使用针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂治疗慢性疲劳综合征的方法

摘要

本发明在第一方面涉及一种治疗慢性疲劳综合征(CFS)的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂。在进一步的方面，本发明涉及在慢性疲劳综合征的治疗中的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂与B‑细胞消耗剂或B‑细胞活化抑制剂的组合。另外，描述了针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂与B‑细胞消耗剂或B‑细胞活化抑制剂的组合。所述组合可以以包含适当有效剂量的所述化合物的试剂盒的形式提供。进一步，描述了化合物或组合在治疗CFS中的用途。

说明书

技术领域

本发明在第一方面涉及一种治疗慢性疲劳综合征(CFS)的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂。在进一步的方面，本发明涉及在治疗慢性疲劳综合征中的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂与B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂的组合。另外，描述了针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂与B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂的组合。所述组合可以以包含适当有效剂量的所述化合物的试剂盒的形式提供。进一步，描述了化合物或组合在治疗CFS中的用途。

背景技术

慢性疲劳综合征(CFS)也被描述为肌痛性脑炎(ME)，是一种影响大约0.2％的人口的疾病(Nacul等人，BMC med 2011，9:91)。这种疾病通常对女性的影响是男性的三到四倍，并且通常先于感染。推测了CFS的遗传易感性(Albright等人，2011，BMC neurol 11：62)。根据CFS/ME的临床工作病例定义(加拿大标准)，Carruthers B.M.等人，2003，J.ChronicFatigue Syndr，11：7-36，主要症状是劳累后不适，伴有认知障碍、疼痛、感观高度敏感，以及与神经内分泌和自主神经功能有关的几种症状。CFS的特点是不明原因的严重疲劳，持续至少连续6个月，并且职业、社交或个人活动的先前水平大幅下降。尽管许多研究表明血液测试或放射学检查有细微的变化，但不存在生物标志物或诊断测试。

也就是说，CFS的病因仍不清楚。各种假设包括免疫学、病毒学、神经内分泌学和心理学机制。CFS的发病机制被认为是多因素的，涉及宿主和环境因素。

许多患有CFS的患者在疲劳发展之前有急性病毒感染史。然而，尚未证实存在持续的病毒感染。

此外，在CFS中进行了几项基因表达研究，表明依据免疫反应和防御机制的功能障碍存在特定但复杂的基因改变。例如，Kaushik N.等人,2005,J.Clin Pathol 58:826-32描述了显示CFS中16个基因的差异表达的微阵列研究，表明T-细胞活化和神经元和线粒体功能的紊乱。其他微阵列研究得出结论，几个基因影响线粒体功能和细胞周期失调。而且，描述了膜转运和离子通道的改变。基于大量研究，基因表达数据不是决定性的，但表明CFS中存在代表各种细胞功能的干扰。

2007年对感染后疲劳综合征的一项研究发现，与感染后迅速恢复的对照组相比，在超过12个月的期限内离体细胞因子的产生没有差异(Vollmer-Conna U.等人,2007,ClinInfect Dis 45:732-5)。推测出CFS患者可能具有免疫细胞功能降低，伴有NK细胞细胞毒性低和免疫球蛋白缺乏。

例如，Ogava M.等人，1998，Eur J of Clin Invest,28:937-943描述了在慢性疲劳综合征中降低的一氧化氮介导的自然杀伤细胞活化。也就是说，NO供体化合物能够刺激健康对照受试者的NK细胞活性，但不能刺激从CFS患者获得并在体外刺激的NK细胞。

研究表明，与CFS患者的免疫功能相关的实验室标志物存在若干异常。例如，已经描述了低NK细胞细胞毒性，但CD8+T细胞增加，CD20+B-细胞数量增加，以及表达CD20和CD5的B-细胞亚群增加。一项比较CFS患者和对照的研究报道了在体外有丝分裂刺激后，NK细胞中T细胞上CD69的表达降低，表明细胞介导的细胞免疫的早期激活存在障碍(Mihaylova I.等人，2007，Neuro Endocrinol Lett 28:477-83)。

然而，关于CFS中免疫生物调节的数据并不一致，例如Brenu等人，2012，J TransMed 10:88中所讨论的。

除了CFS中免疫失调的假设外，已提出对内源性血管活性神经肽的自身免疫作为该疾病的一种机制，Staines DR.,2005,Med Hypotheses64:539-42，但未得到科学数据的支持。其他报告正在讨论与CFS相关的各种自身抗体。然而，没有证明有明确的关联。因此，没有直接证据表明存在致病性自身抗体或T-淋巴细胞介导的自身免疫的一致数据。也就是说，CFS目前没有被定义为一种自身免疫性疾病。相反，CFS仍被确定为病因不明的疾病。

本领域讨论了CFS发病机制的各种假设，包括血小板功能障碍，神经、神经内分泌、代谢或自主神经紊乱，离子通道功能障碍，锌缺乏，毒素暴露或之前的疫苗接种等。然而，对于CFS的病因和发病机制尚未出现一致的表现。由于缺乏确切发病机制的知识并且没有已知的因果机制，目前没有针对CFS的标准特异性治疗方法。CFS的未知病因可能是很少有研究基于生物学假设评估治疗的原因。

本领域中描述了测试用免疫球蛋白治疗或用抗病毒组合物如缬更昔洛韦(valganciclovir)治疗的研究。

本发明的发明人发表了一系列病例研究，Fluge O.，Mella O.，2009，BMCNeurol.9:28，随后是一项双盲和安慰剂对照的随机II期研究，Fluge O.等人，2011，PLOS6:e26359，其探索使用治疗性单克隆抗CD20抗体利妥昔单抗(Rituximab)消耗B-细胞，显示2/3的CFS患者有临床获益。B-细胞消耗剂的使用描述于WO 2009/083602中。反应和复发的模式，从开始输注利妥昔单抗(Rituximab)(B-细胞快速消耗)到临床反应开始具有2至8个月的时间延迟，表明抗体可能与发病机制有关。最近，一项针对65岁以上老年人的病例对照研究，调查了超过100万例癌症病例和100,000名健康对照者，两组的CFS诊断的患病率均为0.5％，表明老年CFS患者患B-细胞淋巴瘤的风险适度但非常显著，Chang C.M.,Cancer,2012,118:5929-36，与慢性B-细胞活化一致。综上所述，以利妥昔单抗为代表的单克隆抗CD20抗体治疗的数据表明，一部分患者的CFS可能是感染后免疫失调，可能是自身免疫机制的一种变体，可能具有遗传倾向，其中B淋巴细胞对于症状维持很重要。

越来越多的证据表明ME/CFS中存在潜在的免疫功能障碍，包括血液中存在自身抗体，以及有长期ME/CFS病史的老年患者B-细胞淋巴瘤的发病率增加。已进行的两项临床研究表明，通过CD20定向治疗性单克隆抗体利妥昔单抗的B-细胞消耗可以缓解ME/CFS患者的症状并提高功能水平。后来进行了一项多中心、随机、双盲和安慰剂对照研究(RituxME)，其中有益效果无法验证，表明根据研究方案给予利妥昔单抗对于仅基于加拿大共识标准的临床ME/CFS诊断的患者不是可行的治疗方法。

然而，在这些研究中接受治疗的一些ME/CFS患者对利妥昔单抗的临床反应似乎非常好，主要缓解了核心症状。复发后，一些患者经过多次重复治疗，通常具有相同的反应模式和反应时间框架。

然而，如上所述，在CFS中使用通过单克隆抗CD20抗体利妥昔单抗的B-细胞消耗，从治疗开始到症状缓解开始存在显著延迟。同样，在使用利妥昔单抗进行的初始临床研究中，大约2/3的CFS患者有临床反应。这不仅对利妥昔单抗的治疗是正确的，而且在甲氨蝶呤的治疗中也可以看到，甲氨蝶呤是一种小分子，被称为B-细胞消耗的活性剂，可用于治疗各种疾病。

因此，持续需要提供可用于治疗慢性疲劳综合征的额外的化合物。特别地，持续需要提供在患者体内起效迅速而没有对于B-细胞消耗剂所描述的迟滞期的化合物。另外，对于对(最初)对B-细胞消耗剂治疗不敏感的患者也可能有效的化合物存在持续需求。

据报道，进一步的伴有长期ME/CFS患者在给予环磷酰胺或异环磷酰胺用于获得性癌症时症状明显改善。因此，患者在II期试验中经6个疗程的环磷酰胺治疗，超过一半的患者经历了长期显著的临床改善(Rekeland IG等人，2020，Front Med(Lausanne)7:162)。在免疫细胞中，在我们使用的试验剂量下，环磷酰胺对CD4+和CD8+T-细胞亚群都有影响，尤其是对T-调节细胞。然而，在自身免疫性疾病中使用该药物的经验表明，环磷酰胺对增殖B-细胞有作用，可阻止自身抗体的产生并减少短寿命浆细胞的形成，从而也减少成熟浆细胞的募集。在ME/CFS中进行免疫吸附的小型临床研究也可以支持针对肾上腺素能和毒蕈碱受体的自身抗体的存在(Scheibenbogen C等人，2018，PLoS One 13：e0193672)。

CFS患者具有通过流动介导的扩张(FMD)评估的显著内皮功能障碍，该测试(在标准化条件下)很大程度上反映了剪切应力后内皮细胞中一氧化氮(NO)的合成。FMD显著减少、长效硝酸盐(如单硝酸异山梨酯)后的短暂临床反应和CFS的临床表现是根据本发明的假设的基础，其中CFS症状维持的主要机制是相对缺乏内皮细胞衍生的一氧化氮(NO)可用性。这导致从内皮细胞到周围细胞(如血管壁中的平滑肌细胞)的NO扩散减少，导致血流调节不足，无法满足组织的代谢需求。同样，内皮细胞衍生的NO的相对缺乏可能导致认知障碍、睡眠问题、低无氧阈值和适度运动后组织中的乳酸积累、NK细胞功能低下，据报道这些都与CFS相关。

进一步，已经证明来自中度和重度ME/CFS患者的血浆会改变培养的肌肉细胞的能量代谢，其表明细胞应激，一些迹象表明该效应可能是免疫球蛋白介导的(Fluge O等人，2016，JCI Insight 1:e89376)。

在人类中，可以根据各种表面标志物的差异表达在外周血和其他组织中区分不同的B细胞亚群。从出生开始，所有B-细胞都源自骨髓中的共同前体(common precursors)。在骨髓、外周血和次级淋巴组织中，可以区分不同的B细胞群，对应于成熟、活化和分化的不同阶段。B-细胞发育可分为早期抗原非依赖性阶段(发生在骨髓中)和晚期抗原依赖性阶段(发生在次级淋巴组织中)。通常，可以区分以下B-细胞谱系亚群：原B-细胞、前B-细胞、未成熟和过渡B-细胞、成熟的幼稚B-细胞、记忆B-细胞、浆母细胞和浆细胞。浆母细胞是最近被分化的产生抗体的细胞，通常寿命短，但可以再循环并归巢于例如前体或骨髓等组织，成熟浆细胞从浆母细胞成熟并留在组织中，在那里它们产生大量抗体。

如上所述，可以通过各种表面标志物的差异表达将B-细胞区分为主要亚群，所述表面标志物例如众所周知的B细胞标志物CD20，其在除终末分化浆细胞和原B-细胞之外的大多数B-细胞上表达。

由于成熟浆细胞产生抗体，蛋白酶体抑制作为治疗某些已确立的自身抗体介导的疾病(这些疾病对其他治疗无效)的原则，已在少数患者系列中得到证实。在其他治疗(用类固醇、静脉注射免疫球蛋白、血浆置换、环磷酰胺、利妥昔单抗进行一线和二线治疗)无效的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体抗体介导的脑炎患者中，硼替佐米(Bortezomib)静脉输注后临床改善和病理性自身抗体减少(Keddie S等人,2018,Eur J Neurol 25:1384-1388)。

由于硼替佐米后系统性红斑狼疮(SLE)患者的浆母细胞募集很快，因此允许恢复自身抗体的产生，蛋白酶体抑制剂治疗应与针对浆母细胞的靶向治疗、特别是CD20抗体如利妥昔单抗联合，以足够短的时间间隔给予以减弱浆细胞募集。因此，浆细胞和B-细胞的联合靶向正在成为自身免疫性疾病的一种有前途的治疗原则(Alexander T等人,2018,Eur JImmunol 48:1573-1579)。在动物模型中，硼替佐米加B-细胞消耗导致小鼠中持续的浆细胞消耗和狼疮性肾炎的改善(Khodadadi L等人,2015,PLoS One 10:e0135081)。

浆细胞消耗的替代方法是通过定向于其表面上的表位的抗体直接靶向成熟浆细胞、包括记忆细胞。此类表位不一定对浆细胞来说是特异的，必须小心使用。定向于CD38的市售药物(达雷妥尤单抗(Daratumumab))用于治疗骨髓瘤，因为骨髓瘤细胞通常具有高密度的CD38抗原。然而，该药物还将靶向其他免疫细胞，诸如活化的T-细胞和B-细胞以及骨髓来源的抑制细胞。这种抑制的减弱可能会在使用达雷妥尤单抗后诱导T-细胞活性。因此，即使靶向浆细胞，达雷妥尤单抗也可能诱导其他B-细胞的募集，因此单独提供可能无法达到有效和持久抑制长寿命浆细胞的目标。

发明内容

在第一方面，本发明涉及治疗慢性疲劳综合征(CFS)的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂。

也就是说，本发明人认识到施用针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂缓解CFS的症状，因此，相应地可以用于治疗CFS。

特别地，本发明人认识到可以观察到从施用所述针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂(例如通过小心增加剂量)开始，在例如一周或数周内立即或快速缓解。与用于治疗CFS的药物(如利妥昔单抗)相比，后者的特点是在临床反应前的显著滞后时间，如例如WO 2009/083602所述。因此，施用针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂，例如令人惊讶地允许治疗CFS患者以早期缓解症状而没有长时间的延迟，如B-细胞消耗剂(如利妥昔单抗)所述。发明人已经认识到浆细胞与CFS患者的疾病机制或治疗有关。

在本发明的上下文中，术语“慢性疲劳综合征”、CFS和“肌痛性脑炎”、ME作为同义词使用。

如本文所用，术语“针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂”是指影响、即抑制或诱导浆细胞的细胞死亡的化合物。特别地，该化合物减少所述细胞的免疫球蛋白释放或免疫球蛋白(抗体)产生。

还观察到长期ME/CFS患者在给予环磷酰胺(Clyclophosphamide)或异环磷酰胺(Ifosamide)治疗获得性癌症时症状有显著改善。同样，如上所述，II期试验中的40名患者接受了6疗程的环磷酰胺治疗，超过一半的患者经历了长持续期间的显著的临床改善。在免疫细胞中，环磷酰胺在我们使用的试验剂量下对CD4+和CD8+T-细胞亚群都有影响，尤其是对T-调节细胞。然而，在自身免疫性疾病中使用该药物的经验表明，环磷酰胺对增殖的B细胞有作用，这可能会阻止自身抗体的产生并减少短寿命浆细胞的形成，因此也可以招募成熟浆细胞。

一项在ME/CFS中进行免疫吸附的小型临床研究也可以支持定向针对肾上腺素能和毒蕈碱受体的自身抗体的存在。已经证明，来自中度和重度ME/CFS患者的血浆会改变培养的肌肉细胞的能量代谢，这表明存在细胞应激，一些迹象表明这种影响可能是免疫球蛋白介导的。这些数据可能表明自身抗体存在于一部分ME/CFS患者中，尽管RituxME研究结果为阴性。从已确立的自身免疫疾病中可知，自身抗体可由晚期浆母细胞(在其表面膜上具有或不具有CD20抗原)产生或从缺乏CD20表达的成熟浆细胞产生，这取决于基础疾病和患者。如果ME/CFS中的主要疾病机制是患者体内的自身抗体相互作用，则实际上只有在CD20阳性“早期”浆母细胞中产生自身抗体的患者才能预期通过利妥昔单抗缓解症状。然而，长期给予足够剂量的利妥昔单抗最终可能会减少成熟浆细胞的募集，从而在一些患者中达到症状效果。

总可用数据与患有自身抗体维持性疾病的部分ME患者相符，但迄今为止提供的治疗(即治疗性抗CD20抗体利妥昔单抗)在减少病理性免疫球蛋白负荷方面还不充分和有效。对利妥昔单抗有反应的患者可能会从未成熟的浆细胞(浆母细胞)产生自身抗体。对于大多数从成熟浆细胞产生自身抗体的ME/CFS患者，对利妥昔单抗没有反应，因此治疗ME/CFS的一种可能方法可以是使用靶向成熟浆细胞的方案，或是由于浆细胞对具有一般作用模式的药物的易损性，或对定向针对成熟浆细胞上特定表位的分子靶向治疗的易损性。另外，必须减少从B细胞中招募具有自身抗体产生能力的新浆细胞。

因此，ME/CFS可以用诱导细胞凋亡和减少浆细胞中自身抗体产生的药物治疗。具体来说，这可以通过蛋白酶体抑制剂如硼替佐米(Bortezomib)来实现。这类被称为蛋白酶体抑制剂的药物通过抑制蛋白酶体的糜蛋白酶活性而起作用，特别是在具有高水平蛋白质转换的细胞中、尤其是在产生免疫球蛋白的浆细胞中积累错误折叠的蛋白质。在骨髓瘤中，这最终会导致恶性浆细胞的细胞凋亡。实验数据表明，这些药物还通过消耗活化的T-细胞和B-细胞以及抑制单核细胞和浆细胞样树突状细胞中I型干扰素的产生而有益于自身免疫疾病。由于毒性(尤其是周围神经病变)，以及对负责正常抗体(如疫苗诱导的抗体)的长寿命浆细胞的影响，药物应优选在有限的时间期限内分几个(1-4)个疗程提供。

由于成熟浆细胞产生抗体，蛋白酶体抑制作为治疗某些已确立的自身抗体介导的疾病(这些疾病对其他治疗无效)的原则，已在患有其他自身免疫性疾病的少数患者系列中得到证实。对其他治疗(用类固醇、静脉注射免疫球蛋白、血浆置换、环磷酰胺、利妥昔单抗进行一线和二线治疗)无效的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体抗体介导的脑炎患者中，硼替佐米静脉输注后临床改善和病理性自身抗体减少。

由于硼替佐米后系统性红斑狼疮(SLE)患者的浆母细胞募集很快，因此允许恢复自身抗体的产生，在本发明的一个实施方案中，蛋白酶体抑制剂治疗与针对浆母细胞的靶向治疗、特别是CD20抗体如利妥昔单抗联合，以足够短的时间间隔给予以减弱浆细胞募集。因此，浆细胞和B-细胞的联合靶向正在成为自身免疫性疾病的一种有前途的治疗原则。在动物模型中，硼替佐米加B-细胞消耗导致小鼠中持续的浆细胞消耗和狼疮性肾炎的改善。一项计划中的硼替佐米治疗某些已确立的自身免疫性疾病的临床试验方案已经公布。

浆细胞消耗的替代方法是通过定向针对其表面上的表位的抗体直接靶向成熟浆细胞、包括记忆细胞。此类表位不一定对浆细胞来说是特异的，必须小心使用。定向CD38的市售药物(达雷妥尤单抗)被用于治疗骨髓瘤，是因为骨髓瘤细胞通常具有高密度的CD38抗原。然而，该药物还将靶向其他免疫细胞，诸如活化的T-细胞和B-细胞以及骨髓来源的抑制细胞。这种抑制的减弱可能会在使用达雷妥尤单抗后诱导T-细胞活性。因此，即使靶向浆细胞，达雷妥尤单抗也可以诱导其他B-细胞的募集，因此单独提供可能无法实现有效和持久抑制长寿命浆细胞的目标。因此，将CD38定向抗体(如达雷妥尤单抗)与维持性利妥昔单抗或另一种CD20定向抗体组合是一种治疗选择。

同样，定向相对选择性浆细胞抗原的其他单克隆抗体、如抗CD319(埃罗妥珠单抗(Elotuzumab))，可与B-细胞消耗剂、如抗CD20单克隆抗体联合使用。

在本发明的一个实施方案中，该浆细胞为CD20阴性浆细胞，即终末分化浆细胞。

本发明的一个实施方案，可以提供至少两种针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂的组合。

针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂的施用途径取决于所使用的制剂。也就是说，针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂可以以胶囊或其他合适的形式、如片剂的形式施用。

蛋白酶体抑制的时间表将取决于药物。对于硼替佐米，通常在一个循环的第1、4、8和11天进行iv或sc注射，3-4周后进行新的循环。

另外，针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂可以是立即释放的化合物形式或延迟或持续的形式。此外，如果适用，针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂可以以粉末形式提供以供口服使用。

例如，针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂适合于全身施用，例如经由肠内或肠胃外途径。在另一个实施方案中，针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂适合于粘膜或局部施用。

而且，在另一个实施方案中，可用于治疗CFS的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂适合于以其单一治疗有效剂量或多个治疗有效剂量施用于受试者。本领域技术人员非常了解待施用的有效剂量。通常，每日剂量类似于在用所述针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂治疗的其他疾病的治疗中施用的每日剂量。

通常，可用于治疗CFS的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂是合适的药物形式，例如，与药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体组合。药物组合物可以含有额外的成分，包括药物添加剂、pH稳定剂等。

也就是说，本发明提供了一种可用于治疗CFS的药物组合物，其包含如本文所定义的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

剂量和施用类似于与其他疾病和紊乱有关的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂所述的剂量和施用。例如，剂量和施用最初是每日0.5至2mg，在最初几天内逐渐增加相同的量。例如，五天后剂量在0.5mg和5mg之间。剂量可以每隔一段时间增加0.5mg或1mg，达到每日2至10mg的剂量。本领域技术人员非常了解合适的剂量。每日剂量可以每日服用一次或每日服用几次，例如每日两次或每日三次。也就是说，初始每日剂量在0.5至3mg活性成分的范围内，每日施用一次或三次，同时在治疗期间增加相同剂量。典型的最大剂量为约10mg每日剂量，例如2.5mg每日三次。

在一个实施方案中，治疗和使用是以这样的形式，在第一治疗方案中，例如通过如上所述的施用周期来施用针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂，例如，活性剂在预定时间期限内以一至四个疗程或循环提供。

此后，施用B-细胞消耗剂。该B-细胞消耗剂可以如上所述按疗程或循环施用。

本领域技术人员非常了解合适的疗程和相应的治疗方案。

也就是说，剂量和施用类似于针对其他疾病、紊乱或病况所述的化合物的剂量和施用。

施用是例如以片剂的形式，每片剂量在0.5至2.5mg之间。当然，化合物可以通过其他方法施用，通常通过已知方式全身施用。

如本文所用，术语“包含”(“comprising”、“comprises”)、“含有”(“containing”或“contains”)包括“由……组成”(“consisting of”或“consist”)的实施方案。

在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其含有如本文定义的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂和B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂的组合。所述组合物特别可用作为例如用于治疗慢性疲劳综合症的药物组合物。

也就是说，优选地，该药物组合物是用于治疗慢性疲劳综合征的含有针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂和B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂的组合的组合物，其中该组合同时、分开或顺序施用。

在一个优选的实施方案中，该药物组合物被设计为允许在如从治疗开始的三个月或四个月内的治疗的第一个六周的时间范围内、优选在治疗的第一个八周的时间范围内、施用药学有效剂量的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂。当然，治疗方案取决于所施用的药物以及施用方法。本领域技术人员非常了解取决于药物的合适剂量和治疗方案。例如，当对于其他疾病或紊乱使用相同的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂的情况下，可以施用相同剂量的抑制性或细胞毒性药物。

另外，该药物组合物被设计为B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂适合于在第一个两周内以输注形式施用1或2两次，此后，每两个、三个或四个月施用B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂一次、以维持有益效果。

如本文所用，术语“B-细胞消耗”或“B-细胞消耗活性”是指实体(化学或生物实体，例如抗体)降低受试者中循环B-细胞水平的能力。例如通过诱导细胞死亡或减少增殖可以实现B-细胞消耗。

如本文所用，术语“B-细胞活化的抑制”是指实体(化学或生物实体)降低或完全抑制受试者中B-细胞活化的能力。B-细胞活化的抑制可以通过已知方式、例如通过测定B-细胞活化的标志物来测定。

“CD20”抗原或“CD20”是约35-kDa非糖基化的磷蛋白，存在于人类外周血或淋巴器官中超过90％的B细胞表面上。CD20存在于正常B细胞和恶性B细胞上，但不在干细胞或浆细胞上表达。文献中CD20的其他名称包括“B淋巴细胞限制性抗原”和“Bp35”。例如，Clark等人.Proc.Natl.Acad.Sd.(USA)82:1766(1985)中描述了CD20抗原。术语CD20包括人类以外的其他物种的等效分子。最近，已经报道了CD20在T-细胞和NK-细胞亚群上的低水平表达。

“B-细胞”是在骨髓内成熟的淋巴细胞，包括幼稚B细胞、记忆B细胞或效应B细胞，效应B细胞包括浆母细胞但不是必须浆细胞。

在更广泛的意义上，本发明不仅涉及抗体或其片段用于治疗CFS的用途，而且涉及通常具有B-细胞消耗活性的CD20分子的拮抗剂用于治疗CFS的用途。

本文可互换使用的“拮抗剂”或“B-细胞消耗剂”是一种分子，例如，当其在与B细胞表面标志物(如B细胞上的CD20)结合时，会破坏或消耗哺乳动物中的B细胞，和/或干扰一种或多种B细胞功能，例如通过减少或阻止B细胞引发的体液反应。根据本发明的拮抗剂或B-细胞消耗剂能够消耗被治疗的哺乳动物中的B细胞(即降低循环B细胞水平)。这种消耗可以通过各种机制实现，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、抑制B细胞增殖和/或诱导B细胞死亡(例如通过细胞凋亡)。包括在本发明范围内的拮抗剂包括抗体、合成或天然序列肽和小分子拮抗剂，其与B细胞表面标志物结合，任选地与细胞毒性剂缀合或融合。优选的拮抗剂是CD20抗体或CD20结合抗体片段。此外，优选小分子拮抗剂，如已知的B-细胞消耗剂甲氨蝶呤。

只要B-细胞以外的其他细胞(如T-细胞或NK-细胞亚群)表达CD20抗原，这些细胞也被B-细胞消耗剂消耗，该消耗剂是通过CD20起作用的药剂。

“诱导细胞凋亡”的拮抗剂是那些诱导例如B细胞的程序性细胞死亡的拮抗剂，如通过标准细胞凋亡试验测定，诸如膜联蛋白V的结合、DNA的片段化、细胞收缩、内质网的扩张、细胞片段化和/或膜囊泡(称为凋亡小体)的形成。

本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及嵌合抗体(例如人源化抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。

在一个优选的实施方案中，用于治疗CFS的抗体是B细胞消耗CD20结合抗体片段。

“CD20结合抗体片段”包含完整抗体的一部分，该部分包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。出于本文的目的，“完整抗体”是包含重链和轻链可变结构域以及Fc区的抗体。

而且，据推测其他B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂，特别是抗CD22抗体、如依帕珠单抗(Epratuzumab)或抗CD19人源化抗体、如MDX-1342，可用于治疗CFS。

本文中的术语“利妥昔单抗(Rituximab)”或

B-细胞消耗剂或拮抗剂、特别是抗CD20抗体或其CD20结合抗体片段的表述“有效量”是指B-细胞消耗剂或拮抗剂对治疗CFS有效的量。例如，用于治疗慢性疲劳综合征/肌痛性脑脊髓炎的抗CD20抗体在每剂量10mg至5000mg的范围内施用。例如，对于利妥昔单抗，作为单次输注的剂量可以在100至1000mg/m

在一个优选的实施方案中，B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂是化学实体、例如小分子。本领域已知多种B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂，例如已知的B-细胞消耗剂是BAFF拮抗剂。此外，已知的B-细胞消耗剂包括BR3的拮抗剂、α-4-整合素的激动剂等。例如，甲氨蝶呤是一种显示B-细胞消耗活性的叶酸类似物。其他有用的B-细胞消耗剂是针对CD20的小型模块化免疫药物(SMIP)。例如，作为B-细胞消耗剂的SMIP是TrubionPharmaceuticals的TRU-015或SBI-087。同样，SMIP可以是比抗体更小的单链多肽，其具有强效的B-细胞消耗活性或B-细胞抑制活性。

在一个优选的实施方案中，代表B-细胞消耗剂的生物实体的抗CD20抗体和代表B-细胞消耗剂的化学实体的甲氨蝶呤的组合可用于治疗肌痛性脑脊髓炎的慢性疲劳综合征。这些实体的施用可以同时、分别或顺序实现。例如，在第一方案中抗体或甲氨蝶呤之一施用于受试者，而在第二方案中施用另一种药剂。

包含B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂、拮抗剂、特别是抗CD20抗体或其CD20结合抗体片段的组合物将以符合良好医疗规范的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括正在治疗的特定疾病或病症的阶段、正在治疗的特定哺乳动物、个体受试者的临床状况、药剂的递送部位、施用方法、施用时间表以及医疗从业者已知的其他因素。待施用的B-细胞消耗剂、如抗体或抗体片段的有效量将取决于这些考虑因素。作为一般建议，每剂量肠胃外施用的拮抗剂的有效量为受试者身体的约20mg/m

在另一个实施方案中，该组合是针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂和B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂的组合，其中所述B-细胞消耗剂是甲氨蝶呤。

此外，该组合可以是至少两种不同成分的形式，其中每种成分可以单独施用。例如，虽然根据本发明的组合的一种成分可以全身提供，但至少一种其他成分可以适合于局部施用或粘膜施用。

药物制剂

根据本发明使用的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂以及任选地B-细胞消耗剂如抗体或其他拮抗剂的治疗制剂通过将具有所需纯度的抗体或其片段与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备用于储存{Remington's PharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.Ed.(1980))，以冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，包括磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸等缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯类，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，例如钠；金属配合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如吐温

可形成根据本发明的组合物的基质的示例性抗CD20抗体制剂描述于WO98/56418，其通过引用明确并入本文。该出版物描述了包含40mg/mL利妥昔单抗、25mM乙酸盐、150mM海藻糖、0.9％苯甲醇、0.02％聚山梨酯20，pH为5.0的液体多剂量制剂，其在2-8℃下的最短保质期为两年。另一种感兴趣的抗CD20制剂包含9.0mg/mL氯化钠中的10mg/mL利妥昔单抗、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨酯80和无菌注射用水，pH 6.5。适用于皮下施用的冻干制剂描述于美国专利号6,267,958(Andya等人)。这种冻干制剂可以用合适的稀释剂重构为高蛋白质浓度，并且重构的制剂可以皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。还考虑了抗体或拮抗剂的结晶形式。参见，例如，US 2002/0136719A1。

活性成分也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳状液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980)。可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质是成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DEPOT

而且，本发明涉及一种试剂盒，其包含a)第一组分，其包含本文定义的针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂，和

b)第二组分，其包含本文定义的B-细胞消耗剂或B-细胞激活抑制剂。

优选地，该试剂盒用于治疗CFS。

优选地，用针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂治疗CFS的方法包括在开始时施用次优或低剂量。特别是，起始剂量可以减少以避免任何不希望的副作用。随着时间的推移，剂量可以增加到例如在心绞痛中施用的剂量。

此外，剂量可以是立即释放或持续剂量，这取决于施用的方法。

在一个实施方案中，首先施用蛋白酶体抑制剂2-3个循环，然后，优选在至少两周、如4周或2个月的时间期限内，分四个疗程(1、2、3或4个疗程)施用B-细胞消耗剂。

可以经由肠内或肠胃外方式全身或局部施用。例如，局部施用可能会受到例如通过用于持续释放的贴片或铺面(pavement)影响，针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂可以通过吸入法或通过其他粘膜方法施用。

在一个优选的实施方案中，治疗方法包括联合B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂施用针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂。也就是说，特别优选用针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂和如本文定义的B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂的联合治疗。

两种成分可以同时、分别或顺序施用于所述患有CFS的受试者。例如，可以通过吸入施用针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂，同时通过输注的方法施用B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂。此外，虽然针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂可以每天施用，但B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂可以最初每周一次施用，持续两周，然后以自由决定的时间表施用，例如每第二或每第三个月。

特别地，可以在最初的4至12周期间、如治疗的前4至8周期间、例如在最初的4、5、6、7、8、9、10、11、12周期间施用针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂，以允许立即或快速缓解CFS的症状，而以如本文所定义的B-细胞消耗剂或B-细胞活化抑制剂施用，由于其延迟有效性允许在很长一段时间内缓解患有CFS的受试者的症状。

特别地，本发明的实施方案涉及在最初的4至12周、例如在1、2、3或4个疗程内施用针对浆细胞的抑制剂或细胞毒性剂。如上所述，在不施用活性剂的情况下继续治疗一段时间，并在施用B-细胞消耗剂、特别是如本文所定义的抗CD20抗体或抗体片段的情况下继续治疗一段时间，包括一对一、二、三或四疗程的施用。

具体实施方式

实施例

本发明将通过实施例的方式进一步描述。应当理解，实施例进一步阐述本发明而不限制本发明。

患者1：

患者1是一名37岁的女性，患有ME/CFS 22年。如本文所述，她参加了第一个使用利妥昔单抗与安慰剂的双盲随机试验(相隔两周两次输注，然后进行观察)。在那次研究中她没有任何改善，在试验揭盲后，显示她被分配到安慰剂组。如本文所述，她随后参加了使用利妥昔单抗维持的开放标签II期试验，并且在逐渐复发之前经历了持续超过3年的长期和令人印象深刻的临床反应。然后患者再次接受利妥昔单抗治疗，再次通过相同的模式，具有超过3年长期持续临床反应，然后再次逐渐复发。

2019年9月，她的ME/CFS严重程度为轻度至中度，但症状不断加重，因此决定为她提供根据本发明的蛋白酶体抑制剂硼替佐米。她在第1、4、11和15天接受了皮下硼替佐米。在第一个疗程中，她接受了1.0mg/m

然而，在硼替佐米治疗开始的第10周，她的所有ME/CFS症状逐渐改善，例如劳累后不适(PEM)、尤其是肌肉和关节的疼痛、认知障碍和睡眠问题。她的精力增加，体力增加，并且能够执行许多新任务。从多年的经验中了解这种疾病，她确信干预对ME/CFS症状有积极影响。自我报告的症状改善得到每24小时测量步数(Fitbit臂环)的支持，在反应期间，我们每天记录超过10,000步。

在她开始经历ME/CFS症状逐渐复发之前，这种效果持续了大约7周。因此，她相隔4个月接受利妥昔单抗输注，目前临床反应稳定且令人印象深刻。

患者2：

患者2是一名46岁的女性，患有中度至重度疾病严重程度的ME/CFS，即她待在家里并在期间或多或少卧床不起。她之前曾参与本文提到的评估ME/CFS中环磷酰胺静脉输注的开放标签试验，并在逐渐复发前经历了持续近一年的临床反应。她接受了第一个疗程的硼替佐米，在第1、4、8和11天、1.0mg/m

从硼替佐米干预开始后的7周，她的所有ME/CS症状逐渐和持续改善，精力增加、疼痛减轻、PEM减少、头晕减少和认知功能改善。她的Fitbit臂环证实了她对改善的描述，每24小时增加步数，从干预前单日平均1500-2000步增加到反应后大约4000步、直到7000步。她接受了总计6个疗程的硼替佐米，但在最后一个疗程后，她注意到她的下肢腿和脚部不适，还有一些便秘。她有持续反应直到最后一次硼替佐米输注后6周，总计16周，然后逐渐复发。因此，她相隔4个月接受利妥昔单抗输注，现在利妥昔单抗输注开始后大约4个月，临床反应程度再次提高。