用于缺血性心脏病治疗的药物及药物组合物

摘要

本发明提供了一种用于缺血性心脏病治疗的药物，其特征在于，该药物为NPM1抑制剂。该药物具体为干扰NPM1表达的反义寡核苷酸，能够降低NPM1表达，促进心脏巨噬细胞向修复表型转化，从而保护心梗后的心功能、减轻心肌纤维化、抑制心肌重构，发挥缺血性心脏病的治疗作用。

说明书

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及一种用在缺血性心脏病的治疗中的药物，以及含有该药物的药物组合物。

背景技术

缺血性心脏病我国目前发病率最高的心血管病之一。其中，心肌梗死(myocardialinfarction,MI)发病率增加是其主要原因。

针对MI，现阶段的治疗方法以早期抗栓、血运重建等为主，虽然能够有效减少患者死亡率，但是，一方面，受限于地域医疗条件、手术的技术难度等因素，我国对MI患者实施早期血运重建的比例并不高；另一方面，在心肌缺血损伤发生后，即使能够实施血运重建治疗，也常常因局部免疫反应的失控而发生难以逆转的心室重构和心力衰竭。因此，探索实施难度更低、更易推广并且能够有效减轻或逆转MI后心力衰竭的新疗法对改善我国国民健康水平有着极为重大的意义。

此外，心肌梗死后巨噬细胞介导的早期炎症过度地激活会对心脏造成进一步的应激性损伤而阻碍组织修复，导致损伤愈合不良、更多的心肌细胞死亡，并扩大梗死范围，这是MI后继发心室不良重塑和心力衰竭的重要原因。所以，能够促进缺血心肌修复、减轻缺血性心脏病后心功能损伤的药物在心肌梗死等缺血性心脏病的治疗中具有重要作用。

发明内容

NPM1编码核仁磷酸蛋白是一种胞内蛋白，可在胞内参与多种关键的生物学过程，包括：核糖体生物发生、中心体复制和DNA损伤修复反应等，还可作为组蛋白的分子伴侣介导组蛋白的表观修饰。已有的研究提示NPM1可作为转录因子NF-κB的分子伴侣促进其对巨噬细胞中TNF-α、IL-1β等炎症因子基因的转录；另有研究也提示NPM1可通过其分子伴侣等作用调节巨噬细胞吞噬、趋化和分泌促炎因子等功能，并影响其介导的免疫反应。

由此，结合本发明的实施例研究，发明人提出，NPM1的抑制剂具有抑制心肌缺血后巨噬细胞介导的早期炎症、促进缺血心肌修复、减轻缺血性心脏病后心功能损伤等方面的作用，存在着可以用在缺血性心脏病治疗中的应用潜力。

本发明构建了一种特异性干扰NPM1基因表达的反义寡核苷酸(ASO-NPM1)，发挥NPM1抑制剂对缺血性心脏病的保护作用。

具体地，本发明提供了一种用于缺血性心脏病治疗的药物，其特征在于，该药物为NPM1抑制剂。

进一步，本发明提供的用于缺血性心脏病治疗的药物，还可以具有这样的技术特征，所述NPM1抑制剂为干扰NPM1表达的反义寡核苷酸。

更进一步，本发明提供的用于缺血性心脏病治疗的药物中，还可以具有这样的技术特征，其中反义寡核苷酸的序列为CCAATTAAAGTAACACTGGC，或ACCACCTGTGGTCTTACGGT。

另外，本发明还提供了一种药物组合物，用于缺血性心脏病治疗，其特征在于，包括如上任一项所述的药物。

进一步，本发明提供的药物组合物还可以包括药学上可接受的载体或辅料，或药学上可接受的载体和辅料的组合。

发明的作用与效果

根据本发明提供的用于缺血性心脏病治疗的药物及组合物，由于该药物具体为干扰NPM1表达的反义寡核苷酸，因此能够降低NPM1表达，在起到缺血性心脏病治疗作用。由于该反义寡核苷酸的序列为CCAATTAAAGTAACACTGGC，或ACCACCTGTGGTCTTACGGT，因此能够有效地起到降低NPM1表达的作用，且其中CCAATTAAAGTAACACTGGC的作用更优于另一个。

与传统的基因干预药物siRNA相比，ASO本身具有更高的稳定性，ASO可直接通过静脉注射给药而无需其它载体(如：腺病毒)即可维持足够的血药浓度和治疗干预作用，这样既避免了载体病毒对人体造成的健康风险，同时也具有方便、易操作的特性。

附图说明

图1是本发明实施例1的M型超声心动图；

图2是本发明实施例1的左心室射血分数曲线图；

图3是本发明实施例2的心肌梗死小鼠的心肌组织染色显微镜照片；

图4是本发明实施例3的巨噬细胞的修复表型标志物水平检测结果图。

具体实施方式

本发明构建了两种可干扰NPM1表达的反义寡核苷酸，名称及具体序列分别如下：

ASO1：CCAATTAAAGTAACACTGGC

ASO2：ACCACCTGTGGTCTTACGGT

其中，ASO1、ASO2由广州锐博生物技术有限公司合成。

下述各实施例中所使用的小鼠为C57品系，雄性，8-10周龄，上海西普尔-必凯实验动物有限公司购得；Vevo-2100小动物超声成像仪的来源为加拿大visualsonic公司；TRIzol试剂盒的来源为Invitrogen公司；SYBR Green RT-PCR试剂盒的来源为TOYOBO公司；ABI QuantStudio6实时定量PCR仪的来源为Applied Biosystems公司。其他未提及来源的试剂和材料的来源均为常规市售，未提及的操作方法参照本领域的常规操作方法。

另外，实施例中mRNA的相对定量使用2

<实施例1>

本实施例考察ASO1对心肌梗死小鼠的心脏结构及心功能水平的影响。

本实施例中，采用C57小鼠10只，分为生理盐水组(记为NS组)和ASO1干扰组(记为ASO组)，每组5只，然后进行如下操作。

本实施例中的心肌梗死模型采用如下方法构建：将成年小鼠置气体麻醉机上吸入1％异氟烷麻醉后，胸部手术部位脱毛；行气管内插管，仰卧位固定在手术平台上，接呼吸机辅助呼吸，同时通过三通管接气体麻醉机维持麻醉状态；置于解剖镜下，准备手术；碘伏消毒，铺上孔巾，剪皮，分离皮下组织与胸壁肌肉后进入胸腔，找到搏动的心脏；用肋骨拉钩撑开肋间隙暴露心脏；用镊子撕开心包膜，镜下可见粉红色左冠状动脉自左心耳下缘发出沿左室前壁走行至心尖部；在左心耳下缘约1mm处结扎血管；可以看到结扎处远端心肌颜色变浅变白；将心脏恢复至原来的解剖位置；松开肋骨拉钩，缝合肋骨与胸部肌肉，以1ml注射器穿刺入胸腔抽出胸腔内气体，缝合皮肤，伤口处用沾有青霉素的棉球涂擦，预防创口感染。

在上述心肌梗死模型构建操作(以下简称心梗操作)后1天、8天分别通过尾静脉注射给药一次，每次100μl，其中NS组给药为生理盐水，ASO组为含10nmol ASO1的生理盐水。ASO1与生理盐水通过如下方法经尾静脉给药：小鼠置入一端开口的管状固定器中，仅将尾巴部分暴露在固定器外，固定器固定于操作台上，通过食指与中指夹紧固定鼠尾，喷洒少量酒精消毒皮肤，并确认尾静脉位置(皮下浅层直线走行，呈暗紫色)，右手执1ml胰岛素注射器轻挑进入皮肤浅层，沿尾静脉路径水平穿刺0.5-1cm，确认已进入尾静脉腔内，缓慢注入100ul ASO1或生理盐水，可见暗紫色血管由近及远变为白色，注射结束后等待10-20s可见白色血管恢复暗紫色，提示药物完全进入血液循环。退针，以无菌棉球按压止血2-3min。

本实施例的检测采用Vevo-2100小动物超声成像仪对各组小鼠心脏结构及心功能水平进行检测分析。具体检测方法为：在心梗操作前、心梗操作后1天、3天、7天、14天时，分别将各组小鼠接气体麻醉机吸入1％异氟烷麻醉后，胸部脱毛备皮，取仰卧位置于检查平台上，并在胸前区涂抹适量耦合剂。将高频超声探头频率调至10MHz，选取标准左心室胸骨旁长轴切面，准确测量小鼠左心室射血分数(Ejective Fraction)。

图1是本发明实施例1的M型超声心动图，图2是本发明实施例1的左心室射血分数折线图。图1及图2中，“pre-MI”表示心梗操作前，“MI-1d”、“MI-3d”、“MI-7d”、“MI-14d”分别表示心梗操作后1天、3天、7天、14天，“NS”表示生理盐水治疗组，“ASO”表示ASO1治疗组，“*”表示P<0.05，提示NS组与ASO组之间的差异有统计学意义。

如图1所示，NS组与ASO组在心梗操作前心室收缩幅度、心腔大小与心室壁厚度均无明显差异，但在心梗操作3-14天时，相对于NS组，可见ASO组的心室收缩幅度更高，心腔扩大不明显且心室壁更厚。提示ASO1治疗可防止心梗后心室结构的不良重构，保护心室收缩功能。

如图2所示，NS组与ASO组在心梗操作前心脏左室射血分数无显著差异，且心梗后1天也无显著差异，说明心梗操作造成两组小鼠的心功能损伤程度基本相同，但在心梗后3天-14天时，NS组小鼠的左心室收缩功能持续下降至接近心梗前的20％，而ASO组下降幅度显著减轻，基本维持在40％以上，说明本发明的AOS1具有保护心梗后心功能及减轻心肌损伤的作用。

<实施例2>

本实施例考察ASO1对心肌梗死小鼠心肌纤维化的影响。

本实施例中，小鼠的分组、心梗操作以及给药方法同实施例1。

本实施例中的心肌梗死模型构建方法同实施例1，ASO1和生理盐水经小鼠尾静脉给药的剂量、时间点同实施例1。心梗操作以及ASO1给药14天后，处死各小鼠，取心肌组织4％多聚甲醛固定，组织脱水、OCT包埋后冰冻切片行masson染色。

图3是本发明实施例2的心肌梗死小鼠的心肌组织染色显微镜照片。

如图3所示，ASO组中，心机梗死后组织纤维化灶的面积较WT组显著降低(图3中箭头所指区域)，表明ASO1可显著减轻心肌梗死后缺血心肌组织纤维化、减小纤维化灶大小，抑制心肌重构。

<实施例3>

本实施例采用转染的方法考察ASO1和ASO2对骨髓巨噬细胞表型的影响。本实施例中，空白组使用ASO-NC进行转染，其中ASO-NC为无效的反义寡核苷酸片段，该产品由广州锐博生物科技有限公司设计并合成，序列为：GGCUCUAGAAAAGCCUAUGC；ASO1组、ASO2组分别使用ASO1、ASO2反义寡核苷酸进行转染。

本实施例中，将C57小鼠作为野生型小鼠，分离培养野生型小鼠骨髓巨噬细胞(以下称BMDM)，用RNA-iMAX为转染介质分别将ASO-NC、ASO1及ASO2转染进入BMDM(转染24h)。另外，对照组不加任何处理。然后，对各组BMDM，利用IL4诱导其向修复表型转化。

IL4诱导转化24小时后，提取细胞RNA，再通过实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)方法对各组巨噬细胞中修复相关标志分子(ARG1、MRC1、CHIL3、RETNLA及TGF-B)的表达进行分析。具体地，各组巨噬细胞的组织总RNA使用TRIzol抽提，qRT-PCR使用SYBR Green RT-PCR试剂盒并在ABI QuantStudio6实时定量PCR仪上完成。

图4是本发明实施例3的巨噬细胞的修复表型标志物水平检测结果图。图4中，各标志物所对应的条形图为四条，从左至右依次为对照组(Control组)、ASO-NC组、ASO1组以及ASO2组。

如图4所示，相比于ASO-NC组，ASO1组、ASO2组中NPM1的表达水平均显著降低，且ASO1较ASO2降低幅度更大。而各修复表型相关标志物的表达水平均显著升高，其中，ARG1、MRC1以及TGF-B尤为明显，且ASO1组所表现出的上升幅度均要高于ASO2。从该结果可以得出，转染ASO1、ASO2可使巨噬细胞的修复表型相关标志物的表达显著升高，提示ASO1、ASO2可促进巨噬细胞向修复表型的转化，进而促进心肌梗死后心脏缺血损伤组织的修复，保护心功能，减轻心脏不良重构。另外，从图4还可以看出，ASO1对NPM1表达水平的降低作用要高于ASO2，且在5个修复表型相关标志物的实验结果中，有4个标志物是ASO1组上升大于ASO2组，所以ASO1的促进作用更优于ASO2。

实施例的作用与效果

根据上述实施例，可以看出，ASO1可显著提升心肌梗死后左心室的射血能力，减轻心肌梗死后缺血心肌组织纤维化、减小纤维化灶面积，抑制心肌重构，其机制主要依赖于ASO1、ASO2具有的促进心脏巨噬细胞向修复表型转化的药理作用。相应地，ASO1或ASO2就能够用于在缺血性心脏病治疗的过程中作为治疗药物应用，例如可以与药学上可接受的载体和/或辅料配合后，对缺血性心脏病患者(例如心肌梗死患者)进行给药。