本发明所述的方法中，步骤3所述检测采用Far-Western blotting、间接ELISA、免疫共沉淀和共定位试验。

本发明所述筛选包括：与rP1-C截短体发生互作的待筛选的药物就是潜在的药物。

本发明提供了含有上述任何一种抗原或抗原组合物的试剂盒。

本发明还提供了所述试剂盒在检测Mp抗体中的应用。

本发明采用的Mp抗原是由密码子优化的基因克隆表达的重组抗原，较MP培养提取的抗原浓度高且特异性强。

本发明提供的试剂盒可以特异性的检测临床样本中的抗MP-IgM抗体，从而实现对Mp早期感染的鉴别诊断。

本发明是通过对P1蛋白羧基端的1,160～1,498位氨基酸残基进行了表达纯化，利用改良的VOPBA技术与液相色谱质谱技术(LC-MS)从正常人肺上皮细胞(BEAS-2B)的细胞膜蛋白中筛选相应的能与rP1-C相互作用的蛋白，结果表明波形蛋白及β-4微管蛋白可能与rP1-C发生结合。随后利用Far-western blotting、ELISA和co-IP等技术证实了rP1-C可以与波形蛋白发生特异结合，通过改变细胞内波形蛋白的表达量，发现rP1-C和Mp对细胞的黏附量与波形蛋白的表达量同步改变，因此，通过实验可以证明波形蛋白可能是Mp的P1蛋白黏附宿主细胞的受体。

在本发明中，对Mp主要黏附蛋白P1的受体进行了研究。通过改良的VOPBA法和LC-MS筛选了rP1-C在呼吸道上皮细胞膜上的特异结合蛋白，其中得分最高的为波形蛋白和β-4微管蛋白。随后证实了rP1-C和波形蛋白可以特异性地相互作用，而rP1-C和β-4微管蛋白间无相互作用或结合力较弱。黏附-黏附抑制试验表明，波形蛋白在Mp对宿主细胞的黏附过程中发挥至关重要的作用，由于宿主细胞上存在着多种Mp受体，因此Mp的黏附不能完全被波形蛋白及其抗体所阻断。随着实验进展，证实了细胞上黏附的rP1-C及Mp的量受到细胞中波形蛋白表达水平的影响，上述结果表明，波形蛋白是BEAS-2B细胞上Mp P1蛋白的主要受体；本发明提供含有上述任何一种抗原或抗原组合物的药物或试剂及其在治疗Mp感染相关疾病中的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：

图1示Mp P1基因片段的SDS-PAGE和Western blotting分析图；图1中的A图示在加有IPTG的菌液上清中，分子量约为43kDa处均有一明显条带；图1中的B示，当洗脱的咪唑浓度达70mmol/L时，蛋白纯度较高；

图2示rP1-C截短体的SDS-PAGE及Western-blotting分析图；图2中的A示SDS-PAGE图；图2中的B示Western-blotting分析图，染色后可见43kDa处出现纯度较高的粗蛋白条带，显影结果表明带有His标签的重组P1蛋白被成功表达纯化；

图3示用原核表达并纯化的重组P1蛋白免疫动物后，制备并纯化其多克隆抗体，图3中的A示随着免疫时间的增加抗体滴度的变化，图3中的B示纯化后的多克隆抗体的SDS-PAGE分析，图3中的C示纯化的多克隆抗体的Western-blotting鉴定；

图4示用改良的VOPBA法筛选rP1-C特异结合蛋白：其中1为BEAS-2B细胞膜蛋白的SDS-PAGE分析图，表明膜蛋白的分子量主要分布在10kDa～200kDa范围内，2为在40kDa～55kDa处存在与rP1-C特异结合的蛋白条带；3为BSA对照；

图5示波形蛋白和β-4微管蛋白的鉴定及其分布：其中图5中的A为波形蛋白和β-4微管蛋白的鉴定，图5中的B为用间接免疫荧光检测波形蛋白和β-4微管蛋白的分布，结果证实波形蛋白和β-4微管蛋白均可以分布在胞浆和胞膜上；

图6示波形蛋白和β-4微管蛋白与Mp、rP1-C的共定位，其中图6中的A和B为波形蛋白与Mp、rP1-C的共定位，图6中的C和D为β-4微管蛋白与Mp、rP1-C的共定位；以上结果表明波形蛋白和β-4微管蛋白与Mp、rP1-C能发生共定位；

图7示波形蛋白能与rP1-C发生相互作用，其中图7中的A为Far-Western blotting证实波形蛋白能与rP1-C发生相互作用(其中1为提取的膜蛋白与波形蛋白可发生相互作用，2为BSA对照)，而β-4微管蛋白对照不能与rP1-C发生相互作用(其中3为提取的膜蛋白与β-4微管蛋白不能发生相互作用，4为BSA对照)，图7中的B为用免疫共沉淀证实波形蛋白与rP1-C的相互作用，而β-4微管蛋白不能与rP1-C发生相互作用，图7中的C为间接ELISA法检测波形蛋白与rP1-C的相互作用；

图8示黏附-黏附抑制试验，观察波形蛋白及其抗体是否能抑制rP1-C和Mp对BEAS-2B细胞的黏附；图8中的A示，较多的Mp黏附于BEAS-2B细胞膜表面，使用波形蛋白抗体预处理的细胞表面的Mp的量则有所减少(图8中的B)；使用波形蛋白处理Mp后，Mp对细胞的黏附减少(图8中的C)；上述结果证实了波形蛋白及其抗体可以抑制Mp对细胞的黏附，rP1-C对细胞的黏附情况与Mp相似，同样受到波形蛋白及其抗体的影响(图8中的D、E和F)；

图9示转染siRNA或感染慢病毒后细胞内波形蛋白的表达量，结果表明转染siRNA的细胞中波形蛋白的表达量明显下降(图9中的A和图9中的B)，而过表达细胞株中波形蛋白的表达量明显增加(图9中的C和图9中的D)；

图10示黏附试验结果表明Mp和rP1-C对干扰后的BEAS-2B细胞的黏附量明显低于对照组(图10中的B和图10中的E)，而对过表达稳转细胞株的黏附量明显增多(图10中的C和图10中的F)；图10中A和D为对照siRNA组，这些结果表明波形蛋白的表达水平能影响Mp和rP1-C对细胞的黏附，波形蛋白可能是Mp黏附细胞的主要受体。

具体实施方式

本发明提供了治疗Mp感染的药物的筛选方法与波形蛋白的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中，波形蛋白原始cDNA序列：atgtccaccaggtccgtgtcctcgtcctcctaccgcaggatgttcggcggcccgggcaccgcgagccggccgagctccagccggagctacgtgactacgtccacccgcacctacagcctgggcgacgcgctgcgccccagcaccagccgcagcctctacgcctcgtccccgggcggcgtgtatgccacgcgctcctctgccgtgcgcctgcggagcagcgtgcccggggtgcggctcctgcaggactcggtggacttctcgctggccgacgccatcaacaccgagttcaagaacacccgcaccaacgagaaggtggagctgcaggagctgaatgaccgcttcgccaactacatcgacaaggtgcgcttcctggagcagcagaataagatcctgctggccgagctcgagcagctcaagggccaaggcaagtcgcgcctaggggacctctacgaggaggagatgcgggagctgcgccggcaggtggaccagctaaccaacgacaaagcccgcgtcgaggtggagcgcgacaacctggccgaggacatcatgcgcctccgggaaaaattgcaggaggagatgcttcagagagaggaagccgaaaacaccctgcaatctttcagacaggatgttgacaatgcgtctctggcacgtcttgaccttgaacgcaaagtggaatctttgcaagaagagattgcctttttgaagaaactccacgaagaggaaatccaggagctgcaggctcagattcaggaacagcatgtccaaatcgatgtggatgtttccaagcctgacctcacggctgccctgcgtgacgtacgtcagcaatatgaaagtgtggctgccaagaacctgcaggaggcagaagaatggtacaaatccaagtttgctgacctctctgaggctgccaaccggaacaatgacgccctgcgccaggcaaagcaggagtccactgagtaccggagacaggtgcagtccctcacctgtgaagtggatgcccttaaaggaaccaatgagtccctggaacgccagatgcgtgaaatggaagagaactttgccgttgaagctgctaactaccaagacactattggccgcctgcaggatgagattcagaatatgaaggaggaaatggctcgtcaccttcgtgaataccaagacctgctcaatgttaagatggcccttgacattgagattgccacctacaggaagctgctggaaggcgaggagagcaggatttctctgcctcttccaaacttttcctccctgaacctgagggaaactaatctggattcactccctctggttgatacccactcaaaaaggacattcctgattaagacggttgaaactagagatggacaggttatcaacgaaacttctcagcatcacgatgaccttgaataa

本发明中，波形蛋白的氨基酸序列为(SEQ ID NO.1)：MSTRSVSSSSYRRMFGGPGTASRPSSSRSYVTTSTRTYSLGDALRPSTSRSLYASSPGGVYATRSSAVRLRSSVPGVRLLQDSVDFSLADAINTEFKNTRTNEKVELQELNDRFANYIDKVRFLEQQNKILLAELEQLKGQGKSRLGDLYEEEMRELRRQVDQLTNDKARVEVERDNLAEDIMRLREKLQEEMLQREEAENTLQSFRQDVDNASLARLDLERKVESLQEEIAFLKKLHEEEIQELQAQIQEQHVQIDVDVSKPDLTAALRDVRQQYESVAAKNLQEAEEWYKSKFADLSEAANRNNDALRQAKQESTEYRRQVQSLTCEVDALKGTNESLERQMREMEENFAVEAANYQDTIGRLQDEIQNMKEEMARHLREYQDLLNVKMALDIEIATYRKLLEGEESRISLPLPNFSSLNLRETNLDSLPLVDTHSKRTFLIKTVETRDGQVINETSQHHDDLE

本发明中，优化前的P1截短体原始核苷酸序列：tctaccaccaccgcaacaagggacgccttaccggagcacccgaatgctttggcctttcaggtgagtgtggtggaagcgagtgcttacaagccaaacacgagctccggccaaacccaatccactaacagttccccctacctgcacttggtgaagcctaagaaagttatccaatccgacaagttagacgacgatcttaaaaacctgttggaccccaaccaggttcgcaccaagctgcgccaaagctttggtacagaccattccacccagccccagccccaatcgctcaaaacaacgacaccggtatttgggacgagtagtggtaacctcagtagtgtgcttagtggtgggggtgctggagggggttcttcaggctcaggtcaatctggcgtggatctctcccccgttgaaaaagtgagtgggtggcttgtggggcagttaccaagcacgagtgacggaaacacctcctccaccaacaacctcgcgcctaatactaatacggggaatgatgtggtgggggttggtcgactttctgaaagcaacgccgcaaagatgaacgacgatgttgatggtattgtacgcaccccactcgctgaactgttagatggggaaggacaaacagctgacactggtccacaaagcgtgaagttcaagtctcctgaccaaattgacttcaaccgcttgtttacccacccagtcaccgatctgtttgatccggtaactatgttggtgtatgaccagtacataccgctgtttattgatatcccagcaagtgtgaaccctaaaatggttcgtttaaaggtcttgagctttgacaccaacgaacagagcttaggtctccgcttagagttctttaaacctgatcaagatacccaaccaaacaacaacgttcaggtcaatccgaataacggtgacttcttaccactgttaacggcctccagtcaaggtccccaaaccttgtttagtccgtttaaccagtgacctgattacgtgttgccgttagcgatcactgtacctatt

本发明中，优化后的p1截短体核苷酸序列：tctaccaccaccgcaacaagggacgccttaccggagcacccgaatgctttggcctttcaggtgagtgtggtggaagcgagtgcttacaagccaaacacgagctccggccaaacccaatccactaacagttccccctacctgcacttggtgaagcctaagaaagttatccaatccgacaagttagacgacgatcttaaaaacctgttggaccccaaccaggttcgcaccaagctgcgccaaagctttggtacagaccattccacccagccccagccccaatcgctcaaaacaacgacaccggtatttgggacgagtagtggtaacctcagtagtgtgcttagtggtgggggtgctggagggggttcttcaggctcaggtcaatctggcgtggatctctcccccgttgaaaaagtgagtgggtggcttgtggggcagttaccaagcacgagtgacggaaacacctcctccaccaacaacctcgcgcctaatactaatacggggaatgatgtggtgggggttggtcgactttctgaaagcaacgccgcaaagatgaacgacgatgttgatggtattgtacgcaccccactcgctgaactgttagatggggaaggacaaacagctgacactggtccacaaagcgtgaagttcaagtctcctgaccaaattgacttcaaccgcttgtttacccacccagtcaccgatctgtttgatccggtaactatgttggtgtatgaccagtacataccgctgtttattgatatcccagcaagtgtgaaccctaaaatggttcgtttaaaggtcttgagctttgacaccaacgaacagagcttaggtctccgcttagagttctttaaacctgatcaagatacccaaccaaacaacaacgttcaggtcaatccgaataacggtgacttcttaccactgttaacggcctccagtcaaggtccccaaaccttgtttagtccgtttaaccagtggcctgattacgtgttgccgttagcgatcactgtacctatt

本发明中，优化后的P1截短体氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：STTTATRDALPEHPNALAFQVSVVEASAYKPNTSSGQTQSTNSSPYLHLVKPKKVIQSDKLDDDLKNLLDPNQVRTKLRQSFGTDHSTQPQPQSLKTTTPVFGTSSGNLSSVLSGGGAGGGSSGSGQSGVDLSPVEKVSGWLVGQLPSTSDGNTSSTNNLAPNTNTGNDVVGVGRLSESNAAKMNDDVDGIVRTPLAELLDGEGQTADTGPQSVKFKSPDQIDFNRLFTHPVTDLFDPVTMLVYDQYIPLFIDIPASVNPKMVRLKVLSFDTNEQSLGLRLEFFKPDQDTQPNNNVQVNPNNGDFLPLLTASSQGPQTLFSPFNQWPDYVLPLAITVPI

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例

1、实验方法

1.1 BAES-2B细胞的传代与培养

BEAS-2B细胞为贴壁细胞，使用BEGM(Lonza,cc-3170)培养基进行培养。

1.2 Mp的传代与培养

使用PPLO培养基对MpFH标准株进行培养，将冻存的Mp室温融化后，按照菌液:培养基1:20的比例进行传代，即向5mL离心管中加入3.8mL PPLO培养基，以及200μL菌液，37℃恒温培养箱中培养，随着Mp的生长，产生的酸性物质使得培养基中的酚红指示剂由红变得橙黄，此时Mp处于对数生长期，菌液活性较高，12,000g离心10min，收集Mp进行下一步实验。

1.3重组P1蛋白的表达纯化

1.3.1制备感受态Rosetta菌

(1)制备固体LB平板，取一环菌液于平板连续划线，将其置于37℃温箱培养过夜(12h～16h)；

(2)挑取单个菌落于5mL LB培养基中，37℃220rpm震荡培养12h；

(3)吸取40μL菌液至2mL LB培养基，培养3h，至OD值约0.6时取出；

(4)吸取1mL菌液至无菌Ep管中，冰上孵育5min；

(5)10,000g离心1min，弃上清；

(6)加入预冷的0.1mol/L无菌CaCl

(7)10,000g离心1min，再加入200μL CaCl

1.3.2转化质粒

(1)将装有质粒(4μg)的Ep管瞬离10秒，随后加入40μL无菌无酶水，轻轻混匀；

(2)取2μL质粒加入制备好的感受态菌液中，冰浴30min；

(3)42℃水浴90秒；

(4)冰浴4min；

(5)加入LB液体培养基800μL，充分混匀，37℃220rpm孵育1h；

(6)13,000g离心1min，弃去900μL上清；

(7)余下的菌液吹打混匀后加入到含有卡那霉素的固体LB培养基上，37℃培养过夜。

1.3.3蛋白的诱导表达

(1)将转化后铺板的细菌进行挑菌，挑取8个明显的单个菌落至加有卡那霉素的液体LB培养基中摇菌12h；

(2)均生长良好，选择1号管的菌液连续划线至新的含有卡那霉素的固体LB平板上，培养过夜；

(3)挑取单个菌落于6mL液体LB培养基中增菌4h；

(4)增菌后的菌液以1:40的比例接种至2mL液体LB培养基中，37℃增菌4h，增菌18管；

(5)分别以0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L的IPTG终浓度，以及25℃、30℃、37℃的温度对菌液进行诱导表达，均诱导4h；

(6)10,000g收集菌液，每管加入100μL细菌裂解液(pH7.8)充分混匀，4℃裂解过夜；

(7)使用超声仪进行物理裂解；

(8)10000g离心10min，收集上清，沉淀使用100μL PBS重悬；

(9)每管取20μL样品与5×上样缓冲液混匀，煮沸5min，进行SDS-PAGE分析。

1.3.4蛋白的纯化

(1)以1:40的比例使用1,000mL锥形瓶(600mL含卡那霉素的培养基)对表达菌进行增菌4h；

(2)使用IPTG诱导4h；

(3)使用50mL离心管5000g离心10min收菌；

(4)加入8mL细胞裂解液重悬细菌，并在冰上裂解过夜；

(5)冰上超声裂解60min，功率50％，超声5秒，停15秒；

(6)分装至2mL离心管中，10,000g离心20min，收集上清；

(7)取2mL镍柱，使用去离子水洗涤后，加入细菌裂解液洗涤、平衡；

(8)加入收集的裂解液上清，与镍柱充分混匀，冰上结合5h；

(9)放出、收集裂解液，使用5mmol/L～250mmol/L咪唑对目的蛋白进行洗脱，收集洗脱液进行SDS-PAGE及Western blotting。

1.3.5蛋白的浓缩

(1)使用10kDa的超滤管对重组蛋白进行浓缩，向超滤管内加入蛋白洗脱液，4000g离心至管内约剩余3mL液体；

(2)加入10mL无菌PBS对蛋白进行洗涤，离心至管内约剩余2mL液体，再次加入PBS进行洗涤，共洗涤三次，收集滤网内的液体；

(3)以多粘菌素B:蛋白为1:1,000的比例加入100mg/mL的多粘菌素B，冰箱4℃放置2h，以去除内毒素；

(4)蛋白浓度的测定：使用BCA试剂盒对蛋白浓度进行检测，绘制标准曲线；

按照1:50的比例将BCA试剂盒中的B液与A液混合，制备成工作液，取多个Ep管加入200μL工作液以及25μL不同浓度的标准品、蛋白样品。37℃水浴锅中孵育30min，待各管冷却至室温后，用分光光度计在562nm处检测每个样本的吸光值，绘制标准曲线，计算蛋白浓度。

1.4重组P1蛋白兔源多克隆抗体的制备与纯化

1.4.1免疫动物

购买8周龄雌性新西兰兔3只，待其熟悉环境后，使用纯化的rP1-C进行免疫；将200μgrP1-C与弗氏完全佐剂等体积混合，充分震荡30min，使其完全乳化；对3只新西兰兔进行耳缘静脉采血，收集未免疫时的血清；皮下多点注射免疫新西兰兔，此后使用rP1-C与弗氏不完全佐剂每两周免疫一次，共免疫3次，每次均收集耳缘静脉血；第3次免疫两周后，心脏取血，收集血清。

1.4.2抗体效价的检测

(1)使用1×包被缓冲液将rP1-C稀释至10μg/mL，每孔100μL包被酶标板，4℃包被过夜；

(2)甩去酶标板中的包被液，在滤纸上充分拍干，每孔加入200μL PBST洗涤，洗涤三次，每次5min；

(3)使用PBST配制的5％脱脂牛奶进行封闭，每孔100μL，37℃孵育2h，拍干并洗涤；

(4)将收集的兔血清以1:10,000的比例使用封闭液进行第一步稀释，随后进行倍比稀释，稀释至1:1280,000，分别加入酶标板的各个孔中，37℃孵育2h，拍干并洗涤；

(5)加入1:4,000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗进行孵育，37℃1h，拍干并洗涤5次；

(6)向每孔中加入100μL底物及底物缓冲液混合物，37℃孵育15min，随后每孔滴加1滴终止液终止反应，使用酶标仪检测每孔的A

1.4.3多克隆抗体的纯化

(1)配制饱和硫酸铵溶液，将硫酸铵粉末加入100mL灭菌去离子水中，直至粉末不再溶解，将溶液置于微波炉中，中火加热5min，4℃冷却至结晶析出；

(2)将收集到的兔血清4℃，13,000g离心30min，收集上清，取10mL至50mL离心管中，与等体积的PBS混合，随后向离心管中缓慢滴加20mL饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，于4℃沉淀过夜；

(3)沉淀后的液体13,000g离心10min，小心地吸去上清，使用12mL PBS溶解沉淀，再缓慢滴加8mL饱和硫酸铵，4℃沉淀1h；

(4)沉淀后的液体13,000g离心10min，弃上清，13.3mL PBS溶解沉淀，滴加6.6mL饱和硫酸铵，4℃沉淀1h；

(5)再次离心后，使用8mLPBS溶解初步纯化好的IgG；

(6)对初纯后的IgG进一步纯化：配制pH为2的HCl溶液，称取1g的溴化氰活化的琼脂糖，填入纯化柱中，加入HCl，置于4℃让其吸胀30min，随后用HCl充分洗涤；

(7)使用pH为9.6，浓度为0.05mmol/L的碳酸盐缓冲液，将rP1-C与琼脂糖进行连接，4℃反应过夜；

(8)放出纯化柱中的液体，使用灭菌的PBS洗涤3次，Tris-HCl(0.1mol/L，pH8.0)4℃封闭过夜；

(9)放出封闭液，PBS洗涤3次，加入初步纯化的IgG，4℃结合过夜；

(10)放出柱中液体，PBS洗涤纯化柱3次，加入4mLpH2.4的Gly-HCl缓冲液洗脱IgG，反应5min后，收集流出液并立即用1mol/L的NaHCO

1.5改良VOPBA与LC-MS鉴定特异性结合蛋白

1.5.1提取BEAS-2B细胞膜蛋白

(1)弃去细胞瓶中的培养基，2mLPBS洗涤2次，吸干其中PBS，加入600μL胰蛋白酶，消化后使用培养基终止消化，离心收集细胞，共收集8瓶细胞；

(2)加入PBS洗涤细胞3次，随后加入500μL RIPA裂解液，5μL PMSF，冰上裂解细胞30min；

(3)冰上超声裂解10min，功率50％，超声5秒，停15秒；

(4)2,000g离心15min，收集上清；

(5)13,000g离心30min，收集沉淀，用100μLPBS重悬，BCA法检测蛋白浓度并进行SDS-PAGE分析。

1.5.2改良VOPBA

(1)据文献所述进行，取煮好的蛋白样本15μL进行SDS-PAGE；

(2)裁剪两张6×2cm大小的PVDF膜，于甲醇中浸泡1min，取出置于转膜缓冲液中平衡10min；

(3)将剪裁好的PVDF膜置于转膜滤纸上，排除气泡，将切好的分离胶置于PVDF膜上，排出气泡，进行转膜，转膜条件：100V，100min；

(4)TBST配制5％脱脂牛奶40mL，将PVDF膜置于其中，室温封闭2h；

(5)TBST洗膜5次，每次5min，与rP1-C 4℃孵育过夜；

(6)TBST洗膜5次，使用纯化的rP1-C抗体37℃孵育2h；

(7)与HRP标记的羊抗兔二抗(1:5,000稀释)孵育1h，化学发光仪显影。

1.5.3 LC-MS

取细胞膜蛋白样本再次进行SDS-PAGE，行考马斯亮蓝染色2h后脱色过夜，切下目的分子量的凝胶条带，置于1.5mLEp管中密封送至广州辉骏生物科技有限公司进行鉴定。

1.6目的蛋白的鉴定及其在细胞中的分布情况

1.6.1 Western blotting确认目的蛋白

如上所述提取细胞膜蛋白进行SDS-PAGE并转膜；PVDF膜与分别与Vimentin抗体(1:2,000稀释)、β-4Tubulin抗体(1:2,000稀释)4℃孵育过夜；洗涤后，使用HRP标记的羊抗鼠二抗(1:5,000稀释)37℃孵育1h，洗涤5次后显影。

1.6.2间接免疫荧光观察目的蛋白的分布

(1)将灭菌的细胞爬片放入24孔板中，每孔加入900μLBEGM培养基以及100μL细胞悬液，37℃培养24h后，更换新鲜培养基，培养24h后弃去培养基，PBS洗涤细胞3次，每次5min；

(2)每孔加入200μL4％多聚甲醛，室温固定细胞30min；

(3)弃去多聚甲醛，PBS洗涤后加入200μL BEGM培养基，37℃封闭2h；

(4)PBS洗涤后，分别加入150μLVimentin抗体(1:200稀释)、β-4Tubulin抗体(1:200稀释)，37℃孵育2h；

(5)PBS洗涤3次，加入150μLFITC标记的羊抗鼠二抗，避光孵育1h；

(6)弃去二抗，PBS洗涤后，每孔加入150μL DAPI，室温孵育10min；

(7)洗涤后，于玻片上滴加少量抗荧光猝灭剂，爬片细胞面朝下铺至玻片上，使用指甲油进行封片，使用荧光显微镜观察。

1.7 Far-Western blotting、间接ELISA、免疫共沉淀和共定位实验检测rP1-C与目的蛋白的相互作用

1.7.1 Far-Western blotting

配制10％分离胶，每孔加入10μLrP1-C进行SDS-PAGE；转膜后与BEAS-2B细胞膜蛋白悬液进行孵育，4℃过夜；洗涤后，再与Vimentin抗体(1:2,000稀释)、β-4Tubulin抗体(1:2000稀释)4℃孵育6h；孵育二抗后，洗膜，显影。

1.7.2间接ELISA

同上述检测抗体效价，将rP1-C包被于酶标板上，封闭后，加入50μL购买的Vimentin(0.2mg/mL)，37℃孵育2h；洗板后，加入Vimentin抗体(1:1000稀释)，37℃孵育2h；孵育二抗，洗板后，加入底物、底物缓冲液及终止液，酶标仪检测A

1.7.3免疫共沉淀

(1)准备Protein Aagarose工作液：使用PBS将糖珠稀释至50％的浓度；

(2)向装有珠子的Ep管内分别加入rP1-C抗体(1:20稀释)、Vimentin抗体(1:50稀释)以及IgG抗体(1:50稀释)，冰上结合过夜；

(3)使用PBS洗涤珠子3次，以去除多余未结合的抗体；

(4)向Ep管内50μL rP1-C和细胞膜蛋白悬液混合物，冰上混合6h；

(5)PBS洗涤3次，去除未结合的蛋白，剩余的样本使用40μLPBS重悬，混匀，与上样缓冲液混合后煮沸5min进行western blotting。

1.7.4免疫荧光共定位

(1)参考3.6.2的步骤对细胞进行固定、封闭；

(2)洗涤后，向孔内加入100μL Mp(1×10

(3)PBS洗涤后，孔内分别加入200μL Vimentin抗体(1:200稀释)和rP1-C抗体，或200μL Vimentin和抗Mp抗体(1:50稀释)，4℃孵育过夜；

(4)PBS洗涤3次，在避光条件下，加入200μL FITC标记的荧光二抗和Cy3标记的荧光二抗；

(5)DAPI染核后，制片、封片；使用荧光显微镜观察。

1.8 Mp和重组P1蛋白的黏附与黏附抑试验

(1)参考3.6.2的步骤进行固定、封闭；

(2)将细胞分为分组进行实验：

1、空白对照组：细胞经处理后直接与Mp(5×10

2、Vimentin抗体预孵育组：细胞经处理后先与Vimentin抗体37℃孵育2 h，后与Mp(5×10

3、Vimentin预孵育组：Mp及rP1-C先与购买的Vimentin(0.2mg/mL)37℃孵育2h，再加入24孔板中与细胞37℃孵育2h，随后与Mp抗体和rP1-C抗体进行孵育，使用Cy3标记的荧光二抗染色，DAPI染核后，镜下观察。

1.9 siRNA转染后观察Mp和重组P1蛋白对细胞的黏附情况

1.9.1 siRNA的转染

(1)将细胞加入6孔板中培养24h，更换新鲜培养基后，培养过夜；

(2)生物安全柜内冰上溶解siRNA，瞬离后每管加入100μL无酶水，使其浓度为20μM，siRNA序列如下：

(3)将5μL溶解的siRNA加入120μL BEGM培养基中，混匀；

(4)将15μL Lipo2000溶解于720μL BEGM培养基中，混匀；

(5)每管稀释的siRNA中加入125μL溶解好的Lipo2000，混匀，静置10min；

(6)吸出6孔板中的培养基，加入1,750μL新鲜培养基，分别加入混合好的siRNA，37℃培养细胞48h。

1.9.2蛋白表达水平的检测

(1)RT-qPCR：

1、弃去6孔板中的培养基，PBS洗涤细胞3遍，每孔加入1mL TRNzol，室温反应5min，用移液枪充分混匀，冲洗，收至1.5mL无酶Ep管中；

2、每管加入200μL三氯甲烷，震荡15秒，冰上静置3min；

3、12,000g，4℃离心15min，将水相(约400μL)吸至新Ep管；

4、向吸取的水相中加入等体积的异丙醇，混匀，冰上静置10min；

5、12,000g，4℃离心10min，去上清；

6、加入1mL75％乙醇洗涤RNA；

7、10,000g，4℃离心5min，去上清；

8、再次使用乙醇洗涤，离心后去上清，冰上静置晾干；

9、加入20μL无酶水溶解RNA；

10、检测各管RNA浓度，并取1μg RNA进行逆转录；

11、加入4 μL 5×Fastking-RT SuperMix，随后加入无酶水补足至20μL，42℃，反应15min，95℃，反应3min；

12、取2μLcDNA模板，加入10μL2×SuperRealPreMix Plus以及正、反向引物对目的cDNA进行扩增，引物序列如下：

(2)Western blotting：参照3.6.1进行

1.9.3 LSCM观察黏附量的改变

(1)细胞铺至24孔板中，参照3.9.1中所使用的siRNA浓度进行转染；

(2)参考3.6.2的步骤对细胞进行固定、封闭；

(3)向各孔中加入Mp(5×10

(4)洗涤后，加入Mp抗体和rP1-C抗体进行孵育，使用Cy3标记的荧光二抗染色，DAPI染核后，镜下观察。

1.10构建波形蛋白过表达稳转细胞株观察Mp和rP1-C对细胞的黏附情况

1.10.1感染慢病毒

(1)细胞于6孔板中培养24h，更换新鲜培养基后，待细胞密度达80％～90％时，加入终浓度分别为0、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL的嘌呤霉素，测试能够杀死正常细胞株的最低浓度；

(2)细胞于6孔板中培养24h，更换新鲜培养基培养过夜，再次更换新鲜培养基，加入终浓度为8μg/mL的polybrane，孵育30min；使用慢病毒载体CMV-GFP-puro-vimentin分别以MOI＝0、1、3、5、7、9感染细胞，37℃培养24h；

(3)弃去含有病毒的培养基，加入新鲜培养基后继续培养24h；

(4)更换新培养基并加入终浓度为4μg/mL的嘌呤霉素筛选细胞96h；

(5)将筛选出的细胞于LSCM下观察，选择感染效果最好的细胞继续进行培养。

2、实验结果

2.1成功表达、纯化并鉴定了重组P1蛋白

将含有Mp P1基因片段的pET-30a(+)载体转化至E.coli Rosetta菌内，对蛋白进行诱导表达和纯化，并进行SDS-PAGE和Western blotting分析，结果如图1中的A所示，与空白对照组相比，在加有IPTG的菌液上清中，分子量约为43kDa处均有一明显条带(其中M为DNA marker，1和2分别为未诱导组上清和沉淀，3-7为37℃用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/LIPTG诱导的上清，8,10和16为30℃未诱导组上清，11-15为30℃用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L IPTG诱导的上清，17和18分别为25℃未诱导组沉淀和上清，19-23为25℃用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L IPTG诱导的上清。)，其中以温度为37℃，IPTG终浓度为0.8mmol/L时，条带最为明显。选择该条件进行大量诱导表达，利用镍柱进行亲和层析纯化、洗脱后进行SDS-PAGE分析，结果如图1中B所示，当洗脱的咪唑浓度达70mmol/L时，蛋白纯度较高。

对超滤、浓缩后的rP1-C的SDS-PAGE及Western-blotting分析，结果如图2所示，染色后可见43kDa处出现纯度较高的粗蛋白条带，显影结果表明带有His标签的重组P1蛋白被成功表达纯化。

2.2成功制备了兔源重组P1蛋白的多克隆抗体

为制备rP1-C的多克隆抗体，对新西兰兔进行4次免疫后收集血清，检测其抗体效价(图3A)，抗体效价可达1:2,560,000，随后依次使用饱和硫酸铵法和溴化氰活化的琼脂糖4B凝胶进行纯化。结果如图3B所示，在分子量约为50kDa和25kDa处出现了明显的蛋白条带，分别为多克隆抗体的重链和轻链的分子量。随后以rP1-C为抗原，采用Western blotting测定纯化后的血清特异性。如图3C所示，在分子量为43kDa处出现明显条带，表明成功制备并纯化出兔源rP1-C的多克隆抗体。

2.3波形蛋白和β-4微管蛋白最可能是重组P1蛋白的互作蛋白

为筛选rP1-C在BEAS-2B细胞膜上的互作蛋白，提取了BEAS-2B细胞膜蛋白，并进行SDS-PAGE分析。结果表明，膜蛋白的分子量主要分布在10kDa～200kDa范围内(图4)。为鉴定rP1-C的特异结合蛋白，进行了改良的VOPBA实验。如图4所示，PVDF膜上存在多个条带，其中位于55kDa处的条带最明显，并且在对照组的相应位置没有条带。这些结果表明，BEAS-2B细胞膜蛋白中存在一种或多种蛋白能与rP1-C结合，其中结合量最多的位于55kDa左右。

为了鉴定与rP1-C发生特异结合的主要蛋白成分，对膜蛋白进行SDS-PAGE分析，切下位于55kDa处的胶条进行LC-MS分析。根据NCBI数据库检索蛋白质匹配与比较的结果，波形蛋白和β-4微管蛋白的得分最高(表1)。因此，推测波形蛋白和β-4微管蛋白可能是膜蛋白中与rP1-C发生特异结合的主要蛋白。

2.4波形蛋白和β-4微管蛋白主要分布于细胞质和细胞膜中

使用Western blotting及免疫荧光对膜蛋白中的波形蛋白和β-4微管蛋白进行鉴定和定位分析。如图5A所示，经波形蛋白、β-4微管蛋白抗体孵育后，实验组55kDa处出现清晰条带。荧光结果显示，代表波形蛋白和β-4微管蛋白的绿色荧光广泛分布于BEAS-2B细胞的细胞膜和细胞质中(图5B)。

2.5波形蛋白能够与重组P1蛋白发生相互作用

为了确定波形蛋白和β-4微管蛋白是否能与rP1-C相互作用，进行了共定位、Far-western blotting、co-IP和间接ELISA实验。

rP1-C、Mp与波形蛋白在BEAS-2B细胞上的共定位结果如图6A-B，代表rP1-C和Mp的红色荧光主要分布于BEAS-2B细胞的细胞膜上，与代表波形蛋白的绿色荧光发生大面积重合，说明rP1-C及Mp可能与细胞表面的波形蛋白相互作用。rP1-C、Mp与β-4微管蛋白的共定位结果如图6C-D，红、绿两种荧光同样发生重合，表明rP1-C与Mp也可能与β-4微管蛋白发生作用。

而从Far-western blotting的结果中可以看出，经膜蛋白预孵育，并与波形蛋白抗体孵育的PVDF膜上43kDa处有明显条带，对照组无条带，说明波形蛋白可以与rP1-C相互作用。相反，膜蛋白预孵育、β-4微管蛋白抗体孵育组的显影结果显示，PVDF膜上无明显条带，β-4微管蛋白可能不与rP1-C发生作用或两者间的结合力不强(图7A)。

Co-IP结果见图7B，rP1-C与波形蛋白共沉淀效果明显，rP1-C和波形蛋白形成的复合物可被rP1-C或波形蛋白抗体沉淀，而rP1-C与β-4微管蛋白的共沉淀效果不理想。

鉴于rP1-C与β-4微管蛋白间的相互作用无法得到验证，未购买β-4微管蛋白进行间接ELISA。rP1-C与波形蛋白的间接ELISA结果见图7C，实验组的吸光度明显高于阴性对照组，表明波形蛋白对rP1-C具有较高的特异性。

综上，上述结果清楚地证实了波形蛋白可以与rP1-C特异地发生相互作用，而β-4微管蛋白与rP1-C间的结合不显著。

2.6波形蛋白及其抗体能部分抑制Mp和rP1-C对细胞的黏附

采用黏附-黏附抑制实验，观察波形蛋白及其抗体是否能抑制rP1-C和Mp对BEAS-2B细胞的黏附。如图8A所示，较多的Mp黏附于BEAS-2B细胞膜表面，使用波形蛋白抗体预处理的细胞表面的Mp的量则有所减少(图8B)。同样，使用波形蛋白处理Mp后，Mp对细胞的黏附减少(图8C)。上述结果证实了波形蛋白及其抗体可以抑制Mp对细胞的黏附。rP1-C对细胞的黏附情况与Mp相似，同样受到波形蛋白及其抗体的影响(图8D-F)。综上，波形蛋白及其抗体抑制了Mp和rP1-C对BEAS-2B细胞的黏附，说明波形蛋白与Mp和rP1-C对细胞的黏附密切相关。

2.7波形蛋白表达量的改变能影响Mp和rP1-C对细胞的黏附

为了更直观地确认波形蛋白在Mp对细胞的黏附中发挥重要作用，分别使用波形蛋白-siRNA以降低波形蛋白的表达、慢病毒载体CMV-GFP-puro-vimentin以提高细胞中波形蛋白的表达，并进行Mp和rP1-C对细胞的黏附试验。结果如图9所示，图9中A图是分别用WB和实时RT-PCR检测siRNA干扰后对波形蛋白表达的影响(明显降低)，图9中B图是分别用WB和实时RT-PCR检测转染慢病毒表达载体后对波形蛋白表达的影响(明显升高)。转染siRNA的细胞中波形蛋白的表达量明显下降，而过表达细胞株中波形蛋白的表达量明显增加。相应的黏附试验结果表明Mp和rP1-C对干扰后的BEAS-2B细胞的黏附量明显低于对照组，而对过表达稳转细胞株的黏附量明显增多(图10)。这些结果表明波形蛋白的表达水平能影响Mp和rP1-C对细胞的黏附，波形蛋白可能是Mp黏附细胞的主要受体。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 南华大学

<120> 治疗肺炎支原体感染的药物的筛选方法与波形蛋白的应用

<130> MP22010793

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Thr Arg Ser Val Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Arg Met Phe Gly

1 5 10 15

Gly Pro Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Val Thr

20 25 30

Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Gly Asp Ala Leu Arg Pro Ser Thr

35 40 45

Ser Arg Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Pro Gly Gly Val Tyr Ala Thr Arg

50 55 60

Ser Ser Ala Val Arg Leu Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Leu Leu

65 70 75 80

Gln Asp Ser Val Asp Phe Ser Leu Ala Asp Ala Ile Asn Thr Glu Phe

85 90 95

Lys Asn Thr Arg Thr Asn Glu Lys Val Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp

100 105 110

Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn

115 120 125

Lys Ile Leu Leu Ala Glu Leu Glu Gln Leu Lys Gly Gln Gly Lys Ser

130 135 140

Arg Leu Gly Asp Leu Tyr Glu Glu Glu Met Arg Glu Leu Arg Arg Gln

145 150 155 160

Val Asp Gln Leu Thr Asn Asp Lys Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp

165 170 175

Asn Leu Ala Glu Asp Ile Met Arg Leu Arg Glu Lys Leu Gln Glu Glu

180 185 190

Met Leu Gln Arg Glu Glu Ala Glu Asn Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln

195 200 205

Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg Leu Asp Leu Glu Arg Lys Val

210 215 220

Glu Ser Leu Gln Glu Glu Ile Ala Phe Leu Lys Lys Leu His Glu Glu

225 230 235 240

Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Glu Gln His Val Gln Ile

245 250 255

Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp Val

260 265 270

Arg Gln Gln Tyr Glu Ser Val Ala Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu

275 280 285

Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg

290 295 300

Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg

305 310 315 320

Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr

325 330 335

Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala

340 345 350

Val Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp Glu

355 360 365

Ile Gln Asn Met Lys Glu Glu Met Ala Arg His Leu Arg Glu Tyr Gln

370 375 380

Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr

385 390 395 400

Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Arg Ile Ser Leu Pro Leu Pro

405 410 415

Asn Phe Ser Ser Leu Asn Leu Arg Glu Thr Asn Leu Asp Ser Leu Pro

420 425 430

Leu Val Asp Thr His Ser Lys Arg Thr Phe Leu Ile Lys Thr Val Glu

435 440 445

Thr Arg Asp Gly Gln Val Ile Asn Glu Thr Ser Gln His His Asp Asp

450 455 460

Leu Glu

465

<210> 2

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Thr Thr Thr Ala Thr Arg Asp Ala Leu Pro Glu His Pro Asn Ala

1 5 10 15

Leu Ala Phe Gln Val Ser Val Val Glu Ala Ser Ala Tyr Lys Pro Asn

20 25 30

Thr Ser Ser Gly Gln Thr Gln Ser Thr Asn Ser Ser Pro Tyr Leu His

35 40 45

Leu Val Lys Pro Lys Lys Val Ile Gln Ser Asp Lys Leu Asp Asp Asp

50 55 60

Leu Lys Asn Leu Leu Asp Pro Asn Gln Val Arg Thr Lys Leu Arg Gln

65 70 75 80

Ser Phe Gly Thr Asp His Ser Thr Gln Pro Gln Pro Gln Ser Leu Lys

85 90 95

Thr Thr Thr Pro Val Phe Gly Thr Ser Ser Gly Asn Leu Ser Ser Val

100 105 110

Leu Ser Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gln Ser

115 120 125

Gly Val Asp Leu Ser Pro Val Glu Lys Val Ser Gly Trp Leu Val Gly

130 135 140

Gln Leu Pro Ser Thr Ser Asp Gly Asn Thr Ser Ser Thr Asn Asn Leu

145 150 155 160

Ala Pro Asn Thr Asn Thr Gly Asn Asp Val Val Gly Val Gly Arg Leu

165 170 175

Ser Glu Ser Asn Ala Ala Lys Met Asn Asp Asp Val Asp Gly Ile Val

180 185 190

Arg Thr Pro Leu Ala Glu Leu Leu Asp Gly Glu Gly Gln Thr Ala Asp

195 200 205

Thr Gly Pro Gln Ser Val Lys Phe Lys Ser Pro Asp Gln Ile Asp Phe

210 215 220

Asn Arg Leu Phe Thr His Pro Val Thr Asp Leu Phe Asp Pro Val Thr

225 230 235 240

Met Leu Val Tyr Asp Gln Tyr Ile Pro Leu Phe Ile Asp Ile Pro Ala

245 250 255

Ser Val Asn Pro Lys Met Val Arg Leu Lys Val Leu Ser Phe Asp Thr

260 265 270

Asn Glu Gln Ser Leu Gly Leu Arg Leu Glu Phe Phe Lys Pro Asp Gln

275 280 285

Asp Thr Gln Pro Asn Asn Asn Val Gln Val Asn Pro Asn Asn Gly Asp

290 295 300

Phe Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ser Ser Gln Gly Pro Gln Thr Leu Phe

305 310 315 320

Ser Pro Phe Asn Gln Trp Pro Asp Tyr Val Leu Pro Leu Ala Ile Thr

325 330 335

Val Pro Ile