定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法、为建立该方法所制备的单克隆抗体及应用

摘要

本申请涉及生物检测技术领域，具体涉及定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法、为建立该方法所制备的单克隆抗体及应用。本申请的方法包括以下步骤：在酶标板上包覆乙脑单抗，包被完成后每孔分别加入梯度稀释的乙脑阳性参考品、阴性对照以及稀释后的待检样品，孵育后清洗酶标板，加入酶标乙脑单抗，再次孵育后清洗酶标板，加底物显色液显色，终止酶标仪读取OD值，用乙脑阳性参考品的OD值绘制出回归方程式，通过回归计算定量得出疫苗中乙脑病毒抗原的含量。由此本申请的方法能有效准确地预知成品疫苗的抗原含量，为乙脑疫苗的生产提供可靠的定量数值依据，能够较好地应用于乙脑疫苗生产的质量管控中。

说明书

技术领域

本申请涉及生物检测技术领域，具体涉及定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法、为建立该方法所制备的单克隆抗体及应用。

背景技术

流行性乙型脑炎是由乙脑病毒引起、由蚊虫传播的一种急性传染病。乙脑的病死率和致残率高，是威胁人群特别是儿童健康的主要传染病之一。在20世纪 60年代和70年代初期全国曾发生大流行，70年代以后随着大范围接种乙脑疫苗，乙脑发病率明显下降，近年来维持在较低的发病水平。由此可见，乙脑疫苗在预防乙脑流行上起着重要作用。

其中，乙脑病毒抗原作为乙脑疫苗的最主要成分，其含量对疫苗质量起到至关重要的作用。目前，市面上虽然有检测乙脑病毒的检测试剂盒，但是该检测试剂盒主要用于检测机体是否感染乙脑病毒，其检测对象为机体的体液。由于机体感染乙脑病毒后其体液中乙脑病毒抗原的含量通常较低，现有的检测试剂盒仅适用于体液中低浓度的抗原进行定性检测，难以对疫苗生产中高浓度病毒抗原进行定量检测。

发明内容

本申请的目的是提供定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法、为建立该方法所制备的单克隆抗体及应用，该方法利用单克隆抗体对能有效准确地检测成品疫苗的抗原含量，为乙脑疫苗的生产提供可靠的定量数值依据，保证疫苗质量的稳定和提高。

第一方面，本申请提供一种定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，包括以下步骤：在酶标板上包覆包被乙脑单抗，包覆完成后每孔分别加入梯度稀释的乙脑阳性参考品、阴性对照以及稀释后的待检样品，孵育后清洗酶标板，加入酶标乙脑单抗，再次孵育后清洗酶标板，加底物显色液显色，终止酶标仪读取OD值，用乙脑阳性参考品的OD值绘制出回归方程式，通过回归计算定量得出疫苗中乙脑病毒抗原的含量。

通过采用上述技术方案，本申请使用酶标板作为载体以固定乙脑单抗，利用单抗与抗原的高特异性和稳定性去捕获乙脑疫苗中的抗原，促使抗原被稳定吸附在酶标板上。

清洗酶标板洗去样品中的其他物质以减少干扰，随后加入酶标乙脑单抗，由此形成“单抗-抗原-酶标单抗”的ELISA双抗体夹心结构。本申请采用酶标单抗相对于酶标多抗，一方面能促使酶标单抗稳定固定在酶标板上，另一方面还能对被吸附的抗原进行再次验证，剔除与抗原结构相近的干扰因子，由此能准确有效地将乙脑疫苗中的抗原进行有效捕获。

在此基础上，本申请加底物显色液进行显色，通过乙脑阳性参考品的OD值绘制出回归方程式，再利用该回归方程式能准确定量计算出抗原含量，为乙脑疫苗的生产提供可靠的定量数值依据，保证疫苗质量的稳定和提高。

优选的，所述包被乙脑单抗和所述酶标乙脑单抗为一组单克隆抗体对，所述单克隆抗体对的制备方法，包括以下步骤：

将乙型脑炎病毒纯化液与佐剂混合，制备免疫原；

用所述免疫原免疫全部小鼠，其中取一组小鼠取脾细胞进行第一次细胞融合，剩余小鼠用所述免疫原继续加强免疫，从剩余的小鼠中再取脾细胞进行第二次细胞融合；

将第一次细胞融合和第二次细胞融合得到的单克隆细胞进行培养，经反复筛选和特异性检测，选取能分泌识别乙脑病毒且具有中和活性的单抗的阳性克隆细胞；

将挑选出的阳性克隆细胞注射入抗体纯化用小鼠的腹腔中，待单抗表达分泌后，抽取小鼠的腹水，经离心后收集腹水上清进行纯化，获得乙脑单抗；

选取经检测筛选出腹水上清中的抗体得率高以及结合乙脑病毒灵敏度高的纯化抗体进行酶标记，获得酶标乙脑单抗；

选取所述乙脑单抗包被于酶标板上，封闭后加入梯度稀释的乙脑抗原，孵育后加入所述酶标乙脑单抗，继续孵育后加入显示底物，测定OD值，根据OD值结果筛选出相互配对的包被乙脑单抗和酶标乙脑单抗，即为单克隆抗体对。

通过采用上述技术方案，双抗体夹心结构在实际操作过程中，不同抗体与酶标板以及抗体与抗原之间的结合效果不同，再加上不同抗体的蛋白结构存在一定的空间位阻。为此，本申请进一步优选包被乙脑单抗和酶标乙脑单抗为一组能相互配对的单克隆抗体对，由此保证本申请能稳定形成“单抗-抗原-酶标单抗”的双抗体夹心结构。

由于乙脑疫苗中抗原是刺激机体产生抗体的关键成分，但疫苗生产过程中会有一定的抗原失去刺激免疫的作用，该失活的抗原会干扰疫苗中有效抗原的含量测定，为此本申请采用中和抗体，利用中和抗体只会与有效抗原结合的特点，从而能精确地检测出乙脑疫苗中有效抗原的含量。然而，众所周知单克隆抗体获取难度大、成本高，要有效获取乙脑病毒的中和抗体的难度更大。

对此，本申请采用上述制备方法，将含有乙型脑炎病毒的免疫原去免疫小鼠，基于中和抗体的浓度在染病机体内呈先上升后下降的趋势，本申请特意选用初步免疫以及加强免疫的小鼠细胞进行细胞融合，再经过反复筛选和特异性检测从中逐步筛选出能够分泌中和抗体的单克隆细胞株，且其分离的单克隆细胞株的抗体得率以及结合乙脑病毒的灵敏度较高。最后本申请在获得纯化抗体后还进行抗体配对试验，有效筛选出能相互配合的抗体和酶标抗体，由此保证本申请对抗原含量的定量检测方法达到最优。

优选的，与所述乙型脑炎病毒纯化液混合的佐剂为佐剂CFA和

通过采用上述技术方案，佐剂CFA为完全弗式佐剂，由热灭活的结核分枝杆菌、石蜡油和羊毛脂混合而成，主要引起Th1细胞免疫应答，其活性是一种有沉积抗原的持续释放与局部天然免疫的刺激反应，从而增强适应性免疫；然而，佐剂CFA由于白细胞大量涌入抗原沉积的部位而会引起剧烈炎症反应以及与抗原的相互作用，因此佐剂CFA可能导致注射部位局部炎症和肉芽肿性反应、淋巴结结构改变、皮肤溃疡等副反应。为此，本申请使用

优选的，所述免疫原的制备步骤如下：

将乙脑病毒纯化液与佐剂CFA等体积混合，对混合物进行超声处理至乳状混合物，获得免疫原A；将乙脑病毒纯化液与

通过采用上述技术方案，本申请在制备免疫原时将乙脑病毒纯化液分别与佐剂CFA和

优选的，所述抗体纯化用小鼠在注射单克隆细胞前预先在腹部注射了佐剂。

优选的，所述抗体纯化用小鼠预先注射的佐剂为佐剂IFA。

通过采用上述技术方案，佐剂IFA为弗式不完全佐剂，与佐剂CFA相比，缺少结核分支杆菌，主要诱导Th2细胞免疫应答，主要用于后续免疫。在本申请中，在小鼠注射单克隆细胞前先注射佐剂IFA有助于小鼠先的Th2细胞提前产生免疫应答，促使后续注入单克隆细胞时能快速产生中和抗体，有效提高中和抗体的分泌效率，获得更高的抗体分泌量。

第二方面，本申请提供一种单克隆抗体对，适用于建立上述定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，包括乙脑单抗12B9和酶标乙脑单抗13C2-HRP，所述乙脑单抗12B9包括碱基序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区和碱基序列如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区，所述酶标乙脑单抗13C2-HRP包括碱基序列如SEQ ID NO:3所示的重链可变区和碱基序列如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区。

优选的，所述乙脑单抗12B9的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述乙脑单抗12B9的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述酶标乙脑单抗 13C2-HRP的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述酶标乙脑单抗13C2-HRP 的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

通过采用上述技术方案，本申请经过试验发现，将上述碱基序列及其对应的氨基酸序列获得的单克隆抗体对应用于本申请的检测方法中，具有更好的捕获效果，因此本申请将其作为进一步的优选。

第三方面，本申请提供一种定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法在制备乙脑疫苗中的应用，利用该方法为乙脑疫苗的生产提供可靠的定量数值依据，便于疫苗的生产质量管控。

第四方面，本申请提供一种定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的试剂盒，其特征在于，采用上述定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，对乙脑疫苗中乙型脑炎病毒抗原的含量进行定量测定。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请的方法利用单克隆抗体特异性高、针对性强、能稳定结合抗原的特点，形成“单抗 -抗原-酶标单抗”的ELISA双抗体夹心结构，进而能准确捕获乙脑疫苗中的抗原，再利用回归关系可快速定量检测乙脑抗原含量，为乙脑疫苗的生产提供有利的数据支持。

2、本申请中优选采用小鼠进行免疫处理，特意选用初步免疫以及加强免疫的小鼠细胞进行细胞融合，再经过反复筛选和特异性检测从中逐步筛选出能够分泌中和抗体的单克隆细胞株，由此能有效准确地制备出适用于定量检测乙脑抗原含量的乙脑单抗。

3、本申请中将特定的单克隆抗体对应用到本申请的方法中，能有效提高乙脑疫苗中的有效抗原的捕获效果，进一步提高抗原定量检测的准确性。

4、本申请的方法应用于乙脑疫苗的生产过程中，能够及时获知疫苗中有效抗原的含量，为疫苗的生产质量管控提高可靠的定量数值依据。

附图说明

图1是本申请实施例1的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1

一、鼠抗乙型脑炎病毒单克隆抗体的制备

1、细胞融合及杂交瘤细胞株的筛选

1-1、制备免疫原，其制备步骤如下：

①、将1mL乙脑病毒纯化液与1mL的佐剂CFA混合；

②、使用超声细胞粉碎机对混合物进行超声处理，条件为超声3s，暂停3s，进行10-15次处理，至乳状混合物，获得免疫原A；

③、将1mL乙脑病毒纯化液与1mL的

④、将混合物在转速范围设定为80-100rpm的摇床上，室温摇动2hr，获得免疫原B；

⑤、A与B等体积混合，收获综合免疫原。

其中，乙脑病毒纯化液为乙脑疫苗生产过程中的病毒蛋白浓溶液，浓度为800μg/mL。

1-2、用综合免疫原免疫3组细胞融合用小鼠，依次记作1#、2#和3#，每组小鼠设3只做平衡实验。

1-3、免疫后在第14天(按第一次免疫日算免疫2周)抽取小鼠尾血，使用间接ELISA方法进行小鼠血清中抗体效价的评价。3组小鼠尾血抗体识别乙脑病毒效价均能达到1：50000，下一步选取1#进行细胞融合。同时剩下的两组小鼠继续加强免疫，并于免疫的第21天(按第一次免疫日算免疫3周)再次评价尾血。加强免疫后2#和3#小鼠识别抗原滴度仍达到1:50000，下一步选取2#小鼠再次进行细胞融合，3#用于监测免疫效果(若1#和2#小鼠免疫效果不理想，3#小鼠免疫时间最长可作为替补进行细胞融合)。

1-4、根据ELISA评价的结果，先后选择了1#小鼠在免疫第17天(按第一次免疫日算) 以及2#小鼠在免疫第26天(按第一次免疫日算)的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。融合后第10天共挑取1222个单克隆细胞在96孔板中进行培养，再经过7天培养，取单克隆细胞的细胞上清液用PBS缓冲液按体积比为1:1稀释后，通过间接ELISA方法对96孔板中的细胞培养上清进行评价，筛选能够分泌识别乙脑病毒的单克隆抗体的单克隆细胞株。

上述筛选方法为：乙脑病毒蛋白用PBS稀释至1μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBS溶液洗板3次，使用5％milk-PBS在室温封闭1hr；然后使用PBS溶液洗板1 次。再使用5％milk-PBS 1:1稀释96孔板中的细胞上清液加入包被板中，室温反应1hr；然后使用PBS溶液洗板3次，并进行拍干后，加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG(Fc) 二抗，室温反应1hr；PBS溶液洗板5次后，拍干，加入等体积的显色液A液和B液，避光、室温条件下反应20min；然后加入50μL终止液，混匀后在酶标仪上读取OD450值和OD630 值，输出OD＝OD450-OD630。筛选输出OD值大于1.0的孔作为阳性孔，共13块孔板，该 13块孔板上对应的OD值参见下表一。

表一 13块孔板上小鼠融合单克隆细胞株的OD值

1-5、根据上表一，挑选出54株信号较高(OD值大于1.0)的阳性克隆细胞株，并将这些阳性克隆细胞株从96孔板中扩大培养至48孔板中，继续培养2-3天，通过间接ELISA 方法分别包被乙脑病毒、人血白蛋白、Vero细胞蛋白和培养废液进行了复筛确认和特异性检测实验，54株阳性克隆细胞株复筛的OD值参见下表二。

表二 54株阳性克隆细胞株复筛的OD值

注：PC阳线对照；NC为阴性对照5％milk-PBS，阳性判断标准为NC值的2.1倍。

1-6、保留识别乙脑病毒较强的37株阳性克隆细胞株，将这37株阳性克隆细胞株从48 孔板继续扩大培养至12孔板，培养2天，通过间接ELISA方法分别包被乙脑病毒、人血白蛋白、Vero细胞蛋白和培养废液进行了再次复筛确认及特异性检测，37株阳性克隆细胞株特异性检测的OD值参见下表三。

表三 37株阳性克隆细胞株特异性检测的OD值

1-7、保留25株(1C2、1E9、1F6、1F11、1G7、1G10、2G11、3B4、3D9、3E12、3H1、 4D8、4E10、4F12、5E4、6A5、6E11、7G8、8A4、8A7、9G8、11A1、12B9、13B12、13C2) 只识别乙脑病毒，不识别人血白蛋白、Vero细胞蛋白和培养废液的阳性克隆细胞株。对该25 株乙脑病毒进行体外抗体中和实验，筛选出8株阳性克隆细胞株。

上述筛选采用的中和试验法，是病毒与相应的抗体结合后，失去对易感细胞的致病力的试验方法。特异性中和抗体，与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。本实验运用中和试验法筛选适宜的单克隆抗体，为后续实验提供理实验数据及理论依据。

中和实验法具体包括以下操作步骤：

①、六孔细胞板制备

配制BHK21细胞悬液；取对数生长期的BHK21细胞制成8×10

②、病毒与抗体中和

将待检样品稀释至浓度为10μg/mL，取约200PFU/0.4mL的检定用乙型脑炎病毒，分别取稀释好的待测抗体500μL与稀释好的病毒悬液等量混合；将上述抗体病毒混合液于37℃水浴中和90分钟，每30分钟摇匀一次。

③、细胞与病毒的吸附

将长满单层的BHK21细胞板中的培养液吸出，然后加入中和后的抗体与病毒混合液每组各1 孔；病毒对照组12孔，每孔0.4mL。轻轻摇动六孔细胞培养板，使液体均匀分布；将六孔细胞培养板置二氧化碳培养箱(37℃、5％CO

④、覆盖甲基纤维素覆盖液

吸附90分钟后，于六孔细胞培养板中缓慢加入甲基纤维素覆盖液，每孔4mL；然后放在二氧化碳培养箱(37℃、5％CO

⑤、计算结果

培养5天后，将六孔细胞培养板孔中液体吸出，加入结晶紫染色工作液，约2mL/孔；室温中染色30分钟，然后弃去染色工作液；用流动水轻轻冲洗各孔，直至水流看不到颜色，晾干后计数每孔蚀斑数，中和实验计算结果见下表四。

表四 第一次验证(25株上清/抗体)病毒中和结果

2、腹水制备及抗体纯化

2-1、结合上表四的中和试验结果，选取8株中和活性较好的阳性克隆(依次为1C2、3E12、 5E4、8A4、8A7、11A1、12B9、13C2)制备纯化抗体。将这8株克隆细胞扩大培养，在对数期时，将约1×10

2-2、收集好的腹水上清进行Protein G纯化，收获纯化抗体。具体过程为：取1mL柱料(偶联Protein G)加入至一根空柱中，使用PBS溶液清洗后，将2mL腹水上清用8mL的 PBS稀释后上柱，或直接将细胞上清上株，收集洗脱液并重新上柱一次；然后使用pH 2.7的甘氨酸洗脱液进行洗脱，每管收集1mL洗脱液(预先加入100μL中和液(1M Tris，0.75M NaCl，0.5μM EDTA，pH 8.0-8.3)，共收集5管；随后使用pH 1.9的甘氨酸洗脱液进行洗脱，每管收集1mL洗脱液(预先加入300μL中和液)，共收集3管；然后分别对每管洗脱液使用紫外分光光度计在280nm处进行读数，将OD280大于0.7的洗脱液混合并重新测定混合液的OD280，按照1.4的系数计算抗体浓度；抗体浓度＝OD280/1.4。

3、纯化抗体HRP检测和标记

3-1、将选取的8种单克隆抗体对应腹水上清中的抗体得率以及纯化抗体结合乙脑病毒的灵敏度进行检测，腹水抗体得率和灵敏度的检测结果参见下表五。

表五 8株阳性克隆的腹水抗体得率和灵敏度检测结果

结合上表五的腹水抗体得率和纯化抗体结合乙脑病毒的灵敏度，选取3E12、8A7、11A1、13C2进行HRP标记。

3-2、通过间接ELISA检测标记前后抗体效价，梯度包被乙脑病毒(包被浓度为1000ng/well，300ng/well，100ng/well，30ng/well，10ng/well)，标记前抗体作为一抗，羊抗小鼠二抗，以及直接法检测HRP标记后抗体进行检测，纯化抗体标记检测结果参见下表六， HRP标记抗体检测结果参见下表七。

表六 纯化抗体标记结果

表七 HRP标记抗体检测结果

注：NaN表示OD值大于4.0；NC为阴性对照5％milk-PBS，阳性判断标准为NC值的2.1倍。

结合表七的HRP标记抗体检测结果来看，3E12、8A7、13C2标记后抗体灵敏度与标记前抗体灵敏度相差小于3倍，判断为合格，11A1标后抗体灵敏度较标前抗体灵敏度差异大于3倍标记效果较差，因此优先选取3E12、8A7、13C2标记后抗体作为检测抗体继续研发定量检测试剂盒。

4、抗体配对

根据单克隆抗体研制工作的结果，进行不同抗体的配对测试。按照双抗体夹心法的实验要求，以未标记抗体作为包被抗体，用HRP标记的另一抗体进行了配对实验，检测结果见表八-表十一。

表八 配对试验一

表九 配对试验二

表十 配对试验三

表十一 配对试验四

结合上表八至十一的配对试验结果，上述28组配对曲线均有梯度，因此28组单克隆抗体对配对成功。

其中，本实施例中乙脑单抗12B9和酶标乙脑单抗13C2-HRP组成的单克隆抗体对，其曲线梯度相对其他单克隆抗体对较好，能够较好地捕获乙脑病毒抗原，因此本实施例将其作为进一步的优选。将上述单克隆抗体对委托第三方机构进行基因测序，得到乙脑单抗12B9 包括碱基序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区和碱基序列如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区，酶标乙脑单抗13C2-HRP包括碱基序列如SEQ ID NO:3所示的重链可变区和碱基序列如 SEQ ID NO:4所示的轻链可变区。

进一步获得乙脑单抗12B9的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，乙脑单抗12B9的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；酶标乙脑单抗13C2-HRP的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，酶标乙脑单抗13C2-HRP的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

需要说明的是，上述方法单克隆抗体对的制备方法为本申请较为优选的一种，除此之外还可以在上述已知抗体基因片段的基础上，采用基因编辑等手段获得该目标单克隆抗体对，但基因编辑手段获得的抗体存在一定的突变性，难以保证抗体的稳定性，因此本申请优选细胞株筛选的方式获得。但上述单克隆抗体对的制备方法但并非唯一优选方案，其中的试剂工艺参数以及原料试剂可以根据需要做出适当替换或者调整。

本申请以单克隆抗体12B9、检测抗体13C2-HRP为例对本申请定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法做进一步详细说明。

二、定量检测乙型脑炎病毒抗原含量(具体实验样品检测)

一种定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，包括以下步骤：

1、将乙脑单抗(单克隆抗体12B9)配制成包被液(浓度5μg/mL)，每孔加包被液50μL，用封口膜封好，置于4℃过夜后取出倒空板，加300μL/孔封闭液(1％BSA牛血清白蛋白的PBS 溶液)，再用封口膜封好置于湿盒中37℃1小时，洗板机清洗4次，洗液300μL/孔，倒空板，用封口膜封好，置于2-8℃保存；

2、将预先包被好的酶标板从冰箱中取出，室温平衡30分钟。

3、参考品以2倍法稀释6个浓度，样品稀释至适宜浓度，每次实验设空白对照、阴性对照各两孔；

4、加样100μL/孔，加样后酶标板用封口膜密封，置于37℃孵育60分钟，洗板3次300μ L/孔；

5、加酶结合物工作液(检测抗体13C2-HRP)100μL/孔，加样后酶标板用封口膜密封，置于 37℃湿盒中孵育60分钟；洗板3次，洗液300μL/孔。

6、加底物液A，50μL/孔，底物液B 50μL/孔，25℃避光显色10分钟。

7、加终止液(1mol/L硫酸溶液)50μL/孔，选择酶标仪主波长450nm，参考波长630nm，测定各孔吸光值(OD值)。

三、专属性检验

选取生产用人血白蛋白(阴性对照)、合苗稀释液(2％人血白蛋白PBS溶液)、本公司生产的狂犬病疫苗(生产批号为202101)以及乙型脑炎病毒疫苗(生产批号为B20210101X和 202008B11)，按上述“定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法”进行试验，检测结果参见下表十二，显示仅乙脑样品可检测出结果，合苗稀释液、人血白蛋白、狂犬病疫苗样品均未检测出，表明该方法适用乙脑抗原的检测，并且不会和其他基质或其他品种抗原产生非特异性结合。

表十二 专属性检验结果

四、结果计算

选取乙脑效力标准品作为参考品，选取乙型脑炎疫苗B20210101X、202008B11作为样品，按上述“定量检测乙型脑炎病毒抗原含量”中的方法进行实验。

参考品以OD值为Y，浓度为X，采用四参数的拟合方式进行线性拟合，获得标准曲线。将样品OD值代入拟合曲线计算结果，再乘以样品的稀释倍数即得到样品相对参考品的含量。标准曲线参见图1，参数参见下表十三，曲线公式(回归方程式)参见下表十四。

表十三 标准曲线参数

表十四 曲线公式(回归方程式)

以此方法检测乙型脑炎灭活疫苗成品，代入上述标准曲线公式，实验数据结果如下表十五。

表十五 乙脑疫苗实验数据结果

从表十五的实验数据显示，乙脑样品通过本方法可以定量的检测出乙脑抗原含量，并且各浓度结果稳定一致。经多次实验其标准曲线R

实施例2

本实施例在实施例1的方法基础上，在制备单克隆抗体对时，仅使用第二次细胞融合得到的单克隆细胞株进行培养，筛选出一对优选的单克隆抗体对。

实施例3

本实施例在实施例1的方法基础上，在制备单克隆抗体对时，使用免疫原A进行初次免疫和加强免疫，筛选出一对优选的单克隆抗体对。

实施例4

本实施例在实施例1的方法基础上，在制备单克隆抗体对时，使用免疫原A进行初次免疫，使用免疫原B进行加强免疫，筛选出一对优选的单克隆抗体对。

实施例5

本实施例在实施例1的方法基础上，在制备单克隆抗体对时，使用佐剂IFA替换

对比例1

本对比例在实施例1的方法基础上，将检测抗体13C2-HRP替换为(乙脑单克隆加山羊抗小鼠IgG(H+L))间接ELISA夹心法，其中，山羊抗小鼠IgG(H+L)购自Jackson ImmunoResearch，货号为115-035-003。

将实施例2-5以及对比例1获得的单克隆抗体对适用在实施例1的“定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法”中形成相应的试验方法，选取乙脑效力标准品作为参考品，选取乙型脑炎疫苗B20210101X、202008B11作为样品进行试验。参考品以OD值为Y，浓度为X，采用四参数的拟合方式进行线性拟合获得标准曲线公式，其对应的线性关系以及精密度结果参见下表十六。

表十六 实施例1-5以及对比例1的线性关系和精密度结果

参见表十六，本申请的检测方法相对于对比例具有更高的线性关系和可行性，能更好地应用于乙脑疫苗中抗原含量的测定。在本申请中，实施例1的线性关系和精密度更为优异，因此将其作为进一步的优选。

综上，本申请的定量检测乙脑病毒抗原含量的方法利用“单抗-抗原-酶标单抗”的ELISA双抗体夹心结构，可以根据生产企业实际的生产情况，根据参考品的浓度曲线，定量计算出样品的浓度，可以更有效的预知成品疫苗的抗原含量，为疫苗成品生产提供更可靠的定量数值依据，在乙脑疫苗生产中具有良好的应用前景。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

序列表

<110> 辽宁成大生物股份有限公司

<120> 定量检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法、为建立该方法所制备的单克隆抗体及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 358

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaggtgcagc tggaggagtc aggacctagc ctcgtgaaac cttctcagac tctgtccctc 60

acctgttctg tcactggcga ctccatcacc agtggttact ggatctggat ccggaaattc 120

ccaggaaata aacttgagta catggggtac ataagctaca gtggtaccac ttactacaat 180

ccatctctca aaagtcgaat ctacatcact cgagacacat ccaggaacca atattacctg 240

cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag aggattacga 300

cgggattact atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcag 358

<210> 2

<211> 322

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacatccagc tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gaacaagtga aaatatttac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 240

gaagattttg gaagttatta ctgtcaacat cattatggta ttcctccgac gttcggtgga 300

ggctccaagg tggatctcaa ac 322

<210> 3

<211> 349

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggtgcagc tgaagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggcaa tactaaatat 180

gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca cattttccaa tacagcctat 240

ttgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc cctacaacga 300

catgctttgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcag 349

<210> 4

<211> 322

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacattgtga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct 60

ctttcctgca gggccagcca gagtattagc gaccacttac actggtatca acaaaaatca 120

catgagtctc caaggcttct catcaaatat gtttcccatt ccatctctgg gatcccctcc 180

aggttcagtg gcagtggatc agggtcagat ttcactctca gtatcaacag tgtgcaacct 240

gaagatgttg gcgtgtatta ttgtcaacat ggtcacagct ttccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa ac 322

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Ile Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Tyr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Arg Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Leu Arg Arg Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ile Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys Val Asp Leu Lys

100 105

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Leu Gln Arg His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp His

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Val Ser His Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Gly His Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105