人脑胶质瘤标志物hsa_circ_0000512及其应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及到hsa_circ_0000512（circRPPH1）基因在胶质瘤诊断、治疗以及预后中的应用。一种胶质瘤的生物标志物，所述标志物是hsa_circ_0000512（circRPPH1）基因。hsa_circ_0000512（circRPPH1）基因在胶质瘤诊断和预后判断相关试剂盒中的用途。hsa_circ_0000512（circRPPH1）基因的抑制剂在制备治疗胶质瘤靶向药物中的应用，所述抑制剂能够特异抑制hsa_circ_0000512（circRPPH1）基因的功能。实验证明hsa_circ_0000512（circRPPH1）基因在体内胶质瘤组织中的表达较正常脑组织中明显上调，使得hsa_circ_0000512（circRPPH1）基因成为肿瘤辅助诊断标志物具备可行性。本发明为胶质瘤诊治提供了新的理论依据和全新稳定性靶标，也为胶质瘤预后判断提供策略。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及到胶质瘤环状RNA：hsa_circ_0000512及其在胶质瘤的诊治与预后中的应用。

背景技术

胶质瘤是最常见的人脑原发性恶性肿瘤，患者常常伴随高死亡率以及较差的预后。当前普遍实施的胶质瘤治疗方式多为外科手术切除辅助术后放化疗的多模态治疗，但是经历此种治疗的患者很大比例上并未出现明显的预后生存期改善。究其原因是恶性胶质瘤本身的高度增殖特性和侵袭特性决定了这一不良预后，肿瘤自身包含着介导肿瘤恶性生物学行为的组织成分，这些成分介导肿瘤细胞复制增殖，逃避人体免疫系统杀伤以及药物的广泛杀伤作用，是肿瘤患者不良预后的关键原因。

胶质瘤干细胞（glioma stem cells，GSCs）是恶性胶质瘤中具有高度自我更新以及多向分化能力的组织成分。多项研究均表明其与胶质瘤细胞的发生发展、增殖侵袭、抗凋亡坏死以及耐药复发等过程有显著且复杂的关联。因此，靶向胶质瘤干细胞的分子治疗能够高效针对胶质瘤恶性的根源，从而从根本上降低术后放化疗的耐受性，并抑制复发，最终有望实现胶质瘤治愈。故探寻一种新的高效的胶质瘤特异性靶向标志物对于恶性胶质瘤的精确诊断、靶向精准治疗以及预后评估均发挥着重要的作用。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一种新型的通过反向剪接方式形成的环状RNA，相比较于线性RNA，可耐受核酸酶的降解作用，呈现出其自身的稳定性。不同的研究证明circRNA在不同级别胶质瘤中存在显著表达差异，尤其在正常组织与胶质瘤组织中比较更为显著，且参与胶质瘤的恶性进展和不良预后。因此，circRNA在胶质瘤的诊断分子筛查、分子诊断、精准治疗等方面发挥其独特的作用。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种胶质瘤标记物即circRNA hsa_circ_0000512，核酸序列：SEQ ID NO:1，及其在恶性人脑胶质瘤的诊断、治疗以及预后等方面的应用。发明人首先基于高通量测序技术分析发现同正常组织相比较，胶质瘤组织中的hsa_circ_0000512显著高表达，且表达量随着WHO分级级别呈正相关。同时，高表达hsa_circ_0000512与不良预后相对应。因此，本发明以患者来源胶质瘤干细胞为研究对象，通过慢病毒载体对hsa_circ_0000512基因进行沉默与过表达，并进一步通过实验发现hsa_circ_0000512的过表达能够进一步促进胶质瘤干细胞的恶性表型的产生，反之，沉默基因后则表现为抑制胶质瘤干细胞的增殖、侵袭表型，此恶性表型通过胶质瘤干细胞相关干性表型得以体现（例如：SOX2/OCT4/Nestin/CD133/Nanog）。

为了明确hsa_circ_0000512在脑胶质瘤的诊断以及治疗中的作用以求达到精准医学的要求，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供了hsa_circ_0000512基因表达水平的检测试剂在制备脑胶质瘤诊断筛查、预后评估的试剂盒中的应用。

进一步地，所述试剂盒中包含扩增hsa_circ_0000512基因的特异性引物、与hsa_irc_0000512基因核苷酸序列杂交的探针或干细胞干性标志物蛋白抗体。

更进一步地，所述扩增hsa_circ_0000512基因的特异性引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

进一步地，所述的脑胶质瘤诊断筛查、预后评估的试剂盒以hsa_circ_0000512基因作为标记物。

更进一步地，所述的脑胶质瘤诊断筛查的试剂盒是通过western或定量PCR技术来检测组织中hsa_circ_0000512基因的表达水平，所述的hsa_circ_0000512基因表达的程度与脑胶质瘤发生率呈正相关。

更进一步地，所述的脑胶质瘤预后评估试剂盒是通过Western或定量PCR技术检测组织中hsa_circ_0000512基因的表达水平，所述的hsa_circ_0000512基因表达的程度与脑胶质瘤的预后生存期呈负相关。

本发明还提供了hsa_circ_0000512基因表达水平的抑制剂在制备治疗胶质瘤的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂能够抑制hsa_circ_0000512基因表达水平。

进一步地，所述抑制剂的靶向序列如SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:11所示。

进一步地，所述抑制剂包括抑制hsa_circ_0000512基因表达的siRNA、shRNA、含有siRNA、shRNA序列的表达载体和/或其他抑制剂化合物；所述表达载体包括真核表达载体，所述真核细胞表达载体包括质粒表达载体或病毒表达载体。

更进一步地，所述抑制hsa_circ_0000512基因表达的siRNA序列如SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:7所示。

与现有技术比，本发明的有益效果如下。

由于目前临床上用于胶质瘤辅助诊断与预后判断的标记物尚不完善或缺乏特异性，本发明提供胶质瘤标记物hsa_circ_0000512及其应用，hsa_circ_0000512基因在体内胶质瘤中的表达较正常脑组织中明显上调，使得hsa_circ_0000512有望成为肿瘤辅助诊断与预后判断的相关特异标记物。并且根据本发明研究结果，抑制内源性胶质瘤中的hsa_circ_0000512表达可显著降低胶质瘤干细胞干性标志物蛋白的表达，即反映恶性增殖行为，这一特性使得hsa_circ_0000512可以成为肿瘤治疗可能的有效靶点。本发明同时通过研究发现hsa_circ_0000512基因表达与胶质瘤患者生存率负相关，即hsa_circ_0000512过表达患者预示着较差的生存预后，这一特性使得hsa_circ_0000512基因能够指示胶质瘤患者生存预后情况。本发明为胶质瘤患者治疗与预后提供的全新思路，附有相关研究依据，能够为人脑胶质瘤特异诊断和预后判断提供全新靶点。

附图说明

图1是hsa_circ_0000512在胶质瘤中的表达情况。其中，a是hsa_circ_0000512在临床各等级胶质瘤与癌旁正常脑组织中的相对表达量，b是70例临床高表达与低表达hsa_circ_0000512基因病例的胶质瘤患者生存分析。

图2是qPCR验证hsa_circ_0000512通过慢病毒载体介导基因的沉默及过表达后发生表达改变。其中，a是患者来源胶质瘤干细胞GSC38、U87-GSC中分别沉默hsa_circ_0000512基因，b是在GSC35和LN229-GSC中分别过表达hsa_circ_0000512基因。

图3是通过MTS实验检测沉默和过表达hsa_circ_0000512基因后，各组胶质瘤干细胞增值活力的改变。其中a是沉默hsa_circ_0000512基因后胶质瘤干细胞GSC38增值活力的改变，b是沉默hsa_circ_0000512基因后胶质瘤干细胞U87-GSC增值活力的改变，c是过表达hsa_circ_0000512基因后胶质瘤干细胞GSC35增值活力的改变，d是过表达hsa_circ_0000512基因后胶质瘤干细胞LN229-GSC增值活力的改变。

图4是通过EdU细胞增殖实验验证沉默和过表达的各组胶质瘤干细胞在增殖方面的变化图片。其中，a是沉默hsa_circ_0000512后胶质瘤干细胞增值变化图，b是过表达hsa_circ_0000512后胶质瘤干细胞增值变化图，c是沉默hsa_circ_0000512 EdU阳性细胞数相对占比统计图，d是过表达hsa_circ_0000512 EdU阳性细胞数相对占比统计图。

图5是通过Transwell细胞侵袭实验验证沉默和过表达的各组胶质瘤干细胞在侵袭方面的变化图片。其中，a是沉默hsa_circ_0000512后胶质瘤干细胞在侵袭方面的变化图，b是过表达hsa_circ_0000512后胶质瘤干细胞在侵袭方面的变化图，c是沉默hsa_circ_0000512后侵袭细胞数计数所得的统计图，d是过表达hsa_circ_0000512后侵袭细胞数计数所得的统计图。

图6是通过胶质瘤干细胞肿瘤球形成实验验证沉默和过表达的各组胶质瘤干细胞在肿瘤球形成方面的变化图片。其中，a是沉默hsa_circ_0000512后胶质瘤干细胞在肿瘤球形成方面的变化图，b是过表达hsa_circ_0000512后胶质瘤干细胞在肿瘤球形成方面的变化图，c是沉默hsa_circ_0000512后肿瘤球大小统计分析图，d是过表达hsa_circ_0000512后肿瘤球大小统计分析图。

图7是肿瘤球有限稀释实验验证沉默和过表达的各组胶质瘤干细胞在干细胞增殖方面的变化。其中，a是沉默hsa_circ_0000512后GSC38胶质瘤干细胞的增殖活性的变化图，b是沉默hsa_circ_0000512后U87-GSC胶质瘤干细胞的增殖活性的变化图，c是过表达hsa_circ_0000512后GSC35胶质瘤干细胞的增殖活性的变化图，d是过表达hsa_circ_0000512后LN229-GSC胶质瘤干细胞的增殖活性的变化图。

图8是通过westernblot检测各组胶质瘤干细胞基因沉默和过表达后在干性标志物蛋白（SOX2/OCT4/Nestin/CD133/Nanog）表达水平上的改变，干性标志物反映了干细胞的增殖分化能力。其中，图a是沉默hsa_circ_0000512后干性标志物的表达量变化，b是过表达hsa_circ_0000512后干性标志物的表达量变化。

图9是胶质瘤干细胞在裸鼠颅内成瘤所得的实验结果统计图以及形成的肿瘤体积统计图。其中a是胶质瘤干细胞在裸鼠颅内成瘤所得的实验结果统计图，b是胶质瘤干细胞形成的肿瘤体积统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明内容作进一步阐述。下列实施例中未注明具体条件的实验技术方法，通常参照常规条件，如《分子克隆实验指南》（第四版）中所述的条件，或按照试剂盒生产厂商所建议说明的方案。

实施例1 hsa_circ_0000512基因在临床各等级胶质瘤样品中表达量高于正常脑组织，且表达量随着等级升高而升高。

1. 研究对象。

研究对象选取70例胶质瘤患者临床样本，其中WHO分级II级20例，III级25例，IV级25例，同期收集因脑外伤接受手术切除的正常脑组织10例。本研究通过医院伦理委员会审查和批准，所有患者样本入组采用前均签署书面知情通知书。

2. 实时荧光定量PCR检测hsa_circ_0000512基因在临床人脑胶质瘤样品中的表达水平。

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）检测hsa_circ_0000512基因在临床胶质瘤样品中的表达水平，操作步骤如下。

（1）采用TRIzol法提取组织总RNA，首先将WHO各等级胶质瘤临床样本及脑外伤样本中获得的正常脑组织，于液氮中磨碎，每50~100mg组织加入1mL TRIzol试剂，匀浆仪匀浆处理，室温静置5min。

（2）每1mL TRIzol试剂加入0.2mL氯仿（三氯甲烷），手动混匀15s，于室温放置3min。

（3）4℃，12000g离心15min。样品分为三层，分别为下层粉色有机相，中层和上层无色水相，RNA存在于上层水相中，吸取上层水相至新的EP管中，每使用1mL TRIzol试剂加入0.5mL异丙醇沉淀水相中的，轻颠倒混匀，于室温放置10min。

（4）4℃，12000g离心10min，离心后在管侧和管底可见凝胶样沉淀，即为所需样本的RNA。

（5）弃上清，加入75%乙醇洗涤RNA沉淀，漩涡混合。每1mL TRIzol至少加1mL 75%乙醇。4℃，7500g离心5min，弃上清。

（6）室温倒置干燥的RNA沉淀5~10min，加入25~100µL无RNase的水（DEPC水），用枪头吸打几次（65℃促溶10~15min）。

（7）收集液即为组织RNA，检测RNA浓度，计算1µg RNA所需体积，采用一步法gDNA去除和cDNA合成试剂盒构建cDNA文库。

（8）采用Real-Time PCR检测70例胶质瘤组织和10例正常脑组织中的hsa_circ_0000512mRNA表达水平。hsa_circ_0000512的引物序列，包括hsa_circ_0000512的正向引物序列（SEQ ID NO:2）及反向引物序列（SEQ ID NO:3）。不同组间比较用独立t检验(常变量)，两组间均数的比较用t检验，分类变量的比较用χ

结果如图1a和图1b所示，发现hsa_circ_0000512在胶质瘤中的表达高于正常脑组织，且表达量随胶质瘤WHO分级的升高而增高，并且hsa_circ_0000512高表达患者具有更加不良的预后。

3. 胶质瘤干细胞的培养。

配制胶质瘤干细胞培养基：DMEM/F12培养基中加入B27成分至2%浓度，并分别加入rh-bFGF和rh-EGF至20ng/mL浓度。选取状态良好的患者来源胶质瘤干细胞，放置在多聚赖氨酸未处理的悬浮细胞培养瓶中，加入5~10mL配置胶质瘤干细胞培养基，置于37℃恒温、5%CO

4. 构建稳定敲低和过表达hsa_circ_0000512的胶质瘤干细胞株。

（1）构建hsa_circ_0000512沉默或过表达的慢病毒质粒。

hsa_circ_0000512基因采用siRNA进行沉默，siRNA和过表达质粒均由上海吉凯生物科技公司进行合成，siRNA序列如下：hsa_circ_0000512-沉默1：正义链：GAGGUGAGUUCCCAGAGAA（SEQ ID NO：4），反义链：UUCUCUGGGAACUCACCUC（SEQ ID NO：5），hsa_circ_0000512-沉默2：正义链：GGAGCUUGGAACAGACUCA（SEQ ID NO：6），反义链：UGAGUCUGUUCCAAGCUCC（SEQ ID NO：7）。阴性对照序列：正义链：UUCUUCGAAGGUGUCACGUTT（SEQ ID NO：8），反义链：ACGUGACACCUUCGAAGAATT（SEQ ID NO：9）。hsa_circ_0000512过表达质粒含有hsa_circ_0000512编码区域的全部cDNA序列（SEQ ID NO:1）。

（2）病毒感染人胶质瘤干细胞。

选取生长状态良好的胶质瘤干细胞，病毒感染 MOI=10，根据病毒滴度计算所需病毒体积，Enhance感染增强液、Polybrene剂量，弃去培养基，加入上述病毒感染混合液，继续培养10-12h，弃去病毒感染混合液，加入正常培养基继续培养，额外加入嘌呤霉素筛选成功感染的胶质瘤干细胞，作用浓度5-10µg/mL，根据细胞状态递增，持续筛选4周，通过qPCR检测慢病毒感染后hsa_circ_0000512过表达或沉默效果，如图2a-b所示。

实施例2 hsa_circ_0000512对胶质瘤干细胞的生物学作用。

1. MTS细胞活性实验。

（1）选取生长状态良好的胶质瘤干细胞（hsa_circ_0000512过表达、沉默或对照组），接种至 96 孔板中，每孔1000个细胞，100µL培养基，每组细胞做4个副孔，同时设置100µL不含细胞的培养基作为调零孔，共铺板5块96孔板，记录为第一天(d1)、第二天(d2)......第五天(d5)。

（2）接种24h后向d1孔板每组细胞中加入20µLMTS溶液，37℃孵育3h，摇匀后于495nm波长下用酶标仪检测各细胞孔和调零孔吸光度值，细胞孔吸光度值减去调零孔吸光度值即为反映该孔细胞增殖的实际吸光光度值。

（3）重复检测d2、d3、d4和d5各组胶质瘤细胞吸光光度值，绘制统计折线图，比较不同组细胞的增值能力变化，结果如图3a-d所示。

2. EDU实验。

（1）选取生长状态良好的胶质瘤干细胞（hsa_circ_0000512过表达、沉默或对照组)，接种至24孔板中，每孔接种细胞数为1×10

（2）向24孔板中的各组胶质瘤干细胞中加入含10 µM EdU 试剂的培养液，37℃继续培养2h。

（3）撤去培养液，PBS清洗后加入4%多聚甲醛，室温固定15min，4℃、800rpm离心5min，弃上清液，PBS重复清洗2次。

（4）加入0.5%Trinton X-100，室温通透20min，4℃、800rpm离心5min，PBS重复清洗2次，加入Click反应工作液，避光孵育30min。

（5）弃去工作液，加入含有DAPI的防荧光淬灭封片剂封片，避免产生气泡，置于荧光显微镜下观察，并计算EdU细胞的阳性率，结果如图4a-b所示，统计图如图4c-d所示。

3. Transwell侵袭实验。

（1）向24孔板中的各孔中添加含血清的培养液600µL，并放上Transwell小室。

（2）在每孔小室中添加50µL的Matrigel，放置在37℃孵箱内待基质胶凝固。

（3）选取生长状态良好的胶质瘤干细胞（hsa_circ_0000512过表达、沉默或对照组)，用胰酶消化后，用无血清培养基重悬细胞，并接种至24孔板中，每孔接种细胞数为1×10

（4）取出小室，用PBS冲洗小室，并放置于固定液中固定30min。

（5）撤去固定液，PBS清洗，用棉签轻轻拭去上层细胞，后置于0.1%结晶紫染液中染色30min，用PBS清洗后置于倒置显微镜下观察，穿过小室的细胞数体现了侵袭能力，图片结果如图5a-b所示，统计图如图5c-d所示。

4. 神经肿瘤球形成实验。

（1）选取生长状态良好的胶质瘤干细胞（hsa_circ_0000512过表达、沉默或对照组），接种至24孔板中，每孔调整至200个细胞，培养7天。

（2）于倒置显微镜下观察每孔中肿瘤球形成的数目，拍照并用Image J软件计算肿瘤球的大小，图片结果如图6a-b所示，统计图如图6c-d所示。

5. 神经肿瘤球球有限稀释实验。

（1）选取生长状态良好的胶质瘤干细胞（hsa_circ_0000512过表达、沉默或对照组），接种至96孔板中，各孔依次接种1、10、20、30、40 和50个细胞，每孔重复10次，持续培养7天。

（2）于倒置显微镜下观察每孔中神经球形成的数目，并记录数据，采用ELDA法进行数据分析 (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda)。

结果如图7a-d所示，在GSC38和U87-GSC中沉默hsa_circ_0000512的表达，胶质瘤干细胞的增殖活性和神经球形成能力明显减弱，而在GSC35和LN229-GSC中过表达hsa_circ_0000512，胶质瘤干细胞的增殖活性和神经球形成能力则明显增强。

6. Westernblot检测基因hsa_circ_0000512沉默和过表达后胶质瘤样品中干性标志物的表达水平。

（1）组织蛋白提取：将各临床胶质瘤肿瘤组织及正常脑组织，采用液氮充分匀浆组织，加入200µL蛋白裂解液，摇床4℃冰浴30min，12000rpm离心10min，吸取上清液即为组织蛋白。

（2）蛋白浓度BCA法测定：按梯度配制蛋白标准品：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，配制新鲜的BCA工作液：反应液A液和B液以50:1比例配制，分别将蛋白标准品、待检测蛋白样品以每孔20µL加入到96孔板中，随后加入200µL BCA工作液，放置于37℃恒温孵育30min，随后在酶标仪下检测562nm波长下各样品吸光度值，绘制蛋白浓度标准曲线后利用线性相关公式计算出待测蛋白样品浓度。

（3）制备蛋白样品：各组蛋白样品上样量归一化，计算所需蛋白体积，用蛋白上样缓冲液溶解，调整至各样品等体积等浓度，使得各蛋白样品的最终上样量为20~40µg，并放置于加热模块100℃ 5min使蛋白样品充分变性。

（4）上样和电泳：配制新鲜的SDS电泳液，在12.5%SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳凝胶中缓慢加入蛋白样品和marker，100V恒压电泳，直至溴酚蓝跑至距离板底约1cm时终止电泳，时间约1.5h。

（5）转膜：配制新鲜的转膜液，根据转膜夹、海绵大小裁剪滤纸、根据需要转膜的区域面积裁剪PVDF膜并以甲醇激活，取出SDS-PAGE凝胶，以负极、海绵、3层滤纸、胶、PVDF膜、3层滤纸、海绵、正极顺序组装转膜夹，贴合胶与PVDF膜并去除气泡，于4℃环境下200mA恒压转膜90min。

（6）封闭：转膜结束后取出PVDF膜，另取脱脂奶粉溶于TBST配制成5%的脱脂奶粉封闭液，将PVDF膜浸入封闭液室温封闭1h。

（7）孵育一抗：以TBST稀释SOX2/OCT4/Nestin/CD133/Nanog这些干性标志物蛋白特异性结合的单克隆抗体（购自Abcam），稀释比例 1:1000，4℃孵育过夜（>12h）。

（8）孵育二抗：TBST清洗PVDF膜，连续清洗3次，每次摇床10min，以1:10000配制HRP标记的山羊抗兔二抗，室温孵育1h。

（9）弃去二抗，TBST清洗PVDF膜，连续清洗3次，每次摇床10min，混合ECL发光液，上机曝光检测。

结果如图8a-b所示，hsa_circ_0000512沉默后干性标志物的表达量降低，而过表达后干性标志物则表达增高，干性标志物反映了干细胞的增殖分化能力。

7. 颅内成瘤实验。

（1）选取生长状态良好的胶质瘤干细胞（hsa_circ_0000512沉默组与对照组），消化后调整细胞浓度至1×10

（2）裸鼠采用0.75%的戊巴比妥钠麻醉，剂量50mg/kg，腹腔注射，待裸鼠麻醉起效后，将裸鼠固定于立体定位仪上，切开头皮，于矢状缝右侧2mm、前囟后2mm穿刺，用微量注射器缓慢插入颅脑3mm，泵控注射3µL上述各组细胞悬液，注射速度0.5µL/min，持续注射6min。

（3）注射完毕后停留针2min，逐渐退针，拔出微量注射器，骨蜡封堵穿刺口，缝合头部皮肤，放于保温毯内，待裸鼠苏醒后继续归笼饲养，每组胶质瘤细胞分别注射5只裸鼠。

（4）每日观察裸鼠状态，同时记录裸鼠存活时间，并计算各组生存率。针对当日死亡裸鼠，立即取出脑组织，4%多聚甲醛溶液固定、切片，分别行HE、免疫组化染色，计算颅内成瘤体积，肿瘤体积V=(D×d

结果如图9a-b所示，结果显示敲低hsa_circ_0000512基因显著降低了胶质瘤干细胞的体内成瘤能力，而外源过表达hsa_circ_0000512基因则显著增强了胶质瘤干细胞的体内成瘤能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医科大学附属第一医院

<120> 人脑胶质瘤标志物hsa_circ_0000512及其应用

<130> 2022-04-19

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<170> PatentIn version 3.5

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