二甲双胍注射液在制备提高认识水平的抗衰老产品中的应用

摘要

本发明公开了二甲双胍注射液在制备提高认识水平的抗衰老产品中的应用，二甲双胍注射液可以显著提高老年受体小鼠的认识水平，通过尾静脉短期注射老年小鼠，可以显著提高血管再生和神经再生的能力，与长期口服二甲双胍具有明显副作用相比，本发明显示了其在衰老领域中的潜在的应用价值；综上，本发明提供的二甲双胍注射液在制备提高认识水平的抗衰老产品中的应用，具有重要的意义和临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是二甲双胍注射液在制备提高认识水平的抗衰老产品中的应用。

背景技术

从生物学上来讲，衰老是生物随着时间的推移，自发的必然过程，也是复杂的自然现象；从生理学上来讲，我们将衰老看作是从受精卵开始一直进行到老年的个体发育史。衰老的特征是生理完整的渐进性丧失，进而导致功能受损和易死性增加。这种退化是人类主要的疾病的一级风险因子(如肿瘤、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病等)。每个人都希望通过各种各样的抗衰老方法来延缓衰老和机体老化。目前，研究者普遍认为热量限制是探究生物寿命延长的最好的实验技术，也是最具有说服力的抗衰老模型，而热量限制需要严格控制饮食才能实现它的有益作用，所以大部分的研究集中在齿类动物和非人类的灵长类动物中，因此，很多学者都提出寻找一种可以替代热量限制的药物，经过大量的实验证实二甲双胍是不需要热量限制的条件就能激活热量限制相似的代谢和压力信号通路而产生节食饮食产生的影响的药物，SpindlerSR的研究表明短期的摄入二甲双胍(8周)可以模仿长期的节食产生的75％的基因表达，而短期的节食(8周)只能模仿长期节食产生的71％的基因表达，二甲双胍对代谢产生的影响和热量限制非常的相似，也就暗示着二甲双胍能够产生和热量限制一样的影响比如说生命周期的延长，减少很多退行性疾病的发生率。

二甲双胍作为一种治疗糖尿病的药物由于其降糖效果好，并且表现出较少的副作用，因此被广泛应用于糖尿病的治疗。二甲双胍可以降低血浆胰岛素水平，减少IGF-1信号，抑制mTOR，电子传递链中线粒体复合物，减少内源性活性氧，激活AMPK，减少DNA的损伤，二甲双胍还可以抑制炎症，促进自噬等，来达到延缓衰老的目的。

最近也有报道，口服二甲双胍可以延缓衰老，延长寿命。但是，口服二甲双胍存在较多的副作用，且口服二甲双胍在延缓衰老，延长寿命方面的的效果仍然不佳。

发明内容

本发明提供了二甲双胍注射液在制备提高认识水平的抗衰老产品中的应用，具有重要的意义和临床应用价值。

为达此目的，本发明提供如下的技术方案：

本发明的第一个方面，提供了二甲双胍注射液在制备提高认识水平的抗衰老产品中的应用。

优选的，所述二甲双胍注射液包括二甲双胍和注射用溶剂。

优选的，所述二甲双胍的浓度为1-50mmol/L。

优选的，所述注射用溶剂包括灭菌水、生理盐水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、甘油、注射用植物油。

优选的，所述二甲双胍注射液的给药方式包括：静脉注射，每天给药一次。

优选的，所述产品包括药物、化妆品、护肤品。

本发明的第二个方面，提供了一种提高认识水平的抗衰老产品，包括二甲双胍和注射用溶剂。

优选的，所述二甲双胍的浓度为1-50mmol/L。

优选的，所述注射用溶剂包括灭菌水、生理盐水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、甘油、注射用植物油。

优选的，所述产品的给药方式包括：静脉注射、每天给药一次。

本发明通过实验发现二甲双胍口服会影响肠道微生物，影响其疗效，长期服用会有明显的副作用；在哺乳类动物衰老的过程中，由于肠道微生物也发生明显的改变，而口服二甲双胍，虽然在一定程度上可以重塑肠道微生物，但是在其对宿主影响上，由于也通过肠道微生物的作用，使得其抗衰老效果远远低于静脉注射方式产生的效果。因此，本发明发现使用二甲双胍的方式是一个关键。本发明利用了二甲双胍强大的抗衰老能力，同时避开了肠道微生物的巨大干扰，首次采用采用静脉注射方式，可以提高机体血管和神经再生水平，逆转认知衰老表型。更进一步，本申请发现，静脉注射二甲双胍对提高认知水平具有优势，且受体具有药物浓度依赖性，因此，通过大量实验验证了二甲双胍的浓度不小于1mmol/L，不大于50mmol/L，静脉注射每天给药一次。

与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：

1、本发明首次提出二甲双胍注射液在制备提高认识水平的抗衰老产品中的应用，并验证了二甲双胍注射液的浓度依赖性，从而研发出二甲双胍注射液的使用浓度、方式和方法。

2、本发明还验证了肠道微生物是口服二甲双胍提高老年小鼠认知水平的充分必要条件，长期口服二甲双胍具有较多的副作用。

附图说明

为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简单介绍。

显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。

图1A为本发明实施例1的注射组与对照组小鼠认知水平实验结果；

图1B为本发明实施例1的两组小鼠到达隐藏平台的时间；

图1C为本发明实施例1的两组小鼠游走速度的结果；

图1D为本发明实施例1的三种注射浓度小鼠认知水平实验结果；

图1E为本发明实施例1的三种注射浓度小鼠到达隐藏平台的时间；

图1F为本发明实施例1的三种注射浓度小鼠游走速度的结果；

图2A为本发明实施例2的长期口服方式小鼠副作用统计；

图2B为本发明实施例2的对照组、口服组和静脉注射组三组小鼠认知水平实验结果；

图2C为本发明实施例2的三组小鼠到达隐藏平台的时间；

图2D为本发明实施例2的三组小鼠游走速度的结果；

图3A为本发明实施例3的口服方式小鼠认知水平实验结果；

图3B为本发明实施例3的口服方式小鼠到达隐藏平台的时间；

图3C为本发明实施例3的口服方式小鼠到达隐藏平台区域的时间；

图3D为本发明实施例3的口服方式小鼠穿过隐藏平台的次数；

图3E为本发明实施例3的口服方式小鼠游走速度的结果；

图3F为本发明实施例3的口服方式小鼠新物体识别结果；

图4A为本发明实施例3的口服二甲双胍、抗生素处理以及抗生素处理加二甲双胍小鼠认知水平实验结果；

图4B为本发明实施例3的三组小鼠穿过隐藏平台的次数；

图4C为本发明实施例3的三组小鼠到达隐藏平台的时间；

图4D为本发明实施例3的三组小鼠到达隐藏平台区域的时间；

图4E为本发明实施例3的三组小鼠游走速度的结果；

图4F为本发明实施例3的口服抗生素处理、抗生素处理加肠道微生物移植以及抗生素处理加肠道微生物移植再加二甲双胍处理小鼠认知水平实验结果；

图4G为本发明实施例3的三组小鼠穿过隐藏平台的次数；

图4H为本发明实施例3的三组小鼠到达隐藏平台的时间；

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例中所提供的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。

下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1静脉注射二甲双胍可以提高老年小鼠认知水平

实验方法：

1.1、实验分组：实验组：使用1mmol/L、10mmol/L和25mmol/L，三种不同浓度的二甲双胍，通过尾静脉注射方式，每隔一天注射10-12月龄和20月龄C57BL/6老年小鼠一次，持续给药1个月。对照组：注射生理盐水组。

1.2、水迷宫实验的具体步骤

Morris水迷宫实验是用于衡量基于海马的空间学习和记忆功能的常用实验手段。其利用小鼠的逃生本能，强迫小鼠在水中游泳，为了尽快找到隐藏在水下的平台，小鼠需要记住平台的空间位置和方向。水迷宫实验由1个直径为1.2m含水的圆形池，1个能够使水温维持在26℃恒温加热器，1个直径为11cm隐藏在水面下1.5cm的圆形逃生平台，1个安装在游泳池中央天花板上用于追踪小鼠的游泳路线的摄像头，以及遍布圆形水池四周，定点标记有不同形状及色块的帷帐组成。水迷宫实验主要包括定位航行实验和空间探索实验。以定位航行实验中平均逃避潜伏期的时间，空间探索实验中第1次找到平台的时间、小鼠在规定目标象限游泳的时间和穿越隐藏在水底的平台的次数作为评价小鼠空间学习和记忆能力的指标。

定位航行实验主要包括以下几个部分：(1)在定位航行实验中，圆形逃生平台淹没在水面以下1.5cm处，小鼠为了从水里逃出来，必须找到隐藏的逃生平台；(2)定位航行实验的训练方案包括5天，每只小鼠每天训练4次，在每次试验中均是把小鼠放在面对水箱的方向，动物被放置在迷宫中靠近四个可能点之一的地方—北、南、东南或西北。每次试验的地点都是随机确定的。(3)在每次试验中，动物被给予60s的时间来定位水下平台。如果小鼠没有找到平台，就会被轻轻引导到平台上。小鼠在找到或被带到平台后，动物被停留在平台上20s，以熟悉其位置与视觉线索。(4)实验过程中将10只左右的小鼠编成一对，每只小鼠的试验间隔约为20min。实验之后用干毛巾将小鼠表面的水分擦干，并用恒温加热板加热。小鼠在训练24h后接受探查试验。探查试验：(5)在探查试验中，平台被移除，小鼠被允许在泳池中游泳60s。安装在游泳池中央天花板上的摄像头用来追踪老鼠的游泳路线。数据收集：(6)数据收集使用计算机动物跟踪系统(EthoVision XTBase；Noldus2020Software，英国)，它记录了小鼠的路径长度，游泳速度，在泳池的每个象限的时间，到达平台所花费的时间以及穿过平台的次数。并且保证整个实验周期都持续在下午1点到5点之间进行。

实验结果：

实验结果如图1所示，二甲双胍可以显著改善老年小鼠的空间学习功能，表现为水迷宫实验中在持续5天的定位航行学习阶段，二甲双胍处理组小鼠第1次到达平台的时间显著变短(图1A，D)，在空间探索时期以第1次到达平台的时间作为评判认知功能的关键指标，结果表明在空间探索期二甲双胍第1次到达平台的时间显著缩短(图1B，E)，并且二甲双胍处理组和对照组的速度没有差异(图1C，F)。结果发现二甲双胍处理可以明显提高老年小鼠的认知水平，且具有浓度依赖性，但是，当浓度大于50mmol/L时，会明显增加小鼠的伤残率。

实施例2静脉注射与口服二甲双胍相比，提高认知水平具有优势

实验方法：

2.1、将8-10月龄小鼠通过尾静脉注射和口服处理2种方式给与二甲双胍。(二甲双胍浓度：10mmol/L)，持续400天，并分别于100、200、300、400天记录小鼠的健康状况，本实验将肉眼可见的病例状态包括肿瘤，白内障，皮炎，早衰和死亡等状况统统归于伤残，伤残率的计算是随着二甲双胍处理时间的延长各实验组中伤残小鼠的个数占该组小鼠总数的百分比。

2.2、水迷宫实验同实施例1。

实验结果：

结果如图2所示，口服有更多的副作用(图2A)，且口服提高认知水平的能力也较静脉注射弱(图2B，C)。

实施例3肠道微生物是口服二甲双胍提高老年小鼠认知水平的充分必要条件

实验方法：

3.1、将老年SPF级小鼠随机分组，将新霉素(1g/L)，万古霉素(0.25g/L)，氨苄(1g/L)，甲硝唑(1g/L)抗生素混合物放于无菌饮水中，每隔3天换1次新鲜配置的抗生素混合液。

3.2、水迷宫实验同实施例1。

3.3、新物体识别

在进行训练和测试前3天，每天抚摸实验小鼠1min，避免刺激小鼠，使其消除与测试者的陌生感。在进行测试或训练前1天，将小鼠放在测试的房间内，适应测试环境。开始训练，将A，B两个物体放在一侧壁的左右两端，小鼠背朝两物体放入场地内，并且小鼠鼻尖距离两物的长度要一致。放入后立即开启录像设备，实验者立即离开测试房间，记录小鼠与这两个物体接触的情况，包括鼻子或嘴巴触及物体的次数和距离物体2-3cm范围内探究的时间。小鼠放入10min结束后，立即将小鼠放回原来饲养的鼠笼内，在1小时后再进行测试。这时将场地内的B物体换作C物体，仍将小鼠背向两物体，鼻尖据两物体距离相同，观察2-5min时间，同样用录像设备录像，观察者离开测试房间，观察指标同上。

实验结果：

结果如图3和4所示。通过我们前期的实验已经表明，静脉注射方式明显比口服方式要好，但是为了再对口服方式进行研究，我们又进行一次验证实验，也确认口服也是可以提高老年小鼠的认知水平(图3A-E)，同时提高新物体识别的能力(图3F)。为了探究肠道微生物在口服二甲双胍中的作用，通过使用四种广谱抗生素处理SPF小鼠，再进行口服二甲双胍处理，发现并不能提高老年小鼠的认知水平(图4A-E)，而抗生素处理后，通过移植为抗生素处理的小鼠粪便，再用二甲双胍处理，能部分恢复认知水平(图4F-H)。

在上述说明书的描述过程中：

术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。

最后应说明的是：

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；

尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。