检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用

摘要

本发明涉及检测抗膜突蛋白‑IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用，属于诊断试剂盒技术领域。本发明提供了检测抗膜突蛋白‑IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。抗膜突蛋白‑IgG抗体的检测，能够实现血管内皮损伤的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及诊断试剂盒技术领域，具体涉及检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。

背景技术

血液、血管和心脏组成了人体的血液循环系统。血液循环系统中的血液在血管中流动，流经心脏、肺、肝等全身脏器。血管的最里层附着有血管内皮细胞，血管内皮细胞是介于血流和血管壁组织之间的一层单核细胞，可通过自分泌、内分泌、旁分泌三种途径分泌一系列NO、PGI2、ET-1等血管活性物质发挥调节血管紧张性、抗血栓形成、抑制平滑肌细胞增殖及血管壁炎症反应等功能。NO是内皮细胞产生最重要的舒血管因子，由内皮细胞的NO合酶(eNOs)作用于L-精氨酸产生，NO可扩散至血管壁平滑肌细胞激活鸟氨酸环化酶，介导cGMP调控的血管舒张。不仅如此，NO还具有抑制血小板聚集、抑制单核细胞粘附于内皮细胞、抑制平滑肌细胞增殖等作用。然而血管内皮在受到一系列有害因素作用时，内皮细胞释放的舒血管因子减少，缩血管因子增多，打破血管平衡稳态，最终导致一系列心血管事件的发生。血管内皮细胞自身抗体会造成血管内皮细胞损伤，诱发血液循环系统功能障碍，从而导致心脏、肺、肝等脏器的损伤，引发各个脏器相关的疾病，包括肾病综合征。

微小病变病(MCD)是儿童肾病综合征的主要原因，占成人肾病综合征的10～15％。微小病变病患者肾小球在光学显微镜下看起来基本正常，在电子显微镜下可见的唯一组织病理学异常是弥漫性足细胞足突融合消失。因此，MCD被认为是一种原发性足细胞疾病。皮质类固醇治疗后蛋白尿完全缓解是MCD的标志，一般而言进行性肾功能衰竭很少见。然而，MCD会导致严重的并发症。在成人中观察到的与疾病相关的并发症主要包括静脉血栓形成和需要临时透析的严重急性肾损伤。此外，由于MCD的特点是慢性、复发性病程，因此通常需要延长免疫抑制治疗以维持蛋白尿缓解。然而，长期免疫抑制治疗会增加严重感染的风险，并带来恶性肿瘤的长期风险。

目前，我们对MCD的潜在发病机制仍然知之甚少。其中一个观点认为是由免疫细胞产生的循环通透性因子引发了该病。由于原发性局灶节段性肾小球硬化(FSGS)的发病机制与MCD非常相似，因此许多学者认为MCD和FSGS是同一个疾病在不同阶段的表型。基于MCD与非霍奇金淋巴瘤之间的关联、麻疹感染诱导的缓解以及环磷酰胺治疗后的延长缓解，T细胞最早被怀疑是循环通透性因子的来源。然而，近些年利妥昔单抗和其他特异性B细胞消除药物的治疗效果对T细胞来源提出了挑战。值得注意的是，皮质类固醇和利妥昔单抗对足细胞的直接作用也被认为具有治疗效果。我们团队在MCD和FSGS肾病综合征患者体内筛选和鉴定到了许多足细胞自身抗体，从而提供了足细胞损伤、自身免疫和蛋白尿对抗B细胞治疗的反应之间的潜在联系，并据此在国际上首次提出了“自身免疫性足细胞病”(Autoimmunepodocytopathies)的概念，并逐步得到了国内外同行的认可。最近，哈佛医学院团队Watts等人发现，儿童及成人微小病变肾病综合征患者血清中还存在抗Nephrin自身抗体，这为我们的创新理论提供了有力佐证。

尽管观察到的足细胞损伤是MCD的主要经典特征，但疾病机制可能还涉及肾小球血管内皮细胞。早在2000年Futrakul N等报道特发性肾病综合征(INS)病人常伴有肾脏灌流不足。他们使用人内皮细胞株ECV 304，与INS病人血清共孵育，进行内皮细胞毒性试验，结果发现，FSGS病人血清造成的内皮细胞损伤最明显。因此，他们推测肾小球血管内皮细胞损伤可能是造成INS病人肾脏灌流不足的原因。Purohit S等人发现在MCD病人循环系统中有内皮细胞损伤标志物syndecan 1升高，但是不清楚是否同时存在肾小球内皮细胞的损伤。Trachtman H等人在FSGS和MCD病人的肾组织中观察到了IgM与补体成分共沉积，且证实IgM是针对GEC和心磷脂表位的抗体。2022年Bauer C等人发现，MCD病人血清中内皮细胞标志物有升高，同时肾组织病理证实肾小球内皮细胞caveolin-1表达明显上升，进一步将病人血清与体外培养的人肾小球内皮细胞共孵育会显著增加肾小球血管内皮细胞损伤的标志物thrombomodulin的表达，由此证明MCD病人存在肾小球血管内皮细胞的损伤。

尽管如此，至今大家并不清楚造成肾小球内皮细胞损伤的致病因子到底是什么。我们的研究团队通过前期的研究在MCD和FSGS肾病综合征患者体内筛选和鉴定到了一系列的肾小球血管内皮细胞自身抗体。动物实验证实这些肾小球血管内皮细胞自身抗体会引起小鼠肾小球血管内皮细胞严重损伤。体外细胞培养实验也表明这些自身抗体会影响血管内皮细胞的形态和功能。临床研究更是表明这些肾小球血管内皮细胞自身抗体与患者的高凝状态以及不良预后有关。此外，我们的研究结果还提示肾小球血管内皮细胞自身抗体引起的肾小球血管内皮细胞损伤可能是MCD中的特征性足细胞损伤的始动因素，是该病的重要病因之一。由此，我们在国际上首次提出了MCD和FSGS肾病综合征发病的二次打击理论：即，包括自身抗体在内的致病因子首先损伤肾小球血管内皮细胞，之后这些致病因子进一步损伤足细胞，最终引起患者发病。因为从足细胞特殊的解剖位置来看，血液循环系统中的致病因子不可能与之接触，除非肾小球血管内皮细胞的完整性已经受到了损伤。由此可见，我们关于肾小球血管内皮细胞自身抗体的研究成果是一次在肾病综合征发病机制的理论研究方面的突破。但目前仍缺乏高效的对血管内皮损伤进行检测的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。抗膜突蛋白-IgG抗体的检测，能够实现血管内皮损伤的有效检测。

本发明提供了检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。

优选的是，所述检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂包括膜突蛋白或含标签的膜突蛋白重组蛋白或多肽；所述膜突蛋白的NCBI蛋白登录号为BC017293。

优选的是，所述标签包括His标签、硫氧还蛋白、GST标签、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶的SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。

优选的是，当所述标签为His标签时，所述含标签的膜突蛋白重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述血管内皮损伤包括肾小球血管内皮细胞损伤。

本发明还提供了一种检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：上述技术方案所述应用中的检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂、固相载体和标记抗体。

优选的是，所述标记抗体包括酶标记的二抗或化学发光剂标记的二抗或生物素标记的二抗或荧光标记的二抗；所述二抗包括抗人IgG抗体。

优选的是，所述酶标记的二抗包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；所述化学发光剂标记的二抗包括吖啶酯标记抗人IgG抗体或荧光标记抗人IgG抗体；所述生物素标记的二抗包括生物素标记的抗人IgG抗体。

优选的是，所述固相载体包括硝酸纤维素膜、荧光编码微球、磁条芯片、磁微粒或酶标微孔板。

本发明提供了检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。本发明首次在部分肾病综合征患者的体内检测到了一种抗膜突蛋白-IgG抗体，且确定了该自身抗体针对的靶抗原为肾小球血管内皮细胞上膜突蛋白。本发明发现膜突蛋白抗体是一种重要的肾小球血管内皮细胞自身抗体，与MCD和FSGS肾病综合征的发生发展密切相关，且能指导临床的诊疗。抗膜突蛋白-IgG抗体的检测，能够实现血管内皮损伤的检测，具体为研究肾病综合征的分子机制和临床诊疗提供依据。本发明提供的检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂盒既可以定性也可以定量检测肾病综合征患者血清中抗膜突蛋白-IgG抗体，且本发明试剂盒利用人抗标签肽的IgG抗体作为标准品以及结合生物素-亲和素放大系统、磁微粒化学发光免疫分析大大提高了检测的准确性、灵敏度、特异性及检测速度。具体的，与现有技术相比本发明试剂盒的有益之处如下：

1、本发明试剂盒能够实现血管内皮损伤的高效检测，检测到抗膜突蛋白-IgG抗体，则判定存在血管内皮损伤。

2、目前国内外关于肾脏疾病患者有关膜突蛋白、抗膜突蛋白-IgG抗体仅限于分子机制研究，并没有定量检测其在患者血清中水平。本发明首次鉴定了针对膜突蛋白的IgG自身抗体，并针对该膜突蛋白-IgG自身抗体发明了检测试剂盒，填补了国内外空白。利用本发明试剂盒检测298例肾病综合征患者血清中抗膜突蛋白-IgG抗体，结果显示有94例患者抗膜突蛋白-IgG抗体阳性，即抗膜突蛋白-IgG抗体阳性检出率为31.54％。本发明对抗膜突蛋白-IgG抗体进行检测后续可以为研究肾病综合征的分子机制和临床诊疗提供依据。

3、本发明试剂盒涉及固相膜免疫定性分析人血清中抗膜突蛋白-IgG抗体，以人抗标签肽的IgG抗体作为标准品，大大提高了检测准确性。固相膜免疫定性检测操作简单，试剂用量较少，比传统ELISA节约近10倍；另外NC膜吸附能力极强接近100％，微量抗原能够完全吸附固定在NC膜上；吸附抗原或抗体或已有结果的NC膜可长期保存(-20℃可保存半年)，且不影响其活性；另外本发明固相膜免疫定性检测人血清中抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂盒引入生物素-亲和素放大系统，大大提高了检测灵敏度。

4、本发明涉及的磁微粒化学发光免疫分析定量检测人血清中抗膜突蛋白-IgG抗体试剂盒，利用磁微粒为固相载体，其直径仅为1.0μm，这就大大增加了包被表面积，增加了抗原的吸附量，提高了反应速度，也使清洗分离更简便，从而减少污染，降低交叉感染概率。另一方面，采用吖啶酯发光剂直接标记抗人IgG，其化学反应简单、快速、无须催化剂；吖啶酯化学发光为闪光型，其通过起动发光试剂(H

附图说明

图1为本发明提供的肾小球血管内皮细胞上的膜突蛋白是肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原结果图；其中，A：一抗为健康人血清的二维电泳蛋白点；B：一抗为肾病综合征患者血清的二维电泳蛋白点；C：靶抗原膜突蛋白的质谱鉴定；

图2表示Moesin表达条件的优化，其中，泳道M：蛋白marker；泳道PC1：BSA(1μg)；泳道PC2：BSA(2μg)；泳道NC：无诱导的细胞裂解物；泳道1：15℃诱导16h细胞裂解物；泳道2：37℃诱导4h细胞裂解物；泳道NC1：无诱导的细胞裂解物上清液；泳道3：15℃诱导16h细胞裂解物上清液；泳道4：37℃诱导4h细胞裂解物上清液；泳道NC2：无诱导的细胞裂解物沉淀包涵体；泳道5：15℃诱导16h细胞裂解物沉淀包涵体；泳道6：37℃诱导4h细胞裂解物沉淀包涵体；

图3为表达的重组蛋白Moesin的SDS-PAGE鉴定图；

图4为固相膜免疫试剂盒检测肾病综合征患者血清中抗膜突蛋白-IgG抗体；

图5为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒检测抗膜突蛋白-IgG抗体的原理示意图。

图6为抗原蛋白Moesin包被羧基磁微粒示意图；

图7为各类肾病病人中抗膜突蛋白-IgG抗体的检测情况，其中NC：健康儿童；HP：过敏性紫癜；HPN：紫癜性肾炎；KD：川崎病；NS：肾病综合征；

图8为抗膜突蛋白-IgG抗体与血管内皮损伤标志物线性相关。

具体实施方式

本发明提供了检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。膜突蛋白(Moesin)是ezrin-radixin-moesin家族蛋白的成员，其功能是将质膜与基于肌动蛋白的细胞骨架连接起来，调节细胞运动和膜蛋白内化过程，对血管内皮功能至关重要，在调节细胞粘附、迁移和形态发生方面发挥重要作用。血液、血管和心脏组成了人体的血液循环系统。血液循环系统中的血液在血管中流动，流经心脏、肺、肝等全身脏器。血管的最里层附着着血管内皮细胞，血管内皮细胞自身抗体会造成血管内皮细胞损伤，诱发血液循环系统功能障碍，从而导致心脏、肺、肝等脏器的损伤，引发各个脏器相关的疾病，包括肾病综合征。因此，在血液循环系统中检测出血管内皮细胞自身抗体，临床上可以用于提示血管内皮细胞损伤的存在。因为不同脏器的血管内皮细胞都是一样的，因此本发明首次发现血管内皮细胞自身抗体——抗膜突蛋白-IgG抗体，本发明应用能够实现包括肾小球血管内皮在内的全身所有血管内皮损伤的检测。

本发明检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂以膜突蛋白为靶点，进行膜突蛋白自身抗体的检测(即抗膜突蛋白-IgG抗体为检测血管内皮细胞损伤的生物标志物)，所述试剂能够实现血管内皮损伤的高效检测。在本发明中，所述试剂能够与来自组织(肾活检组织)或体液(特别是血液、血浆、血清)中的膜突蛋白自身抗体进行免疫反应。在本发明中，所述检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂优选包括膜突蛋白或含标签的膜突蛋白重组蛋白或多肽；所述膜突蛋白的NCBI蛋白登录号为BC017293。在本发明中，所述标签优选为具有某些生物学或物理功能的标签，特别是N-末端或C-末端；这些标签的存在有利于抗原蛋白纯化，固定，沉淀；所述标签更优选是能够特异性结合配体的序列或结构域，如标签肽，所述标签肽优选选自：His标签、硫氧还蛋白、GST标签、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶的SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。在本发明中，当所述标签为His标签时，所述含标签的膜突蛋白重组蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1所示：MEAEKLAKERQEAEEAKEALLQASRDQKKTQEQLALEMAELTARISQLEMARQKKESEAVEWQQKAQMVQEDLEKTRAELKTAMSTPHVAEPAENEQDEQDENGAEASADLRADAMAKDHHHHHH。

在本发明中，所述血管内皮损伤优选包括肾小球血管内皮细胞损伤。更具体的，本发明所述血管内皮损伤优选包括肾病综合征的血管内皮损伤。在本发明中，所述肾病综合征优选包括微小病变病或原发性局灶节段性肾小球硬化。

本发明还提供了一种检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：上述技术方案所述应用中的检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂、固相载体和标记抗体。

在本发明中，所述检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂(膜突蛋白或含标签的膜突蛋白重组蛋白)优选固定于固相载体上。本发明所述“固定”是指与膜突蛋白抗原蛋白不溶于水的固相载体结合，该固相载体或支持物不溶于水，更优选地通过共价键合，静电相互作用，疏水相互作用、或通过二硫键相互作用，最优选通过一个或多个共价键。固定可以是直接固定方式，例如通过过滤，离心或层析，将固定化的分子与不溶性载体一起从水溶液中分离出来。还包括可逆或不可逆的方式固定膜突蛋白抗原蛋白。例如，抗原蛋白通过可裂解的共价键(如可添加含硫醇的试剂来裂解的二硫键)固定于载体，这种固定是可逆的。另外，如抗原蛋白通过在水性溶液中不会裂解的共价键(通过环氧化物基团与将赖氨酸侧链偶联至亲和柱的胺基团的反应形成的键)固定于载体，则固定是不可逆的。固定还可以是间接方式：如固定对所述抗原蛋白具有特异性亲和力的抗体，然后形成抗原蛋白-抗体复合物以达到固定的效目的。本发明所述的抗原蛋白膜突蛋白固定方法优选为直接包被法：(1)抗原蛋白膜突蛋白通过物理吸附方式或非共价键结合到硝酸纤维素膜或聚苯乙烯微孔板上；(2)带有羧基功能团的磁微粒与抗原蛋白膜突蛋白的氨基结合，抗原蛋白膜突蛋白通过化学偶联方式结合在磁微粒上。在本发明中，所述固相载体优选包括硝酸纤维素膜、荧光编码微球、磁条芯片、磁微粒或酶标微孔板。

本发明优选采用基因重组原核表达方法成功表达并纯化出重组蛋白膜突蛋白，以此作为试剂盒中抗原蛋白，研发出一套适合于检测肾病综合征患者肾小球血管内皮细胞自身抗体抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂盒，包括一种定性或定量分析检测人血清中抗膜突蛋白-IgG抗体的检测试剂盒。

在本发明中，所述膜突蛋白优选表达于细菌(如大肠杆菌)、酵母、昆虫或哺乳动物细胞中。表达得到膜突蛋白后，本发明优选利用Ni柱亲和层析、分子筛层析、离子交换层析、疏水柱纯化等方法对膜突蛋白进行纯化。

在本发明中，所述标记抗体优选包括酶标记的二抗或化学发光剂标记的二抗或生物素标记的二抗或荧光标记的二抗；所述二抗包括抗人IgG抗体。

在本发明中，所述酶标记的二抗优选包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；所述化学发光剂标记的二抗包括吖啶酯标记抗人IgG抗体或荧光标记抗人IgG抗体；所述生物素标记的二抗包括生物素标记的抗人IgG抗体。

在本发明中，所述试剂盒的类型优选包括固相膜免疫试剂盒或磁微粒化学发光免疫分析试剂盒；当所述试剂盒为固相膜免疫试剂盒时，所述试剂盒优选还包括抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、底物显色液、洗涤液、酶工作液、标准品、阳性质控品和阴性质控品；当所述试剂盒为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒时，所述试剂盒优选还包括化学发光预激发液A、化学发光激发液B、标准品和清洁溶液。在本发明中，标准品和阳性质控品优选均为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段、或从病人血清中提取抗膜突蛋白-IgG抗体；所述阴性质控品优选为健康体检者血清。

具体的，当所述试剂盒为固相膜免疫试剂盒时，所述试剂盒中，所述检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂，即抗原优选为重组蛋白膜突蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)；固相载体优选为Satourius CN140硝酸纤维素膜；阳性质控品(标准品)优选为人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)；阴性质控品优选为健康体检者血清；标记抗体优选为生物素标记抗人IgG抗体；酶工作液优选为碱性磷酸酶-链霉亲和素；所述底物显色剂优选为TMB、过氧化氢、AMPPD、4-MUP或BCIP；所述抗原稀释液优选为含有163mM NaCl、1％TritonX-100的1x PBS pH7.4；所述样品稀释缓冲液优选为含有10％BSA的0.01M PBS pH7.4；所述抗体稀释液优选为含有1M D-glucose、2％甘油、0.35％Tween20的0.01M PBS pH7.4；所述洗涤液优选为：含有163mM NaCl、10％甘油、1％TritonX-100的1x PBS pH7.4。

当所述试剂盒为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒时，所述试剂盒中，抗原优选为重组蛋白膜突蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)；固相载体优选为羧基磁珠；标记抗体优选为吖啶酯标记抗人IgG抗体；化学发光预激发液A和化学发光激发液B优选为常规市售产品、标准品优选为不同浓度的抗膜突蛋白-IgG抗体；清洁溶液优选为含有0.15mol/LNaCL和0.05％Tween-20的pH 7.2、25mmol/LTris-HCL溶液。

在本发明中，所述试剂盒的待测样品优选来自全血、血清、血浆、尿液、淋巴液、胸腹水；更优选为哺乳动物(人类)血清。

在本发明中，检测血清中抗膜突蛋白-IgG抗体试剂盒的原理优选为：利用间接法反应原理，首先将膜突蛋白抗原吸附于固相载体作为包被抗原，然后加入阳性质控品或标准品或待检血清样本进行孵育，再加入标记抗体(标记二抗)反应后，若待检血清中含有抗膜突蛋白-IgG抗体，则形成包被抗原膜突蛋白-待检血清抗膜突蛋白-IgG抗体-标记抗人IgG抗体三元复合物，最后利用光显色法、化学发光法、荧光发光法来检测光信号，以达到定性或定量分析人血清中抗膜突蛋白-IgG抗体的目的。

下面结合具体实施例对本发明所述的检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1血管内皮细胞上的Moesin是肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原

本发明通过前期大量临床和分子机制研究，首次发现肾病综合征患者血清IgG水平较高，并证实血管内皮细胞上的Moesin是肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原。因此检测血清中抗Moesin-IgG抗体的存在及其定量水平有助于肾病综合征的早期鉴别、尤其对有相关症状的患者进行筛查是有利的。具体实施如下：

1、血管内皮细胞总蛋白的提取：培养血管内皮细胞株(EAhy926)，用PBS洗涤2～3次，然后用聚焦超声仪(Covaris S220,Gene)在含有30mm Tris-HCl、8m尿素、4％CHAPS和蛋白酶抑制剂(#ab65621；Abcam，1：200稀释)的裂解缓冲液中冰上进行充分裂解，然后将样本置于离心机，12000g，4℃，离心30min。收集上清，即为收集到的血管内皮细胞总蛋白。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定收集到的血管内皮细胞总蛋白浓度。

2、二维电泳：提取血管内皮细胞总蛋白进行二维电泳后转到硝酸纤维素膜上，分别用健康人和肾病综合征病人的血清作为一抗进行孵育，之后加上二抗进行显影，见图1中的A，图1中的B。

3、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析：将步骤(2)显影后进行阳性点的差异分析，选取二维电泳胶上肾病综合征病人强阳性，而健康人阴性或者弱阳性的蛋白点，从凝胶上取下选中的蛋白点，将干燥后的凝胶用胰蛋白酶(0.1μg/μl)进行消化，然后向反应混合物中加入10μl的25mM碳酸氢铵，37℃孵育过夜，然后用三氟乙酸(0.1％)从凝胶中提取肽。用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)质谱仪对提取的肽进行分析，得到肽质量图谱，鉴定为Moesin蛋白，见图1中的C。

实施例2重组Moesin抗原蛋白的表达及纯化

利用基因工程的方法以编码Moesin蛋白的基因为模板，进行PCR扩增，然后构建带有His标签的表达载体进行蛋白表达及优化，优化条件分为：15℃诱导16h的细胞裂解物与37℃诱导4h的细胞裂解物，15℃诱导16h的细胞裂解物上清液与在37℃诱导4h的细胞裂解物上清液，15℃诱导16h的细胞裂解物沉淀包涵体与37℃诱导4h的细胞裂解物沉淀包涵体。结果显示37℃诱导4h的细胞裂解物上清液蛋白表达最优，见图2。表达后的重组蛋白经镍柱亲和层析、离子亲和层析法、疏水柱、分子筛等进行纯化，最后利用SDS-PAGE鉴定重组蛋白Moesin的分子量为14.27KDa，结果见图3。

实施例3

根据抗原Moesin包被浓度(100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL)、各反应时间(15min、30min、45min)和温度(20℃、25℃)、酶标二抗最佳稀释度(1：100、1：500、1：1000、1：1500)等4个因素进行优化，每个因素按2水平重复测定标准阳性血清和标准阴性血清。选择阳性血清的最高发光值(P)和阴性血清的最低发光值(N)的比值(P/N)。重复测定的平均P/N值，经统计处理确定最佳包被条件及二抗的最佳稀释度进行优化，显著提高了标准阳性血清的阳性检出率。通过试验我们得到了本试剂盒最佳抗原包被浓度为300μg/mL、固相膜免疫最佳抗原抗体反应温度为25℃、最佳抗原抗体反应时间30min及最佳生物素标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1：1000。磁微粒化学发光免疫分析最佳抗原抗体反应温度为37℃、最佳抗原抗体反应时间15min及最佳吖啶酯标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1：500。

实施例4用于检测抗Moesin-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的制备

4.1用于检测抗Moesin-IgG的固相膜免疫试剂盒的组成：

1、包被Moesin抗原蛋白的硝酸纤维素膜；

2、标准品：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)；

3、阴性质控品：健康体检者血清；

4、生物素标记的抗人IgG抗体；

5、抗体稀释液；

6、样本稀释液；

7、酶工作液：碱性磷酸酶-链霉亲和素；

8、洗涤液；

9、BCIP显色剂；

10、终止液。

4.2检测步骤如下：

4.2.1封闭，将包被Moesin抗原蛋白的硝酸纤维素膜置于板槽中，加入150μl 3％BSA放于37℃温盒中封闭15min，吸去封闭液后，用洗涤液洗膜2次。

4.2.2血清温育：标准品按一定比例的抗体稀释液稀释，待检血清标本按一定比例的样本稀释液稀释，取50μl稀释的标准品与待检样本加样于反应槽内，同时做阴性对照与阳性对照，注意加样时勿刮碰硝酸纤维素膜表面，每加完一份样本后立即更换一个新的加样管嘴。加完所有样品后，将反应槽置于摇床上，室温(20～25℃)孵育30min。

4.2.3清洗：洗涤液稀释后备用，孵育结束后将反应槽内的液体倾倒掉，用稀释的洗涤液冲洗反应槽，使洗涤液充分的浸没反应槽。重复清洗5次，每次10s，注意冲洗时让液体顺着反应槽流下，避免交叉污染。清洗完后甩干反应槽。

4.2.4二抗工作液温育：用抗体稀释液1：1000稀释生物素标记的抗人IgG抗体，然后在反应槽内加入6滴(300μl)，置于摇床上室温(20～25℃)孵育30min。

4.2.5清洗：过程同步骤3。

4.2.6.显色温育：加200μl碱性磷酸酶-链霉亲和素酶工作液，室温孵育20min，弃去检测板内液体，洗涤液洗5次，在反应槽内加入6滴(300μl)BCIP显色溶液，置于摇床上室温(20～25℃)孵育20min。

4.2.7.终止反应：流水冲洗反应槽，终止反应。

4.2.8.判读结果：取出测试条用电吹风吹干(约5min)或置于37～50℃烘箱内烘干20min以上。进行肉眼定性判定，出现明显棕色斑点者为阳性(见图4)或将膜条置于显影仪上扫描，显影仪自带的分析软件以参考标准品浓度作为纵坐标、仪器读取的灰度值作为横坐标，绘制标准曲线对血清中抗Moesin-IgG水平进行半定量分析。

实施例5用于检测抗Moesin-IgG抗体的化学发光免疫试剂盒的制备

5.1用于检测抗Moesin-IgG的化学发光免疫试剂盒的组成：

1、包被Moesin抗原蛋白的磁微粒溶液，

2、标准品：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)，

3、阴性质控品：健康体检者血清

4、样本稀释液，

5、吖啶酯标记抗人IgG溶液，

6、预激发液，

7、激发液，

8、洗涤液。

5.2检测原理：本试剂盒采用间接法，对人血清中抗Moesin-IgG抗体检测，整个过程包含两步反应：第一步，将磁珠液与稀释样本混合，特异性抗Moesin-IgG抗体结合到磁珠上，洗涤去残留液。第二步，加入吖啶酯标记抗人IgG抗体，形成磁珠-抗原-抗Moesin-IgG抗体-吖啶酯抗体复合物，洗涤去除未结合的残留液后，加入预激发液(H

5.3本试剂盒固相载体为含羧基官能团的磁微粒。

5.4本试剂盒抗原包被方式是羧基磁微粒经过EDC/Sulfo-NHS活化，与抗原(氨基残基)共价结合，形成磁微粒溶液。包被步骤为：

a)400μl0.05M磷酸盐缓冲液中加入40μl磁珠原液，混匀8min后磁铁分离，弃去上清；

b)取200μl2％葡聚糖溶液，加入200μl10mg/mL高碘酸钠发生反应；

c)反应结束后加磷酸盐缓冲液配制的10mg/mL EDC溶液与10mg/mLSulfo-NHS溶液，混匀60min；

d)磁铁分离，弃去上清，取400μl 0.05M磷酸盐缓冲液洗涤磁珠后加入400μl封保液定容保存。

将上述活化后的磁珠弃上清，加入预冷的1ml 20mM MES继续清洗磁珠2次；取200μL 2mg/mL的抗原蛋白Moesin加入到活化好的磁珠中，充分混匀，室温静置反应16h；反应结束后，加入含有0.2％Tween20的pH 7.4PBS缓冲液，重复清洗磁珠2次；然后再加入含有0.2％Tween20、0.2％BSA的pH 7.4PBS缓冲液，至磁珠终浓度为10mg/mL，充分混匀，室温静置反应30min；反应结束后，弃上清，并用含有0.2％Tween20、0.2％BSA的pH 7.4PBS缓冲液重悬磁珠，活化磁珠与抗原蛋白Moesin交联完成，见图6。

5.5吖啶酯标记抗人IgG溶液，步骤为：

a)利用二甲基甲酰胺配制2mg/mL吖啶酯溶液；

b)利用0.2M(pH8.0)碳酸盐缓冲液配制1mg/mL抗人IgG抗体；

c)取摩尔比为4:1的吖啶酯与抗人IgG抗体混匀搅拌，反应40min；

d)加入20μl含有5％赖氨酸的碳酸盐缓冲液30min终止反应；

e)通过脱盐除杂，得到吖啶酯标记抗人IgG溶液。

5.6检测步骤如下：

5.6.1用样本稀释液将样本按一定比例稀释；

5.6.2取50μl稀释后的样本或抗His标签的IgG标准品，加入磁微粒液，37℃反应15min，同时做阴阳性对照；

5.6.3洗涤液洗涤3次；

5.6.4加入吖啶酯标记抗人IgG溶液，37℃反应5min；

5.6.5洗涤液洗涤3次；

5.6.6加预激发液(H

5.6.7通过校准曲线计算浓度测值。

实施例6检测血清抗Moesin-IgG抗体试剂盒的临床应用

6.1受试者纳入从2018年6月到2020年6月诊断出各类肾病的患者，包括298例肾病综合征(NS)、100例过敏性紫癜(HP)、100例紫癜性肾炎(HPN)、100例川崎病(KD)以及同时期100例健康儿童(NC)。血清样本取自各类肾病患者和健康对照组。所有受试者在没有进行免疫抑制治疗之前进行第一次血清样本采集。

6.2各类肾病病人中抗Moesin-IgG抗体的检测情况利用本发明试剂盒检测从2018年6月到2020年6月在诊断出各类肾病的患者血清中抗Moesin-IgG抗体水平，包括298例肾病综合征、100例过敏性紫癜、100例紫癜性肾炎、100例川崎病及同时期100例健康儿童，结果显示部分自身免疫性肾病综合征病人中抗Moesin-IgG抗阳性(有94例患者抗膜突蛋白-IgG抗体阳性，即抗膜突蛋白-IgG抗体阳性检出率为31.54％)，而紫癜性肾炎、过敏性紫癜、川崎病以及健康儿童中抗Moesin-IgG抗体为阴性，见图7。

6.3肾病综合征患者血清抗Moesin-IgG抗体与血管内皮损伤标志物表达量呈线性相关利用本发明试剂盒检测从2018年6月到2020年6月在诊断出肾病综合征患者血清中抗Moesin-IgG抗体表达量，并检测患者血清中血管内皮损伤标志物Plvap的表达量，结果显示肾病综合征病人中抗Moesin-IgG抗体表达量与血管内皮损伤标志物表达量呈线性相关，肾病综合征与血管内皮损伤有关，见图8。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Ala Glu Lys Leu Ala Lys Glu Arg Gln Glu Ala Glu Glu Ala

1 5 10 15

Lys Glu Ala Leu Leu Gln Ala Ser Arg Asp Gln Lys Lys Thr Gln Glu

20 25 30

Gln Leu Ala Leu Glu Met Ala Glu Leu Thr Ala Arg Ile Ser Gln Leu

35 40 45

Glu Met Ala Arg Gln Lys Lys Glu Ser Glu Ala Val Glu Trp Gln Gln

50 55 60

Lys Ala Gln Met Val Gln Glu Asp Leu Glu Lys Thr Arg Ala Glu Leu

65 70 75 80

Lys Thr Ala Met Ser Thr Pro His Val Ala Glu Pro Ala Glu Asn Glu

85 90 95

Gln Asp Glu Gln Asp Glu Asn Gly Ala Glu Ala Ser Ala Asp Leu Arg

100 105 110

Ala Asp Ala Met Ala Lys Asp His His His His His His

115 120 125