一种高效固定β-琼胶酶的方法及其应用于琼胶低聚糖的制备

摘要

本发明公开了一种高效固定β‑琼胶酶的方法及其应用于琼胶低聚糖的制备，属于酶工程领域。本发明提供的方法为将β‑琼胶酶与一步法制备的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒混合孵育得到固定化β‑琼胶酶。本发明提供的高效固定化β‑琼胶酶不仅能提高β‑琼胶酶的催化活性及热稳定性，而且容易从酶解体系中分离出来，实现了β‑琼胶酶的重复利用，降低了生产成本。将所述固定化β‑琼胶酶应用于琼胶低聚糖的制备中，大大降低了酶制剂的原料成本，具有较高的工业化应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效固定β-琼胶酶的方法及其应用于琼胶低聚糖的制备，属于酶工程领域。

背景技术

琼胶具有一定粘性，是一种公认的安全的食品添加剂，由3,6-内醚-α-L-半乳糖和β-D-半乳糖的琼胶二糖(G-AHG)重复单元组成，是一种中性线性多糖。琼胶低聚糖为琼胶水解后产生的以β-D-半乳糖为还原性末端的聚合度为2-10的低聚糖。研究表明琼胶低聚糖具有普通寡糖无法比拟的生理功能，如免疫调节、抗炎活性、抗氧化活性、美白保湿和抑制黑色素瘤细胞增殖等有益功能，可以广泛应用于医药业、食品和化妆品行业，是一种非常有价值的海洋功能性低聚糖。

琼胶低聚糖的制备方法主要有酸水解和酶降解两种。其中，酸水解方法简便，降解速率快，但是会产生大量污染物，并且产品复杂不可控，后续分离成本较高。相比而言，生物酶法通过β-琼胶酶直接水解琼胶的β-1,4糖苷键获得新琼寡糖，具有制备环境温和，对环境友好，产物可控度高等优势。因此，近年来酶降解成为制备琼胶低聚糖的主要方法。

但是天然的琼胶酶存在产量低，稳定性差，不易分离等问题，且酶价格较昂贵，这些已成为制约琼胶低聚糖高效制备的主要瓶颈，通过酶的固定化技术则可有效解决这些问题。固定化酶指借助载体材料将酶固定于一定空间内进行反应，能有效抵抗环境改变对酶活性的影响，同时易于酶的回收使用，简化后续分离纯化步骤，实现酶的重复利用。因此，开发一种高效实用的固定化β-琼胶酶能大大降低生产成本。

现在技术中主要采用戊二醛共价交联作用实现琼胶酶固定化，中国专利CN104651430A公开了一种利用戊二醛作为交联剂将琼胶酶与磁性纳米粒子共价结合的方法，琼胶酶成功实现固定化，具备反复使用特点，但是戊二醛对于琼胶酶活性影响较大，固定化后酶活保留率不高于40％，且重复使用7次后相对酶活降低为40％。因此，急需寻找一种可以高效制备酶活性稳定的且可多次重复利用的固定化β-琼胶酶的方法。

发明内容

为提高目前存在的技术问题，本申请人提供了一种高效固定β-琼胶酶的方法。本发明首次采用链霉亲和素和生物素的特异结合固定β-琼胶酶，可以有效提高酶的稳定性，并且实现多次重复使用。

本发明对固定化载体的制备过程进行优化，采用溶剂热法制备磁性纳米粒子，实现一步制备得到氨基化磁性纳米颗粒。

本发明通过基于生物素/链霉亲和素的特异性识别，将链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒作为载体固定化β-琼胶酶，得到了热稳定性增强的可重复使用的固定化β-琼胶酶，并且其酶活得到了一定的增强，相对酶活最高可达135.67％。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种高效固定β-琼胶酶的方法，所述方法为将生物素化的β-琼胶酶与链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒混合孵育。

在一种实施方式中，利用链长经过修饰的生物素对β-琼胶酶进行生物素化。

在一种实施方式中，所述链长经过修饰的生物素包括NHS-生物素、LC-NHS-生物素、LCLC-NHS-生物素、PEG4-NHS-生物素或PEG24-NHS-生物素。

在一种实施方式中，所述生物素化的β-琼胶酶与链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒以(1：2)～(1：10)质量比进行混合。

在一种实施方式中，所述方法中孵育的时间为5～25h。

在一种实施方式中，所述β-琼胶酶的NCBI登录号为ABD81904。

在一种实施方式中，制备所述链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒的步骤包括(a)和(b)：

(a)制备磁性纳米颗粒：将FeCl

(b)链霉亲和素修饰：取2mg三聚氯氰溶解于10mL二恶烷中，接着加入50mg磁性纳米颗粒，搅拌3min，洗涤数次后加入15mL链霉亲和素溶液，混合搅拌得到SA@MNPs。

在一种实施方式中，步骤(a)中，所述FeCl

在一种实施方式中，步骤(b)中，200℃保温时间为6-8h。

本发明还提供一种固定化β-琼胶酶，由所述高效固定化β-琼胶酶的方法制备得到。

本发明提供一种制备琼胶低聚糖的方法，利用所述固定化β-琼胶酶水解琼胶。

在一种实施方式中，琼胶和固定化β-琼胶酶的添加体积比为20:1。

在一种实施方式中，琼胶浓度为1-10mg/mL，固定化β-琼胶酶浓度为0.15-0.25mg/mL。

在一种实施方式中，在pH 5-10、20-60℃下，反应20min。

本发明还提供所述高效固定β-琼胶酶的方法，或所述固定化β-琼胶酶，或所述制备琼胶低聚糖的方法在医药、食品和日用品领域的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明提供的固定β-琼胶酶的方法以磁性纳米粒子作为载体，通过链霉亲和素和生物素的特异结合进行连接，将酶固定在磁性纳米粒子表面，得到的固定化β-琼胶酶的酶活保留率最高可达135.67％，且能有效提高酶的稳定性。

2、本发明制备出的固定化酶能够实现β-琼胶酶的多次重复使用。在最适环境条件下，重复操作7次后，酶活仍保持有原始活性的53％以上。

3、本发明制备的固定化β-琼胶酶比游离酶有更高的稳定性，在pH 5-10.0范围内，固定化酶有更好的pH耐受性；同时，固定化β-琼胶酶具有更好的热稳定性，45℃水浴30min后游离酶的相对酶活为47.41％，固定化酶的相对酶活达到84％以上，60min后游离酶的相对酶活进一步降低至22.66％，固定化酶仍然保留了80％以上的相对酶活，3h后游离酶已经丧失所有酶活，而固定化酶的相对酶活大于46％。

4、本发明制备的固定化β-琼胶酶可以应用于琼胶低聚糖的制备，降解速率快，并且可以多次回收利用，降低了制备成本；同时制备环境温和，对环境友好，产物可控度高，产物主要为新琼二糖。

附图说明

图1为高效固定β-琼胶酶的工艺流程图。

图2为不同连接体得到的固定化酶的酶活保留率。

图3为pH值对酶活性的影响图。

图4为温度对酶活性的影响图。

图5为制备的固定化酶的重复使用性。

图6为在45℃下固定化酶和游离酶的热稳定性图。

图7为固定化酶及游离酶经过酶解反应后的产物图。

图8为在45℃下固定化酶及游离酶的新琼二糖产量图。

具体实施方式

下面结合具体实施方法和附图，对本发明进行更进一步的阐述和说明。

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

本发明中的链长修饰为NHS的生物素、链长修饰为LC-NHS的生物素购买自上海麦克林生化科技有限公司；链长修饰为LCLC-NHS的生物素、链长修饰为PEG4-NHS的生物素和链长修饰为PEG24-NHS的生物素均购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

下述实施例中，E.coli BL21(DE3)/pET28a-Aga50D：参考文献Kim H T,Lee S,LeeD,et al.Overexpression and molecular characterization of Aga50D fromSaccharophagus degradans 2-40:an exo-typeβ-agarase producing neoagarobiose[J].Appl Microbiol Biotechnol,2010,86(1):227-234.本发明在此文献的基础上，将β-琼胶酶Aga50D构建至pET28a，并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，构建得到重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-Aga50D。

下述实施例中，酶活的测定方法：加入1.5mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液，沸水浴中放置5min，迅速冷却后加入蒸馏水定容至10mL后于520nm处测量OD值。定义每mg酶每分钟降解生成1μmol还原糖为一个酶活力单位(U)。

下述实施例中涉及的培养基如下：

培养基均使用ddH

LB液体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L。

LB固体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L、琼脂粉15g/L。

实施例1：

(1)菌株培养：将E.coli BL21(DE3)/pET28a-Aga50D菌株平板划线于LB固体培养基，于37℃培养8h，接着挑取单菌落接入LB活化培养基中，培养得到活化菌种，按1％(v/v)接种量吸取菌种至LB培养基，于37℃恒温摇床培养约2h后加入终浓度1mM的IPTG于16℃诱导12h后，离心收集菌体。用缓冲液重悬菌体，使用超声破碎仪破碎后离心收集上清液，得粗酶液；

(2)蛋白纯化：使用His Trap HP 1mLNi

(3)载体的制备：溶剂热法制备磁性纳米颗粒：将0.1g FeCl

(4)固定化β-琼胶酶：

a)生物素酰化琼胶酶：将链长修饰为NHS的生物素加入β-琼胶酶(1mg/mL)溶液中，使得最终含量为10％(v/v)，混合物在25℃搅拌3h，得生物素化琼胶酶。

b)链霉亲和素修饰磁性纳米颗粒：取2mg三聚氯氰溶解于10mL二恶烷中，接着加入50mg磁性纳米颗粒，两者混合搅拌3min，洗涤数次后加入15mL链霉亲和素溶液，混合搅拌得到SA@MNPs。

c)室温下将生物素化琼胶酶置于SA@MNPs溶液中室温下震荡反应6h得到固定化β-琼胶酶，其中生物素化琼胶酶和SA@MNPs溶液的添加质量比为1:4(图1)。

实施例2：

(1)菌株培养：将E.coli BL21(DE3)/pET28a-Aga50D菌株平板划线于LB固体培养基，于37℃培养8h，接着挑取单菌落接入LB活化培养基中，培养得到活化菌种，按1％(v/v)接种量吸取菌种至LB培养基，于37℃恒温摇床培养约2h后加入IPTG终浓度1mM的IPTG于16℃诱导12h后，离心收集菌体。用缓冲液重悬菌体，使用超声破碎仪破碎后离心收集上清液，得粗酶液；

(2)蛋白纯化：使用His Trap HP 1mLNi

(3)载体的制备：溶剂热法制备磁性纳米颗粒：将0.1gFeCl

(4)固定化β-琼胶酶：

a)生物素酰化琼胶酶：将链长修饰为LC-NHS的生物素加入β-琼胶酶(1mg/mL)溶液中，使得最终含量为30％(v/v)，混合物在25℃搅拌3h，得生物素化琼胶酶。

b)链霉亲和素修饰磁性纳米颗粒：取2mg三聚氯氰溶解于10mL二恶烷中，接着加入50mg磁性纳米颗粒，两者混合搅拌3min，洗涤数次后加入15mL链霉亲和素溶液，混合搅拌得到SA@MNPs。

c)室温下将生物素化琼胶酶置于SA@MNPs溶液中室温下震荡反应10h得到固定化β-琼胶酶，其中生物素化琼胶酶和SA@MNPs溶液的添加质量比为1:4。

实施例3：

(1)菌株培养：将E.coli BL21(DE3)/pET28a-Aga50D菌株平板划线于LB固体培养基，于37℃培养8h，接着挑取单菌落接入LB活化培养基中，培养得到活化菌种，按1％(v/v)接种量吸取菌种至LB培养基，于37℃恒温摇床培养约2h后加入终浓度1mM的IPTG于16℃诱导12h后，离心收集菌体。用缓冲液重悬菌体，使用超声破碎仪破碎后离心收集上清液，得粗酶液；

(2)蛋白纯化：使用His Trap HP 1mLNi

(3)载体的制备：溶剂热法制备磁性纳米颗粒：将0.1gFeCl

(4)固定化β-琼胶酶：

a)生物素酰化琼胶酶：将链长修饰为LCLC-NHS的生物素加入琼胶酶(0.5mg/mL)溶液中，使得最终含量为10％(v/v)，混合物在25℃搅拌3h，得生物素化琼胶酶。

b)链霉亲和素修饰磁性纳米颗粒：取2mg三聚氯氰溶解于10mL二恶烷中，接着加入25mg磁性纳米颗粒，两者混合搅拌3min，洗涤数次后加入15mL链霉亲和素溶液，混合搅拌得到SA@MNPs。

c)室温下将生物素化琼胶酶置于SA@MNPs溶液中室温下震荡反应10h得到固定化β-琼胶酶，其中生物素化琼胶酶和SA@MNPs溶液的添加质量比为1:4。

实施例4

(1)菌株培养：将E.coli BL21(DE3)/pET28a-Aga50D菌株平板划线于LB固体培养基，于37℃培养8h，接着挑取单菌落接入LB活化培养基中，培养得到活化菌种，按1％(v/v)接种量吸取菌种至LB培养基，于37℃恒温摇床培养约2h后加入终浓度1mM的IPTG于16℃诱导12h后，离心收集菌体。用缓冲液重悬菌体，使用超声破碎仪破碎后离心收集上清液，得粗酶液；

(2)蛋白纯化：使用His Trap HP 1mL Ni

(3)载体的制备：溶剂热法制备磁性纳米颗粒：将0.1gFeCl

(4)固定化β-琼胶酶：

a)生物素酰化琼胶酶：将链长修饰为PEG4-NHS的生物素加入琼胶酶(1mg/mL)溶液中，使得最终含量为10％(v/v)，混合物在25℃搅拌3h，得生物素化琼胶酶。

b)链霉亲和素修饰磁性纳米颗粒：取2mg三聚氯氰溶解于10mL二恶烷中，接着加入50mg磁性纳米颗粒，两者混合搅拌3min，洗涤数次后加入15mL链霉亲和素溶液，混合搅拌得到SA@MNPs。

c)室温下将生物素化琼胶酶置于SA@MNPs溶液中室温下震荡反应12h得到固定化β-琼胶酶，其中生物素化琼胶酶和SA@MNPs溶液的添加质量比为1:4。

实施例5

(1)菌株培养：将E.coli BL21(DE3)/pET28a-Aga50D菌株平板划线于LB固体培养基，于37℃培养8h，接着挑取单菌落接入LB活化培养基中，培养得到活化菌种，按1％(v/v)接种量吸取菌种至LB培养基，于37℃恒温摇床培养约2h后加入终浓度1mM的IPTG于16℃诱导12h后，离心收集菌体。用缓冲液重悬菌体，使用超声破碎仪破碎后离心收集上清液，得粗酶液；

(2)蛋白纯化：使用His Trap HP 1mL Ni

(3)载体的制备：溶剂热法制备磁性纳米颗粒：将0.1gFeCl

(4)固定化β-琼胶酶：

a)生物素酰化琼胶酶：将链长修饰为PEG24-NHS的生物素加入琼胶酶(1mg/mL)溶液中，使得最终含量为10％(v/v)，混合物在25℃搅拌3h，得生物素化琼胶酶。

b)链霉亲和素修饰磁性纳米颗粒，取2mg三聚氯氰溶解于10mL二恶烷中，接着加入50mg磁性纳米颗粒，两者混合搅拌3min，洗涤数次后加入15mL链霉亲和素溶液，混合搅拌得到SA@MNPs。

c)室温下将生物素化琼胶酶置于SA@MNPs溶液中室温下震荡反应12h得到固定化β-琼胶酶，其中生物素化琼胶酶和SA@MNPs溶液的添加质量比为1:4。

实施例6

(1)菌株培养：将E.coli BL21(DE3)/pET28a-Aga50D菌株平板划线于LB固体培养基，于37℃培养8h，接着挑取单菌落接入LB活化培养基中，培养得到活化菌种，按1％(v/v)接种量吸取菌种至LB培养基，于37℃恒温摇床培养约2h后加入终浓度1mM的IPTG于16℃诱导12h后，离心收集菌体。用缓冲液重悬菌体，使用超声破碎仪破碎后离心收集上清液；

(2)蛋白纯化：使用His Trap HP 1mL Ni

(3)载体的制备：溶剂热法制备磁性纳米颗粒：将0.1gFeCl

(4)固定化β-琼胶酶：

a)生物素酰化琼胶酶：将链长修饰分别为NHS、LC-NHS、LCLC-NHS、PEG4-NHS、PEG24-NHS的生物素加入琼胶酶(1mg/mL)溶液中，使得最终含量为10％(v/v)，混合物在25℃搅拌3h，得生物素化琼胶酶。

b)接着使用链霉亲和素修饰磁性纳米颗粒，取2mg三聚氯氰溶解于10mL二恶烷中，接着加入50mg磁性纳米颗粒，两者混合搅拌3min，洗涤数次后加入15mL链霉亲和素溶液，混合搅拌得到SA@MNPs。

c)室温下将生物素化琼胶酶置于SA@MNPs溶液中室温下震荡反应12h得到固定化β-琼胶酶，其中生物素化琼胶酶和SA@MNPs溶液的添加质量比为1:4。

将制备的固定化β-琼胶酶与具有相同蛋白含量的游离酶进行酶活测定，获得固定化酶的酶活保留率，结果如图2所示。

结果表明，使用不同生物素连接体的固定化酶最终的酶活保留率存在差异，明显可见链长的增加有利于酶活的保留，其中最长连接链长PEG24表现出最佳的酶活保留率，达到了135.67％。

实施例7

取2mL底物溶液(1％(w/v)琼胶)，加入实施例3制备得到的100μL固定化β-琼胶酶和游离酶，反应20min，测量其酶活。

1、pH值对酶活性的影响：

取2mL底物溶液(1％(w/v)琼胶)，加入实施例3制备得到的100μL固定化β-琼胶酶和游离酶，在pH 5-10的条件下，在30℃下反应20min，测量其酶活。

从图3可以看出，固定化酶和游离酶的最适pH均为7.0，在pH 5-10.0范围内，固定化酶比游离酶有更好的pH耐受性，固定化酶在pH＞8的范围内保持良好的稳定性，其相对酶活明显高于游离酶。

2、温度对酶活性的影响：

取2mL底物溶液(1％(w/v)琼胶)，加入实施例3制备得到的100μL固定化β-琼胶酶和游离酶，在pH 7的条件下，在20-60℃下反应20min，测量其酶活。

从图4可以看出，游离酶及固定化酶的最适反应温度都为30℃，在温度范围大于30℃时，固定化酶相比游离酶的酶活损失程度更小，这表明固定化酶具有更好的耐热性。

3、固定化酶的重复使用性：

取2mL底物溶液(1％(w/v)琼胶)，加入实施例3制备得到的100μL固定化β-琼胶酶和游离酶，在pH 7，30℃条件下反应20min，离心收集固定化酶，再加入到2mL底物溶液(1％(w/v)琼胶)中，循环7次。

从图5和表1可以看出，以第一次使用的酶活为100％，固定化酶重复操作7个循环后，固定化酶仍保持有原始活性的58.56％。这说明此方法固定化后的琼胶酶可以有效进行多次重复使用。

表1

4、在45℃下固定化酶和游离酶的热稳定性：

从图6可以看出，随着45℃水浴时间的增加，游离酶和固定化酶的酶活都逐渐降低，但是固定化β-琼胶酶的酶活损失速率明显小于游离酶。水浴30min后游离酶和固定化酶的相对酶活分别为47.41％和84.85％，60min后游离酶的相对酶活进一步降低至22.66％，固定化酶保留了80.23％的相对酶活，水浴3h后，固定化酶仍然保留了最初酶活的46.39％，而自由酶已丧失所有酶活。

实施例8

利用实施例5的固定化酶进行检测，检测方法同实施例7，结果显示：

1、pH值对酶活性的影响：

从图3可以看出，固定化酶和游离酶的最适pH均为7.0，且性质相似，在pH 9条件下具有比pH 8更高的活性。同时，在pH 5-10.0范围内，固定化酶比自由酶有更好的pH耐受性。

2、温度对酶活性的影响：

从图4可以看出，游离酶及固定化酶的最适反应温度都为30℃，在温度范围大于30℃时，固定化酶相比游离酶的酶活损失程度更小。固定化酶在40℃反应，仍保持有70.69％的相对酶活，而相同条件下，游离酶仅剩47.73％的相对酶活。

3、固定化酶的重复使用性：

从图5和表2可以看出，以第一次使用的酶活为100％，固定化酶重复操作7个循环后，固定化酶仍保持有原始活性的53.64％。这说明此方法固定化后的琼胶酶可以有效进行多次重复使用。

表2

4、在45℃下固定化酶和游离酶的热稳定性：

从附图6可以看出，随着45℃水浴时间的增加，游离琼胶酶和固定化酶的酶活都逐渐降低，但是固定化β-琼胶酶的酶活损失速率明显小于游离酶。水浴30min后游离酶和固定化酶的相对酶活分别为47.41％和88.06％，60min后游离酶的相对酶活进一步降低至22.66％，固定化酶仍保留了88.06％的相对酶活，水浴3h后，固定化酶仍然保留了最初酶活的57.45％，而自由酶已丧失所有酶活。

实施例9

固定化酶及游离酶经过酶解反应后的产物分析：

取蛋白含量相同的实施例5固定化酶和游离酶加入2mLpH7.0底物溶液(1％(w/v)琼胶)进行反应，反应温度为30℃，反应20min，反应结束后吸取上清液，采用阴离子色谱检测分析。从图7可以看出，对照新琼寡糖标准样品，可知游离酶与固定化酶的主要产物均为新琼二糖，酶解产生的产物稳定。

底物溶液在35-40℃易形成凝胶，不利于工业生产利用，因此探究在45℃下，实施例5固定化酶和游离酶水解3h新琼二糖的得率情况，结果见图8。在45℃的情况下，游离酶水解3h后的新琼二糖得率仅为6716.07μM，而固定化酶的新琼二糖得率为12719.15μM，远高于游离酶的得率。固定化酶由于具有更好的耐热性，能显著提高产物得率，因此具有更好的工业利用价值。

对比例1

利用戊二醛直接固定化β-琼胶酶的方法

(1)菌株培养：将E.coli BL21(DE3)/pET28a-Aga50D菌株平板划线于LB固体培养基，于37℃培养8h，接着挑取单菌落接入LB活化培养基中，培养得到活化菌种，按1％(v/v)接种量吸取菌种至LB培养基，于37℃恒温摇床培养约2h后加入终浓度1mM的IPTG于16℃诱导12h后，离心收集菌体。用缓冲液重悬菌体，使用超声破碎仪破碎后离心收集上清液，得粗酶液；

(2)蛋白纯化：使用His Trap HP 1mL Ni

(3)载体的制备：溶剂热法制备磁性纳米颗粒：将0.1gFeCl

(4)固定化β-琼胶酶：

a)将50mg磁性纳米颗粒加入到25mL 1％(v/v)、2％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)或者5％(v/v)的戊二醛溶液中，25搅拌反应12h。反应结束后利用磁场进行分离，用水洗涤三次。

b)将5mL琼胶酶(1mg/mL)溶液倒入已戊二醛活化的磁性纳米颗粒中，两者室温下混合搅拌12h，得到固定化β-琼胶酶。

以游离酶的酶活为100％，制备的固定化β-琼胶酶的酶活保留率结果如表3所示。

表3

结果表明，采用戊二醛直接固定化β-琼胶酶对酶活的影响较大，酶活保留率较使用生物素/链霉亲和素作为中间连接体的固定化酶更低。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。