一种检测细辛属物种DNA条形码的试剂及细辛属物种的荧光检测方法

摘要

本发明提供了一种检测辽细辛DNA条形码的试剂及辽细辛的荧光检测方法。本发明所述试剂包括包括AuNPs修饰的辽细辛特异性上游引物、荧光标记物修饰的辽细辛特异性下游引物，所述辽细辛引物特异性上游引物、荧光标记物修饰的辽细辛特异性下游引物序列分别：5’‑SH‑(CH

说明书

技术领域

本发明属于光谱分析技术领域，尤其是指一种检测细辛属物种DNA条形码的试剂及细辛属物种的荧光检测方法。

背景技术

辽细辛(学名：Asarum heterotropoides F.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.)是马兜铃科，细辛属多年生草本植物。细辛属多数种类主要成分为甲基丁香酚、黄樟醚、细辛酮、沈香酸、大屯细辛酮以及有强心作用的生物碱。马兜铃酸早在2002年就被世界卫生组织(WHO)列入第一类致癌物。近些年来，人们在饮食保健上投入也慢慢增多。中草药剂药丸而造成马兜铃酸中毒的事件频频发生。原料来源不明或成分组成不明的食物会对食品安全带来巨大的风险与隐患。同时细辛属植物作为的中草药入药的部位不同，在市面上贩卖时无法整体整株展现，造成中草药药品混淆，掺假贩卖。因此准确、快速的鉴定食品中的细辛成分十分重要。

近十年来，多种分子生物学技术已应用于鱼类的快速鉴定，例如：DNA 条形码技术(DNA Barcoding)、PCR技术、限制性片段长度多态性技术 (Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA 技术(RandomAmplifiedPolymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性技术(AmplifiedFragment LengthPolymorphism，AFLP)以及基因芯片技术等，但从目前已有报道来看，所有研究只针对马兜铃科物种生物形态学鉴定，成分质谱鉴定。因此建立快速检测方法，DNA条形码荧光检测辽细辛的光谱分析方法满足市场监管，食品安全监管的检测检验需求具有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测细辛属物种DNA条形码的试剂及细辛属物种的荧光检测方法。

本发明的第一个目的在于提供一种检测细辛属物种DNA条形码的试剂，包括AuNPs修饰的辽细辛特异性上游引物、荧光标记物修饰的辽细辛特异性下游引物，

所述辽细辛引物特异性上游引物dd-AH-F、荧光标记物修饰的辽细辛特异性下游引物dd-AH-R序列分别： 5’-SH-(CH2)6-ATTGACCACGCGAACTTGTGA-3’；

5’-荧光标记物-ACCGTCAACAAACCTGATTGCT-3’。

在本发明的一个实施例中，所述辽细辛引物通过细辛属物种通用引物测序筛选得到，其中，细辛属物种通用引物的上、下游引物Asa-F、Asa-R的序列分别为：5’-TATCTCTTTCTTTTTTTCAAAAGG-3’； 5’-ATGGGCTTTTGCCAATGAGCCAATC-3’。

在本发明的一个实施例中，还包括DNA聚合酶、DNA模板、水、缓冲溶液与dNTP。

在本发明的一个实施例中，所述荧光标记物选自Cy5、Cy5.5、Cy3或 ROX。

在本发明的一个实施例中，所述AuNPs修饰的辽细辛特异性上游引物通过以下方法制备得到：将AuNPs与辽细辛的上游引物dd-AH-F溶液混合反应，之后加入氯化钠溶液并反应，得到所述AuNPs修饰的辽细辛特异性上游引物。反应过程中AuNPs和巯基引物通过Au-S键结合，共价结合使得该结构非常稳定，而氯化钠可以老化该反应。

在本发明的一个实施例中，所述AuNPs与辽细辛属特异性上游引物 dd-AH-F的摩尔比为1:300-500。

在本发明的一个实施例中，所述细辛属物种选自单叶细辛、花叶尾花细辛、辽细辛或长毛细辛。

本发明提供的第二个目的在于提供一种检测辽细辛的荧光检测方法，使用所述的试剂进行检测。

在本发明的一个实施例中，包括以下步骤：将AuNPs修饰的辽细辛特异性上游引物、荧光标记物修饰的辽细辛特异性下游引物与含有待测细辛属物种DNA模板溶液混合进行PCR反应扩增，并检测所得产物的荧光光谱值，实现辽细辛的定性或定量检测。

在本发明的一个实施例中，所述定量检测的标准曲线通过以下方法制备得到：将一系列不同浓度的细辛属物种DNA模板进行PCR体系扩增，在激发波长610nm，发射波长670nm，检测所得产物的荧光强度值，得到以细辛属物种DNA模板浓度的对数值为横坐标、以F

在本发明的一个实施例中，所述辽细辛DNA模板的浓度为 0.1×10

在本发明的一个实施例中，所述辽细辛DNA模板的浓度为 0.348×10

在本发明的一个实施例中，所述细辛属物种选自单叶细辛、花叶尾花细辛、辽细辛或长毛细辛。

本发明将DNA条形码技术引入辽细辛DNA检测中。在辽细辛上、下游引物上分别标记AuNPs和荧光染料。当荧光染料与AuNPs的距离在10nm 之内时，荧光染料与AuNPs之间产生荧光共振能量(FRET)效应，即荧光染料(荧光供体)的荧光能量会转移给AuNPs(荧光受体)。当分析物中存在靶向DNA时，在PCR扩增成功之后，AuNPs与荧光染料之间的距离拉近，随着加入DNA模板浓度的不同，AuNPs对荧光染料的荧光强度的淬灭程度不同，从而可以建立荧光强度与辽细辛DNA模板浓度之间的关系，建立标准曲线，实现辽细辛样品的高灵敏检测，将荧光检测技术引入DNA条形码中，显著地提高了检测的准确性和灵敏度。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明提出的一种检测辽细辛的荧光光谱分析方法具有很高的灵敏度和特异性，PCR技术具有特异性强、灵敏度高、简便快速、纯度要求低且产物呈现指数增长等特点，同时利用荧光染料的荧光作为检测信号，大大提高了检测的灵敏度。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是实施例2中制备得到的金粒子AuNPs的TEM图；

图2是实施例2中琼脂糖凝胶电泳表征；

图3是实施例2中检测辽细辛的DNA条形码原理示意图；

图4细辛属物种通用引物特异性验证结果图；

图5是实施例2中存在不同浓度的辽细辛时，荧光传感器的荧光光谱及标准曲线；其中，图中1-6分别代表的浓度为0.348×(10，10

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

1，AuNPs的合成及上游引物的修饰：

①0.01％的氯金酸(HAuCl

②将制备好的1mL 15±2nmAuNPs分别8500g离心10min，弃上清，沉淀重悬在100μL的超纯水中，4℃保藏、待用。取上述制备好的50μLAuNPs 和50μL 10μM的dd-AH-F引物溶液室温反应12h。加入2M氯化钠溶液使得终浓度为50mM，过夜反应。之后将反应溶液分别在8500g离心10min，弃上清，分别用50μL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、备用；

2，辽细辛DNA模板利用翌圣

一、样本预处理：

1).加入400μL裂解液LB和4μL RNaseA(10mg/mL)至1.5mL离心管中，混匀后室温备用。

2).取20mg干重组织辽细辛，在液氮中将组织研磨成粉末，并转移至上述1.5mL的离心管中，涡旋振荡混匀，瞬离收集管壁液体。

3).置于65℃温浴10min，每2-3min颠倒混匀样品2次。

4).加入130μL结合液BD，充分混匀，置于冰上5min。

5).12000rpm离心10min。转移上清至新的1.5mL离心管中。

6).计算上清体积，加入1.5倍体积的去蛋白液PL*，立即吹打混匀。

二、DNA提取：

1).将DNA吸附柱P1套入2mL收集管中，备用。

2).将上述样本预处理液(含沉淀)加入DNA吸附柱P1中，12000rpm 离心1min，弃掉废液。

3).将DNA吸附柱P1放回收集管中，加入600μL漂洗液W*，12000rpm 离心30秒，弃废液。

4).重复一遍步骤3。

5).将DNA吸附柱P1放回收集管，空柱12000rpm室温离心2min，以除去残留的漂洗液W*。

6).将DNA吸附柱P1放入新的1.5mL离心管中，在DNA吸附柱P1 中央加入50-100μL洗脱液，室温放置5min。然后12000rpm离心1min。收集滤液，即为DNA溶液，DNA-20℃长期保存。提取的DNA用赛默飞NanoDrop One超微量紫外分光光度计测量浓度为8.7ng/μL。

3，取辽细辛DNA模板10μL，按10倍梯度稀释至0.348×(10

表1特异性鉴定细辛属物种的通用引物和特异性引物

PCR反应体系和扩增程序：

扩增程序：94℃预变性3min；

98℃变性30s；

58℃退火30s；

68℃延伸10s，35个循环；

68℃再延伸3min；4℃保存，得PCR产物。

实施例2

琼脂糖凝胶电泳表征：用TAE buffer配制2％的琼脂糖凝胶，将上述PCR 产物(阳性对照，0.348×0，0.348×10

实施例3

基于DNA条形码荧光检测辽细辛的分析方法的构建：

将辽细辛DNA模板梯度稀释后0.348×(10

测试例

1，检测方法的特异性研究：

将获得的植物样本单叶细辛、花叶尾花细辛、长毛细辛、大别山马兜铃、西藏马兜铃、黄毛马兜铃、巨花马兜铃、美丽马兜铃、耳叶马兜铃、马兜铃、大叶马蹄香、辽细辛药材、徐长卿药材、白薇药材等用翌圣

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。