用于鉴定鼩鼱属物种的DNA条形码、引物对、试剂盒及方法

摘要

本发明涉及分子鉴定技术领域，具体而言，涉及一种用于鉴定鼩鼱属物种的DNA条形码、引物对、试剂盒及方法。该方法包括：扩增待测鼩鼱样品的Cyt b基因片段并测序；参照本发明所提供的14种DNA条形码进行序列比对，如果所述待测鼩鼱样品的Cyt b基因片段与所述DNA条形码中的任一条同源性在96％以上，即可判断所述待测鼩鼱样品与该DNA条形码同种鼩鼱物种来源。本发明有利于实现我国鼩鼱属14个物种的快速准确鉴定，缩短鉴定时间。

说明书

技术领域

本发明涉及分子鉴定技术领域，具体而言，涉及一种用于鉴定鼩鼱属物种的DNA条形码、引物对、试剂盒及方法。

背景技术

鼩鼱属(Sorex)隶属于鼩形目(Soricomorpha)鼩鼱科(Soricidae)鼩鼱亚科(Soricinae)鼩鼱属在我国分布的有16-18个种。鼩鼱是一类吻部尖长、眼细小、形似鼠的原始哺乳动物，与鼹鼠和刺猬的亲缘关系较近。鼩鼱属一些物种是流行性出血热病毒的携带者，不同的物种携带的流行性出血热病毒不尽相同。在外界环境中和人接触密切。对其物种鉴定是预防和控制流行性出血热的关键。然而，鼩鼱属物种间的外形较为相似，并且我国分布的鼩鼱属物种用于形态学分类的正模标本，没有一个是我国研究工作者采集的，并且这些正模标本都存放在国外的标本馆和博物馆中，导致对比研究十分不方便，因此通过形态学分类要求分类人员和鉴定经验较高。因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。

DNA条形码技术(DNABarcoding)是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之有效的生物鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破以往对经验的过度依赖，能帮助鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演化关系等。因此，若能将DNA条形码技术运用于鼩鼱属的鉴定之中，可以很好的对我国鼩鼱属14个物种进行快速、有效的鉴定。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明提供一种关于我国鼩鼱属14个物种DNA条形码分子鉴定的方法，有利于实现我国鼩鼱属14个物种的快速准确鉴定，缩短鉴定时间。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明一方面涉及一种用于鉴定鼩鼱属物种的DNA条形码，选自SEQ ID NO:1-14所示序列中的一种或多种。

本发明所采用的DNA条形码有特异性好、扩增效率和测序成功率高的优点，有利于鼩鼱属物种的鉴定。

根据本发明的一方面，本发明还涉及用于扩增如上所述的DNA条形码的引物对，其上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16所示。

该引物对在PCR扩增过程中不会形成引物二聚体和非特异扩增，避免非目的产物的出现对鉴定结果的影响，同时扩增效率高，检测信号强。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种鼩鼱属物种鉴定试剂盒，其包含如上所述引物对，优选还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水、上样缓冲液和DNA分子量内标中的一种或多种。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种鼩鼱属物种鉴定方法，包括：

使用如上所述的试剂盒扩增待测鼩鼱样品的Cyt b基因片段并测序；

参照如上所述的DNA条形码进行序列比对，如果所述待测鼩鼱样品的Cyt b基因片段与所述DNA条形码中的任一条同源性在96％以上，即可判断所述待测鼩鼱样品与该DNA条形码同种鼩鼱物种来源。

该方法对技术人员的专业程度及实验室条件要求低，在大部分科研单位都能完成，有利于该鼩鼱属物种鉴定方法的普及与推广。

具体实施方式

本发明一方面涉及一种用于鉴定鼩鼱属物种的DNA条形码，选自SEQ ID NO:1-14所示序列中的一种或多种。

SEQ ID NO:1-14所示序列的DNA条形码依次用于下列鼩鼱种的鉴定：

大鼩鼱Sorex mirabilis、中鼩鼱Sorex caecutiens、远东鼩鼱Sorex isodon、苔原鼩鼱Sorex tundrensis、长爪鼩鼱Sorex unguiculatus、栗齿鼩鼱Sorex daphaenodon、细鼩鼱Sorex gracillimus、扁颅鼩鼱Sorex roboratus、姬鼩鼱Sorex minutissimus、云南鼩鼱Sorex excelsus、小鼩鼱Sorex minutus、背纹鼩鼱Sorex cylindricaud、小背纹鼩鼱Sorex bedfordiae以及天山鼩鼱Sorex asper。

根据本发明的一方面，本发明还涉及用于扩增如上所述的DNA条形码的引物对，其上游引物和下游引物分别如SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16所示。

该引物对在PCR扩增过程中不会形成引物二聚体和非特异扩增，避免非目的产物的出现对鉴定结果的影响，同时扩增效率高，检测信号强。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种鼩鼱属物种鉴定试剂盒，其包含如上所述引物对，优选还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水、上样缓冲液和DNA分子量内标中的一种或多种。

优选的，如上所述的试剂盒，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段；

更优选地，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶；

特别优选地，所述Taq DNA聚合酶为高保真Taq DNA聚合酶。

优选的，如上所述的试剂盒，所述水选自双蒸水或去离子水。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种鼩鼱属物种鉴定方法，包括：

使用如上所述的试剂盒扩增待测鼩鼱样品的Cyt b基因片段并测序；

参照如上所述的DNA条形码进行序列比对，如果所述待测鼩鼱样品的Cyt b基因片段与所述DNA条形码中的任一条同源性在96％以上，即可判断所述待测鼩鼱样品与该DNA条形码同种鼩鼱物种来源。

优选的，如上所述的鼩鼱属物种鉴定方法，当所述DNA条形码对应的种为细鼩鼱Sorex gracillimus时，要求待测样品的Cyt b基因片段与所述DNA条形码中的任一条同源性在96％以上；

当所述DNA条形码对应的种为长爪鼩鼱Sorex unguiculatus或苔原鼩鼱Sorex tundrensis时，要求待测样品的Cyt b基因片段与所述DNA条形码中的任一条同源性在96％以上；

当所述DNA条形码对应的种为大鼩鼱Sorex mirabilis、中鼩鼱Sorex caecutiens、远东鼩鼱Sorex isodon、栗齿鼩鼱Sorex daphaenodon、扁颅鼩鼱Sorex roboratus、姬鼩鼱Sorex minutissimus、云南鼩鼱Sorex excelsus、小鼩鼱Sorex minutus、背纹鼩鼱Sorex cylindricaud、小背纹鼩鼱Sorex bedfordiae或天山鼩鼱Sorex asper时，要求待测样品的Cyt b基因片段与所述DNA条形码中的任一条同源性在98％以上。

由于部分鼩鼱物种分布于国外，与国内的分布是不同的亚种关系，亲缘关系较远，因此同源性阈值有所差别。

同源性阈值的确定可通过对本发明所提供的14种DNA条形码进行比对并提取保守位点，比对分析方法可采用本领域常规软件进行，例如Gblocks 0.91b等，从而得到各DNA条形码的同源性分析结果；再根据同源性分析结果划分阈值。

申请人使用本申请所提供的DNA条形码对211只鼩鼱进行分类检测(其中细鼩鼱16个、扁颅鼩鼱2个、苔原鼩鼱28个、大鼩鼱2个、姬鼩鼱12个、栗齿鼩鼱6个、远东鼩鼱44个、长爪鼩鼱9个、中鼩鼱54个、云南鼩鼱4个、小鼩鼱6个、背纹鼩鼱12个、小背纹鼩鼱12个、天山鼩鼱4个)，并通过物种来源、形态学、生活习性等多种手段进行复验，证明使用DNA条形码的鉴别准确率高达100％。

优选的，如上所述的鼩鼱属物种鉴定方法，使用如上所述的试剂盒扩增待测鼩鼱样品的Cyt b基因片段时，退火温度为57℃-59℃；

更优选的，退火温度为58℃。

优选的，如上所述的鼩鼱属物种鉴定方法，使用如上所述的试剂盒扩增待测鼩鼱样品的Cyt b基因片段时，PCR反应程序为：

更优选的，PCR反应程序为：

优选的，如上所述的鼩鼱属物种鉴定方法，在扩增待测鼩鼱样品的Cyt b基因片段后、测序之前还包括：

用1％-2％琼脂糖电泳检测扩增产物。

优选的，如上所述的鼩鼱属物种鉴定方法，所述待测鼩鼱样品来自待测鼩鼱的血液、唾液、精液、骨骼或毛发。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

本发明的技术方案如下：

首先从采集的鼩鼱属物种组织中提取总DNA，利用一对引物进行PCR扩增Cyt b基因的片段，将扩增产物测序，然后进行序列分析比对，建立各种鼩鼱属物种的序列标准数据库，在比较数据库DNA的基础上，通过分析在特定条件下的聚合酶链式反应的产物结果，从而达到快速，准确鉴定鼩鼱属物种的目的。对需要鉴定的鼩鼱样品，提取其总DNA，在给定的条件下，用设计的特异引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增产物结果，然后测序，根据序列比对可以鉴定出鼩鼱属物种。本发明设计的用于鉴别鼩鼱属物种的分子鉴定方法，采用如下步骤：

1、提取鼩鼱属动物的总DNA按常规动物DNA提取方法或者血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1μg/μl-2μg/μl。

2、扩增DNA片段，进行聚合酶链式反应，即用特异的引物进行扩增，引物对序列为：

L590：SEQ ID NO:15；

H590：SEQ ID NO:16。

3、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用DNAmarker检测PCR片段大小。

4、鉴定结果的判断：若出现明显清晰的400bp左右大小的条带，且无杂带，则可送生物公司测序。

5、将测序结果进行手工校对、序列拼接，如果与所述基因序列SEQ ID NO.x进行同源性分析，如果与所述基因序列SEQ ID NO.x的同源性最高，在96％以上，即可判断所述的待测组织即为鼩鼱属某物种来源。

具体的，当所述DNA条形码对应的种为细鼩鼱时，要求待测样品的Cyt b基因片段与所述DNA条形码中的任一条同源性在96％以上；

当所述DNA条形码对应的种为长爪鼩鼱或苔原鼩鼱时，要求待测样品的Cyt b基因片段与所述DNA条形码中的任一条同源性在96％以上；

当所述DNA条形码对应的种为大鼩鼱、中鼩鼱、远东鼩鼱、栗齿鼩鼱、扁颅鼩鼱、姬鼩鼱、云南鼩鼱、小鼩鼱、背纹鼩鼱、小背纹鼩鼱或天山鼩鼱时，要求待测样品的Cyt b基因片段与所述DNA条形码中的任一条同源性在98％以上。

其中，14种我国鼩鼱属物种的DNA条形码分子鉴定方法采用的是血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒。

所使用的DNA聚合酶为eTaq高保真酶。

进行琼脂糖凝胶电泳分析时使用的为为1％-2％的琼脂糖凝胶电泳。

所述400bp左右大小的条带需要用DNAmaker检测。

所用到的DNA序列拼接软件包括CodonCode Aligner、Sequencher、Genious、DNA star等软件。

与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现对我国鼩鼱属14个物种进行快速、有效的鉴定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 牡丹江师范学院

<120> 用于鉴定鼩鼱属物种的DNA条形码、引物对、试剂盒及方法

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 387

<212> DNA

<213> 大鼩鼱 Sorex mirabilis

<400> 1

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 中鼩鼱 Sorex caecutiens

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 远东鼩鼱 Sorex isodon

<400> 3

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 姬鼩鼱 Sorex minutissimus

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<211> 388

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<213> 云南鼩鼱 Sorex excelsus

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<210> 11

<211> 388

<212> DNA

<213> 小鼩鼱 Sorex minutus

<400> 11

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ttacctgccc catccaatat ttcatcatga tgaaactttg gctccctcct aggtgtctgc 120

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<210> 12

<211> 388

<212> DNA

<213> 背纹鼩鼱 Sorex cylindricaud

<400> 12

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<210> 13

<211> 387

<212> DNA

<213> 小背纹鼩鼱 Sorex bedfordiae

<400> 13

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ggcctttact acggacttac atatatttag aaacatgaaa tattggcgta ctactcttat 360

ttgcagtaat agccactgcc tttatag 387

<210> 14

<211> 388

<212> DNA

<213> 天山鼩鼱 Sorex asper

<400> 14

atgacaaacc tgcgaaaaac ccatccacta ataaaaattg ttaatagttc attcatcgac 60

ctacctgccc cctctaacat ctcatcatga tgaaatttcg gctcccttct aggtgtctgc 120

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<210> 15

<211> 23

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<213> 人工序列

<400> 15

agcactgaaa atgcttagat gag 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> r=g或a 。

<400> 16

ctataaaggc rgtggctatt act 23