检测抗肌球蛋白轻链1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测抗肌球蛋白轻链1‑IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。本发明首次发现针对血管内皮细胞的一种抗Myosin light chain 1的自身抗体。通过检测抗原蛋白Myosin lightchain 1、抗Myosin light chain 1‑IgG抗体能够检测血管内皮损伤，填补了国内外鉴别血管内皮损伤自身抗体的空白。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测抗肌球蛋白轻链1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。

背景技术

血液、血管和心脏组成了人体的血液循环系统。血液循环系统中的血液在血管中流动，流经心脏、肺、肝等全身脏器。血管的最里层附着着血管内皮细胞，血管内皮细胞是介于血流和血管壁组织之间的一层单核细胞，可通过自分泌、内分泌、旁分泌三种途径分泌一系列NO、PGI2、ET-1等血管活性物质发挥调节血管紧张性、抗血栓形成、抑制平滑肌细胞增殖及血管壁炎症反应等功能。NO是内皮细胞产生最重要的舒血管因子，由内皮细胞的NO合酶(eNOs)作用于L-精氨酸产生，NO可扩散至血管壁平滑肌细胞激活鸟氨酸环化酶，介导cGMP调控的血管舒张。不仅如此，NO还具有抑制血小板聚集、抑制单核细胞粘附于内皮细胞、抑制平滑肌细胞增殖等作用。然而血管内皮在受到一系列有害因素作用时，内皮细胞释放的舒血管因子减少，缩血管因子增多，打破血管平衡稳态，最终导致一系列心血管事件的发生。血管内皮细胞自身抗体会造成血管内皮细胞损伤，诱发血液循环系统功能障碍，从而导致心脏、肺、肝等脏器的损伤，引发各个脏器相关的疾病，包括肾病综合征。

肾病综合征(nephrotic syndrom，NS)是目前肾脏疾病中最常见的一种，肾病综合征的患者主要表现为低蛋白血症、大量蛋白尿、高血脂及水肿的临床症状，其中大量蛋白尿和低蛋白血症是肾病综合征诊断必需病症。根据发病原因的不同，肾病综合征包括原发性和继发性两种情况。原发性肾病综合征根据病理类型可以分为微小病变型、系膜增生性型、局灶性节段性肾小球硬化、膜性肾病和系膜毛细血管性肾小球肾炎5种类型。

微小病变病(MCD)是儿童肾病综合征的主要原因，占成人肾病综合征的10～15％。微小病变病患者肾小球在光学显微镜下看起来基本正常，在电子显微镜下可见的唯一组织病理学异常是弥漫性足细胞足突融合消失。因此，MCD被认为是一种原发性足细胞疾病。皮质类固醇治疗后蛋白尿完全缓解是MCD的标志，一般而言进行性肾功能衰竭很少见。MCD会导致严重的并发症，在成人中观察到的与疾病相关的并发症主要包括静脉血栓形成和需要临时透析的严重急性肾损伤。此外，由于MCD的特点是慢性、复发性病程，因此通常需要延长免疫抑制治疗以维持蛋白尿缓解。然而，长期免疫抑制治疗会增加严重感染的风险，并带来恶性肿瘤的长期风险。

原发性局灶节段性肾小球硬化(FSGS)的发病机制与MCD非常相似，许多学者认为MCD和FSGS是同一个疾病在不同阶段的表型。基于MCD与非霍奇金淋巴瘤之间的关联、麻疹感染诱导的缓解以及环磷酰胺治疗后的延长缓解，T细胞最早被怀疑是循环通透性因子的来源。皮质类固醇和利妥昔单抗对足细胞的直接作用也被认为具有治疗效果，并在MCD和FSGS肾病综合征患者体内都存在许多足细胞自身抗体。因此，足细胞损伤、自身免疫和蛋白尿对抗B细胞治疗的反应之间存在潜在联系，并有学者据此在国际上首次提出了“自身免疫性足细胞病”(Autoimmune podocytopathies)的概念，并逐步得到了国内外同行的认可。

尽管观察到的足细胞损伤是MCD的主要经典特征，但疾病机制可能还涉及肾小球血管内皮细胞。早在2000年FutrakulN等报道特发性肾病综合征(INS)病人常伴有肾脏灌流不足。他们使用人内皮细胞株ECV 304，与INS病人血清共孵育，进行内皮细胞毒性试验，结果发现，FSGS病人血清造成的内皮细胞损伤最明显。因此，他们推测肾小球血管内皮细胞损伤可能是造成INS病人肾脏灌流不足的原因。Purohit S等人发现在MCD病人循环系统中有内皮细胞损伤标志物syndecan 1升高，但是不清楚是否同时存在肾小球内皮细胞的损伤。Trachtman H等人在FSGS和MCD病人的肾组织中观察到了IgM与补体成分共沉积，且证实IgM是针对GEC和心磷脂表位的抗体。2022年Bauer C等人发现，MCD病人血清中内皮细胞的标志物表达量升高，同时肾组织病理证实肾小球内皮细胞caveolin-1表达明显上升，将病人血清与体外培养的人肾小球内皮细胞共孵育后会显著增加肾小球血管内皮细胞损伤的标志物thrombomodulin的表达，由此证明MCD病人存在肾小球血管内皮细胞的损伤。

尽管如此，至今对造成肾小球内皮细胞损伤的致病因子并不明确，Myosin lightchain 1在心血管系统中的研究尤为多见，但是并没有关于Myosin light chain 1在血管内皮损伤方面的研究，抗肌球蛋白轻链1(Myosin light chain 1)的自身抗体在血管内皮损伤患者中的存在情况未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供检测抗肌球蛋白轻链1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用，特异性检测血管内皮损伤，提高血管内皮损伤的检测的准确性。

本发明提供了检测抗Myosin light chain 1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。

优选的，所述检测抗Myosin light chain 1-IgG自身抗体的试剂包括Myosinlight chain 1蛋白或含标签的Myosin light chain 1重组蛋白或含标签的Myosin lightchain 1多肽。

优选的，所述标签包括His标签、硫氧还蛋白、GST标签、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶的SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。

优选的，当所述标签为His标签时，所述含标签的Myosin light chain 1重组蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述血管内皮损伤包括肾小球血管内皮细胞损伤。

本发明提供了一种检测抗Myosin light chain 1-IgG自身抗体的试剂盒，包括上述技术方案所述的检测抗Myosin light chain 1-IgG自身抗体的试剂、固相载体和标记抗体。

优选的，所述固相载体包括硝酸纤维素膜、荧光编码微球、磁条芯片、磁微粒和酶标微孔板中的一种或多种。

优选的，所述标记抗体包括酶标记的二抗或化学发光剂标记的二抗或生物素标记的二抗或荧光标记的二抗。

优选的，所述二抗包括抗人IgG抗体。

优选的，所述酶标记的二抗包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；所述化学发光剂标记的二抗包括吖啶酯标记抗人IgG抗体或荧光标记抗人IgG抗体；所述生物素标记的二抗包括生物素标记的抗人IgG抗体。

本发明首次在血管内皮损伤患者，具体为肾病综合征患者的体内检测到了一种抗Myosin light chain 1-IgG自身抗体，且确定了该自身抗体针对的靶抗原为肾小球血管内皮细胞上Myosin light chain 1，即肌球蛋白轻链1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过检测抗Myosin light chain 1的抗体(Myosin light chain 1-IgG)能够检测血管内皮损伤，填补了国内外鉴别血管内皮损伤患者生物标志物的空白，能够特异性检测血管内皮损伤。

本发明还提供了一种检测抗Myosin light chain 1-IgG自身抗体的试剂盒，包括上述技术方案所述的检测抗Myosin light chain 1-IgG自身抗体的试剂、固相载体和标记抗体。本发明首次为血管内皮损伤患者检测自身抗体研发了检测试剂盒，利用本发明试剂盒能够定性和定量分析抗Myosin light chain 1的抗体(Myosin light chain 1-IgG)，操作简便，试剂用量较少，比传统ELISA节约近10倍。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1-1～1-2为肾病综合征患者肾小球血管内皮细胞上的Myosin light chain 1蛋白的鉴定结果，其中图1-1从上到下依次为以健康人血清作为一相关的鉴定抗的显影结果，以肾病综合征病人血清作为一抗的显影结果，图1-2为蛋白抗原Myosin light chain 1的质谱鉴定结果；

图2为重组蛋白Myosin light chain 1(带有His标签的抗原蛋白Myosin lightchain 1)的SDS-PAGE鉴定图；

图3为固相膜免疫试剂盒检测肾病综合征患者血清中抗Myosin light chain 1的抗体(Myosin light chain 1-IgG)结果图；

图4为抗原蛋白Myosin light chain 1包被羧基磁微粒示意图；

图5为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒检测抗Myosin light chain 1-IgG抗体的原理示意图；

图6为各类肾病病人中抗Myosin light chain 1的抗体(Myosin light chain 1-IgG)的检测情况，其中NS：肾病综合征，HSP：过敏性紫癜，HSPN：紫癜性肾炎，KD：川崎病，NC：健康儿童；

图7为抗Myosin light chain 1的抗体(Myosin light chain 1-IgG)与血管内皮损伤标志物线性相关。

具体实施方式

本发明提供了检测抗肌球蛋白轻链1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。

在本发明中，所述检测抗Myosin light chain 1-IgG自身抗体的试剂优选包括Myosin light chain 1蛋白或含标签的Myosin light chain 1重组蛋白或含标签的Myosin light chain 1多肽。本发明所述Myosin light chain 1蛋白的氨基酸序列登录号为BC005318。本发明在具体实施过程中，可以以所述Myosin light chain 1的全部氨基酸序列作为靶抗原，也可以以所述Myosin light chain 1的部分氨基酸序列作为靶抗原，实现制备检测血管内皮损伤产品的目的。

在本发明中，所述标签优选包括His标签、硫氧还蛋白、GST标签、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶的SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。本发明含标签的Myosinlight chain 1优选为融合蛋白，所述标签优选位于Myosin light chain 1的N-末端或C-末端。本发明所述标签是能够特异性结合配体的序列或结构域，在所述Myosin lightchain 1上添加标签肽有利于纯化，固定，沉淀。当所述标签为His标签时，所述含标签的Myosin light chain 1重组蛋白的氨基酸序列优选包括SEQ ID NO.1所示，具体为：

MSFSADQIAEFKEAFLLFDRTGDSKITLSQVGDVLRALGTNPTNAEVRKVLGNPSNEELNAKKIEFEQFLPMMQAISNNKDQATYEDFVEGLRVFDKEGNGTVMGAELRHVLATLGEKMKEEEVEALMAGQEDSNGCINYEAFVKHIMSIHHHHHH。

在本发明中，所述血管内皮损伤优选包括肾小球血管内皮细胞损伤，进一步优选为肾病综合征。用于检测本发明所述血管内皮损伤的样本优选包括组合或体液，进一步优选为全血、血清、血浆、尿液、淋巴液和胸腹水中的一种或多种，更优选为哺乳动物血清。血液、血管和心脏组成了人体的血液循环系统。血液循环系统中的血液在血管中流动，流经心脏、肺、肝等全身脏器。血管的最里层附着着血管内皮细胞，血管内皮细胞自身抗体会造成血管内皮细胞损伤，诱发血液循环系统功能障碍，从而导致心脏、肺、肝等脏器的损伤，引发各个脏器相关的疾病，包括肾病综合征。本发明在具体实施过程中，优选以肾病综合征为例说明检测抗Myosin light chain 1-IgG自身抗体的试剂在检测血管内皮损伤产品中的应用，由于不同脏器的血管内皮细胞都是一样的，因此不能仅将在肾病综合征中的应用理解为本发明的保护范围，本发明应用能够实现包括肾小球血管内皮在内的全身所有血管内皮损伤的检测。

本发明优选采用基因重组原核表达方法获得所述Myosin light chain 1蛋白，具体可通过使Myosin light chain 1在细菌、真菌或哺乳动物中表达，采用Ni柱亲和层析、分子筛层析、离子交换层析或疏水柱进行纯化后获得。本发明所述细菌优选为大肠杆菌，所述真菌优选为酵母菌。本发明首次在血管内皮损伤患者，具体为肾病综合征患者的体内检测到了一种抗Myosin light chain 1-IgG自身抗体，且确定了该自身抗体针对的靶抗原为肾小球血管内皮细胞上Myosin light chain 1，通过检测Myosin light chain 1的抗体(即Myosin light chain 1-IgG)，能够检测血管内皮损伤，填补了国内外鉴别血管内皮损伤患者生物标志物的空白，特异性检测血管内皮损伤。本发明对所述Myosin light chain 1的来源没有严格要求，常规获得即可，例如采用人工合成的方式。

本发明还提供了一种检测抗Myosinlight chain 1-IgG自身抗体的试剂盒，包括上述技术方案所述检测抗Myosin light chain 1-IgG自身抗体的试剂、固相载体和标记抗体。

在本发明中，所述固相载体优选包括硝酸纤维素膜(NC膜)、荧光编码微球、磁条芯片、磁微粒和酶标微孔板中的一种或多种；所述酶标微孔板优选为聚苯乙烯微孔板。本发明在具体实施过程中，所述固相载体能够固定Myosin light chain 1。本发明通过Myosinlight chain 1与不溶于水的固相载体结合实现对的固定。本发明在具体实施过程中，不同类型固相载体与结合方式不同，具体的：当所述固相载体为硝酸纤维素膜(NC膜)时，所述结合的方式为物理吸附。本发明所述NC膜吸附能力极强，接近100％，含有微量的抗原及可以完全吸附固定在NC膜上，吸附抗原或抗体或已有结果的NC膜可长期保存(-20℃可保存半年)，且不影响其活性，并且采用NC膜固定进行定性检测，操作简单，试剂用量较少，比传统ELISA节约近10倍。NC膜为Satourius CN140硝酸纤维素膜。当所述固相载体为磁微粒时，所述固定的方式为化学结合。本发明所述磁微粒带有羧基功能团，能够与Myosinlight chain 1的氨基结合，并且直径小，仅为1.0μm，能够增加包被表面积，增加抗原的吸附量，提高反应速度，也使清洗分离更简便，从而减少污染，降低交叉感染概率。

在本发明中，所述标记抗体优选包括酶标记的二抗或化学发光剂标记的二抗或生物素标记的二抗或荧光标记的二抗；所述二抗包括抗人IgG抗体。本发明所述酶标记的二抗优选包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；所述化学发光剂标记的二抗优选包括吖啶酯标记抗人IgG抗体或荧光标记抗人IgG抗体；所述生物素标记的二抗优选包括生物素标记的抗人IgG抗体。本发明所述吖啶酯化学发光为闪光型，通过起动发光试剂(H

在本发明中，当所述固相载体为硝酸纤维素膜(NC膜)时，所述标记二抗优选为生物素标记的IgG抗体；当所述固相载体为磁微粒时，所述标记二抗优选为吖啶酯标记的IgG抗体。本发明在具体实施过程中固相载体与标记二抗配合使用，能够进一步提高检测的灵敏性，便于快速检测。

在本发明中，所述试剂盒还优选包括标准品和阳性质控品；所述标准品和阳性质控品优选分别包括重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段，或从病人血清中提取的抗Myosin light chain 1-IgG抗体。本发明所述标签肽优选包括His标签、硫氧还蛋白标签、GST标签、麦芽糖结合蛋白标签、SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签，进一步优选为His标签。本发明在具体实施过程中，所述标准品和阳性质控品带有的标签肽优选相同，进一步优选与Myosin light chain1带有的标签肽相同。本发明以重组人抗标签肽免疫球蛋白G(重组人抗标签肽的IgG抗体)作为标准品，能够提高检测准确性。本发明对所述重组人抗标签肽的IgG抗体没有严格要求，采用常规方式将重组人IgG和标签肽结合即可，例如采用基因工程技术。

在本发明中，所述阴性质控品优选包括健康者血清。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括底物显色剂，所述底物显色剂优选包括TMB、过氧化氢、AMPPD、4-MUP或BCIP。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括抗原稀释液，所述抗原稀释液优选为NaCl和TritonX-100的1×PBS溶液。本发明所述NaCl的浓度优选为163mM NaCl，所述TritonX-100的体积百分含量优选为1％；本发明用于溶解NaCl和TritonX-100的1×PBS的pH优选为7.4。

在本发明中，所述试剂盒还优选包括样品稀释缓冲液，所述样品稀释缓冲液优选为BSA的PBS溶液。本发明所述BSA的体积百分含量优选为1％；本发明用于溶解所述BSA的PBS的浓度优选为0.01M，pH优选为7.4。

在本发明中，所述试剂盒还优选包括抗体稀释液，所述抗体稀释液优选为D-glucose、甘油和Tween20的PBS溶液。本发明所述D-glucose的浓度优选为1M；所述甘油的体积百分含量优选为2％；所述Tween20的体积百分含量优选为0.35％；本发明用于溶解所述D-glucose、甘油和Tween20的PBS的浓度优选为0.01M，pH优选为7.4。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括洗涤液，所述洗涤液优选为NaCl、甘油和TritonX-100的1×PBS溶液。本发明所述NaCl的浓度优选为163mM NaCl，所述甘油的体积百分含量优选为10％，所述TritonX-100的体积百分含量优选为1％；本发明用于溶解所述NaCl、甘油和TritonX-100的1×PBS的pH优选为7.4。

在本发明中，所述试剂盒还优选还包括终止液，所述终止液优选为2M硫酸。

本发明采用基因重组原核表达方法成功表达并纯化出Myosin light chain 1，以此作为试剂盒中，研发出一套适合于检测血管内皮损伤患者肾小球血管内皮细胞自身抗体抗Myosin light chain 1-IgG抗体的试剂盒。本发明所述试剂盒将Myosin light chain 1吸附于固相载体作为包被抗原，然后加入待检样本进行孵育，再加入标记二抗反应后，若待检血清中含有抗Myosin light chain 1-IgG抗体，则形成包被抗原Myosin light chain1-待检血清Myosin light chain 1-IgG-标记二抗(抗人IgG抗体)三元复合物，最后利用光显色法、化学发光法或荧光发光法来检测光信号，以达到定性或定量分析样本中抗Myosinlight chain 1-IgG抗体的目的，从而检测血管内皮损伤。本发明所述试剂盒具有诊断和筛查作用，可用于血管内皮损伤的筛查和诊断。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

蛋白抗原Myosin light chain 1的鉴定：

(1)血管内皮细胞总蛋白的提取：培养血管内皮细胞株EAhy926，用PBS洗涤2-3次，使用聚焦超声仪(Covaris S220，Gene)，将培养好的血管内皮细胞株EAhy926放在含有30mmTris-HCl、8m尿素、4％CHAPS和蛋白酶抑制剂(#ab65621；Abcam，1：200稀释)的裂解缓冲液中，冰上裂解后，将样本置于离心机，12000g，4℃，离心30min。收集上清，即为收集到的血管内皮细胞总蛋白。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定收集到的血管内皮细胞总蛋白浓度。

(2)二维电泳：提取血管内皮细胞总蛋白进行二维电泳后转到硝酸纤维素膜上，分别用健康人和肾病综合征病人的血清作为一抗进行孵育，之后加上二抗进行显影，结果见图1-1，其中图1-1从上到下依次是一抗为健康人血清的二维电泳蛋白点；一抗为肾病综合征患者血清的二维电泳蛋白点。

(3)基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析：根据步骤(3)显影结果，对显影点进行差异分析，具体的，根据步骤(3)显影结果，选取肾病综合征病人强阳性，而健康人阴性或者弱阳性的显影点，并找到二维电泳胶上与显影点对应的蛋白点，从凝胶上取下选中的蛋白点，将干燥后的凝胶蛋白点用胰蛋白酶(0.1μg/μL)进行消化，然后向消化产物中加入10μL的25mM碳酸氢铵，37℃孵育过夜，然后用三氟乙酸(0.1％)从凝胶中提取肽，用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)质谱仪对提取的肽进行分析，得到肽质量图谱，鉴定为Myosin light chain 1蛋白，具体见图1-2。

实施例2

重组抗原蛋白Myosin light chain 1表达及纯化

(1)利用基因工程的方法以编码Myosin light chain 1蛋白的基因(Myosinlight chain 1蛋白登录号BC005318)为模板，进行PCR扩增，然后构建表达载体进行蛋白表达。本发明构建表达载体进行蛋白表达时，在Myosin light chain 1蛋白上添加His标签的标签肽，添加后表达的带有His标签的Myosin light chain1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，具体为MSFSADQIAEFKEAFLLFDRTGDSKITLSQVGDVLRALGTNPTNAEVRKVLGNPSNEELNAKKIEFEQFLPMMQAISNNKDQATYEDFVEGLRVFDKEGNGTVMGAELRHVLATLGEKMKEEEVEALMAGQEDSNGCINYEAFVKHIMSIHHHHHH；

(2)表达的重组蛋白依次经镍柱亲和层析、离子亲和层析法、疏水柱、分子筛等进行纯化，最后利用SDS-PAGE鉴定重组蛋白Myosin light chain 1的分子量为45KDa，具体如图2，其中图2泳道A为细胞裂解物的上清液，在15℃下诱导16小时；泳道B为细胞裂解物的上清液，在37℃下诱导4小时。

实施例3

试剂盒反应条件的优化

根据抗原Myosin light chain 1包被浓度(50μg、100μg、200μg、400μg四个包被浓度)、各反应时间(15min、30min、45min)和温度(25℃、37℃)、酶标二抗最佳稀释度(1:100、1:500、1:1000、1:1500四个稀释度)等4个因素选择正交表，每个因素按2水平重复测定标准阳性血清和标准阴性血清，选择阳性血清的最高光信号值(P)和阴性血清的最低光信号值(N)的比值(P/N)。通过正交设计得到了本试剂盒最佳抗原Myosin light chain 1包被浓度为400μg/ml、固相膜免疫检测抗Myosin light chain 1-IgG抗体试剂盒最佳抗原抗体反应温度为25℃、最佳抗原抗体反应时间30min及最佳生物素标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1：500；磁微粒化学发光免疫分析检测抗Myosin light chain1-IgG抗体试剂盒最佳抗原抗体反应温度为37℃、最佳抗原抗体反应时间15min及最佳吖啶酯标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1：500。

实施例4

用于检测抗Myosinlight chain 1-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的制备

4.1用于检测抗Myosin light chain 1-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的组成：

(1)抗原：重组蛋白Myosin light chain 1

(2)固相载体：Satourius CN140硝酸纤维素膜

(3)阳性质控品(标准品)：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)

(4)阴性质控品：健康体检者血清

(5)标记抗体：生物素标记抗人IgG抗体

(6)抗原稀释液：含有163mM NaCl和1％TritonX-100的pH为7.4的1×PBS溶液

(7)样品稀释缓冲液：含有10％BSA的pH为7.4的和0.01M PBS溶液

(8)抗体稀释液：含有1M D-glucose、2％甘油和0.35％Tween20的pH为7.4的0.01MPBS溶液

(9)洗涤液：含有163mMNaCl、10％甘油和1％TritonX-100的pH为7.4的1×PBS溶液

(10)底物显色液：碱性磷酸酶-链霉亲和素，BCIP显色液

(11)终止液为：2M硫酸。

4.2用于检测抗Myosin light chain 1-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的检测步骤如下：

4.2.1包被、封闭：将8μL浓度为400μg/ml的Myosin light chain 1抗原直接点于硝酸纤维素膜上置37℃孵育箱中干燥30min，将硝酸纤维素膜置于检测板中，加入200μL5％BSA于37℃温盒中封闭30min，弃去封闭液后用洗涤液洗2次；

4.2.2抗原孵育：向检测板内加入10μL用稀释液稀释的抗体标准品或待检血清，同时做阴性对照、阳性对照，25℃孵育30min，每个样品设置3个平行孔；

4.2.3二抗孵育：弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，加入20μL 500倍稀释的生物素标记抗人IgG抗体，25℃孵育30min；

4.2.4显色：弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，加500μL碱性磷酸酶-链霉亲和素，室温孵育20min，弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，然后加入BCIP显色液，室温反应20min，用流水冲洗检测板，终止酶反应。取出测试硝酸纤维素膜条用吹风机吹干膜条，用比色卡肉眼定性判定，出现明显棕色斑点者为阳性，具体如图3，或将膜条置于显影仪上扫描，显影仪自带的分析软件以参考标准品浓度作为纵坐标、仪器读取的灰度值作为横坐标，绘制标准曲线对血清中抗Myosin light chain 1-IgG抗体水平进行半定量分析。

实施例5

用于检测抗Myosin light chain 1-IgG抗体的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒的制备

5.1抗Myosin light chain 1-IgG抗体化学发光检测试剂盒的组成：

(1)吖啶酯标记的抗人IgG；

(2)与Myosin light chain 1抗原偶联的羧基磁珠；

(3)化学发光预激发液A(H

(4)抗Myosin light chain 1-IgG抗体系列标准溶液，标准浓度：0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、20.0μg/ml，缓冲液为含0.5mol/L的Tris-HCL5.0％BSA和0.1～0.5％PC300；

(5)清洁溶液，特别是含有0.15mol/LNaCL和0.05％Tween-20的pH 7.2、25mmol/LTris-HCl溶液。

5.2磁珠偶联抗原的制备

按照图4步骤制备磁珠偶联抗原，具体的：

(1)取1mg羧基磁性颗粒于0.5mL离心管中，加入一定量的0.1mol/L MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5min，使磁性颗粒从液体，并丢弃上清液。洗涤3次，然后加入一定量的MES(pH5.0)缓冲液并涡旋；

(2)加入18μL(18μg)Myosin light chain 1抗原，涡旋，旋转反应管，室温孵育30min；

(3)加入10μL 10mg/mL偶联试剂EDC涡旋，旋转反应管，室温孵育2h；

(4)去除上清液，加入200μL洗涤缓冲液(TBS+0.05％Tween-20)洗涤3次；

(5)用含1％BSA的缓冲液封闭，重复4次，每次10min，得磁性颗粒悬浮液，储存在2～8℃。

5.3吖啶酯标记抗体的制备

(1)将一定量的抗人IgG抗体放入透析袋中，将透析袋放入不少于1L的标记缓冲液进行透析，期间至少更换3次缓冲液，最后一次透析过夜，标记缓冲液为Na

(2)称取1.7mg吖啶酯NSP-DMAE-NHS溶于447μL无水二甲基甲酰胺DMF中，形成6.5mmol/LNSP-DMAE-NHS DMF溶液；

(3)将透析后的抗体溶液置于500μL离心管中，加入一定量的6.5mmol/LNSP-DMAE-NHS DMF溶液，吖啶酯与抗体的摩尔比为7.4：1，加入200μL标记缓冲液、室温反应45min，加入10μL赖氨酸10μL，继续反应15min终止标记反应；

(4)通过Sephadex G-50柱(1×25cm)将标记物NSP-DMAE-NHS-Ab与游离的NSP-DMAE-NHS分离，用含纯化缓冲液pH为6.3和浓度为0.1mol/L；

(5)分离过程中，用色谱仪检测蛋白质峰，分别测定流出液的化学发光强度和430nm处的吸光度；

(6)收集高光度、高吸光度的洗脱液，加入1％BSA(体积)，冰上保存。

5.4样品制备

使用样品稀释缓冲液将样本按一定比例稀释标准浓度，稀释后的浓度为0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、20.0μg/ml。

5.5用于检测抗Myosin light chain 1-IgG抗体的化学发光法试剂盒的检测步骤如下：

(1)100μL待测样品、150μL偶联磁粉悬液、150μL吖啶酯标记二抗依次加入反应管中，摇匀混合，37℃保温15min；

(2)隔离洗涤5次；

(3)充分振摇洗涤后的反应容器，使磁性颗粒均匀分散；

(4)加入100μL化学发光预激发液A，随后加入100μL化学发光激发液B，测定其相对发光强度。样品中抗Myosin light chain 1-IgG抗体的含量与其发光强度成正比。

实施例6

检测血清抗Myosin light chain 1-IgG抗体试剂盒的临床应用

6.1受试者纳入从2018年6月到2020年6月诊断出各类肾病的患者，包括298例肾病综合征(NS)、100例过敏性紫癜(HP)、100例紫癜性肾炎(HPN)、100例川崎病(KD)、同时期100例健康儿童(NC)。血清样本取自各类肾病患者和健康对照组。所有受试者在没有进行免疫抑制治疗之前进行第一次血清样本采集。

6.2各类肾病病人中抗Myosin light chain 1-IgG抗体的检测情况

利用本发明实施例5试剂盒检测从2018年6月到2020年6月在诊断出各类肾病的患者血清中抗Myosin light chain 1-IgG抗体水平，包括298例肾病综合征、100例过敏性紫癜、100例紫癜性肾炎、100例川崎病及同时期100例健康儿童，结果如图6所示。

从图6可以看出，肾病综合征病人中抗Myosin light chain 1-IgG抗体为阳性，而紫癜性肾炎、过敏性紫癜、川崎病以及健康儿童中抗Myosin light chain 1-IgG抗体为阴性。Myosin light chain 1-IgG抗体在肾病综合征中的阳性检出率为42.28％。

6.3肾病综合征患者血清抗Myosin light chain 1-IgG抗体与血管内皮损伤标志物表达量呈线性相关

利用本发明实施例5试剂盒检测从2018年6月到2020年6月在诊断出肾病综合征患者血清中抗Myosin light chain 1-IgG抗体表达量，并检测患者血清中血管内皮损伤标志物Plvap的表达量，结果如图7所示。根据图7可以看出，肾病综合征病人中抗Myosin lightchain 1的抗体(Myosin light chain 1-IgG)表达量与血管内皮损伤标志物表达量呈线性相关，肾病综合征与血管内皮损伤有关。

本发明首次在肾病综合征患者的体内检测到了一种抗Myosin light chain1-IgG自身抗体，并为肾病综合征患者检测自身抗体研发了检测试剂盒，利用本发明试剂盒能够定性和定量分析抗Myosin light chain 1的IgG抗体，操作简便，试剂用量较少，比传统ELISA节约近10倍，能够特异性检测肾病综合征。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 检测抗肌球蛋白轻链1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Phe Ser Ala Asp Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Leu

1 5 10 15

Leu Phe Asp Arg Thr Gly Asp Ser Lys Ile Thr Leu Ser Gln Val Gly

20 25 30

Asp Val Leu Arg Ala Leu Gly Thr Asn Pro Thr Asn Ala Glu Val Arg

35 40 45

Lys Val Leu Gly Asn Pro Ser Asn Glu Glu Leu Asn Ala Lys Lys Ile

50 55 60

Glu Phe Glu Gln Phe Leu Pro Met Met Gln Ala Ile Ser Asn Asn Lys

65 70 75 80

Asp Gln Ala Thr Tyr Glu Asp Phe Val Glu Gly Leu Arg Val Phe Asp

85 90 95

Lys Glu Gly Asn Gly Thr Val Met Gly Ala Glu Leu Arg His Val Leu

100 105 110

Ala Thr Leu Gly Glu Lys Met Lys Glu Glu Glu Val Glu Ala Leu Met

115 120 125

Ala Gly Gln Glu Asp Ser Asn Gly Cys Ile Asn Tyr Glu Ala Phe Val

130 135 140

Lys His Ile Met Ser Ile His His His His His His

145 150 155